CN104569208A - 一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，该方法属于分析技术领域，该方法通过加入2-氯吡啶使得丝氨酸衍生化，分别配制衍生化后的丝氨酸标准品溶液和丝氨酸标样品溶液，采用高效液相色谱分别对样品溶液和标准品溶液进行检测，检测的顺序是按标准品、试样、标准品的顺序依次进行检测，该方法可快速、准确的对丝氨酸样品进行定量分析，可用于反应过程的监控。具有衍生试剂易得、检测结果准确和方法可靠的特点。

Description

一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种成分分析的技术领域，特别涉及一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法。

背景技术

丝氨酸是一种非必需氨基酸，其化学名称为：2-氨基-3-羟基丙酸，分子式为C₃H₇NO₃，分子量为105.09，结构式如下：

由于丝氨酸在紫外区无吸收，用液相色谱检测需配备蒸发光散射检测器或质谱检测器，无法直接用常用的紫外检测器进行检测。国内外相关文献已报道的检测方法有：丝氨酸与茚三酮显色分光光度法、毛细管电泳法、二硝基苯衍生法和荧光检测法等。

发明内容

本发明目的在于提供一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，该方法准确度高、精密度好、衍生试剂易得，特别适合反应过程的质量控制。

本发明目的可以采用如下技术方案来实现：

一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，该方法包括以下步骤：

1)丝氨酸标准品溶液的配制：将丝氨酸标准品加入流动相溶解后，再加入2-氯吡啶，混匀，于70～80℃条件下静置保温30～40min使丝氨酸标准品充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释得到0.5g/l的丝氨酸标准品溶液；

样品溶液的配制：将待测样品加入流动相溶解后，再加入2-氯吡啶，混匀，于70～80℃条件下静置保温30～40min使待测样品充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释得到0.5g/l样品溶液；

其中，流动相为体积比为30：70的乙腈与水的混合溶液，该溶液pH值为2.0～2.5；

2)采用高效液相色谱对标准品溶液和样品溶液进行检测，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：VP-ODS，5μm，4.6×150mm不锈钢柱，

流动相组成：乙腈与水的体积比为30：70，磷酸调节流动相pH至2.0～2.5，

流动相流速：1.0ml/min，

柱室温度：35℃，

检测波长：254～270nm，

进样量：25μl。

所述的检测顺序是按标准品、试样、试样、标准品依次进行。

所述的2-氯吡啶与丝氨酸的摩尔比大于1，优选2-氯吡啶与丝氨酸的摩尔比为50～55：1。

所述的磷酸溶液的浓度为10％～15％。

所述的检测器为紫外检测器，检测波长为268nm。

为了达到好的检测效果和准确度，开启仪器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后连续注入数针标准品，计算各针相对响应值，达到相邻两针响应值变化小于1.5％时再进行依次进样，这样可以有效的降低由于仪器开机后的不稳定而造成的误差，提高最终检测结果的准确度。

有益效果：

本发明方法采用本公司产品2-氯吡啶为衍生试剂，对丝氨酸进行衍生化，紫外检测器为高效液相色谱的检测器。本发明经实践认证，可快速、准确的对丝氨酸样品进行定量分析，可用于反应过程的监控。具有衍生试剂易得、检测结果准确和方法可靠的特点。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

1、仪器与试剂

仪器：岛津公司的LC-10液相色谱仪

试剂：标准品丝氨酸，含量99.2％，自制(江苏中邦制药有限公司)；衍生试剂2-氯吡啶，自制(江苏中邦制药有限公司)

2、色谱条件

色谱柱：VP-ODS，5μm，4.6×150mm不锈钢柱，

柱室温度：35℃，

进样体积：25μl，

流动相流速：1.0ml/min，

检测器为紫外检测器，检测波长为268nm，

流动相组成：乙腈与水的体积比为30：70，以10％磷酸调节流动相pH至2.0，混匀后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，过滤后的溶液超声15min。

实施例1

检测样品中丝氨酸的含量

样品浓度的计算：通过比较色谱图中样品吡啶衍生物溶液的丝氨酸响应值与标准品吡啶衍生物溶液的响应值，换算得到被测样品中丝氨酸的含量。分别对色谱图中标准品和试样的丝氨酸吡啶衍生物的峰面积进行平均，得其峰面积平均值。按式1对样品中丝氨酸的质量分数进行计算：

$w\%=\frac{m_1\×A_2\×P}{m_2\×A_1}\×100\%$

式1

式中：m₁:标准品的称样量，g，

m₂:样品的称样量，g，

A₁：标准品中丝氨酸的峰面积的平均值，

A₂：样品中丝氨酸的峰面积的平均值，

P:标准品中丝氨酸的质量分数。

标准品丝氨酸溶液和待测样品溶液的配制：

分别准确称取丝氨酸标准品0.0526g(0.0005mol)，待测样品0.0550g，置于2个100ml容量瓶中，各加入流动相进行溶解，溶解后加入2-氯吡啶2.5ml(0.026mol)，超声振荡使充分混匀，70℃保温30min充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释至100ml刻度处，得到标准溶液备用，得到样品溶液待测。

测试与数据处理

按标准品、试样、试样、标准品的顺序依次进样，得数据(见表1)：

表1丝氨酸HPLC检测结果

按式1计算可得样品中丝氨酸的质量分数为90.43％

为验证上述发明所述方法的可行性和准确性，进行了如下验证试验：

试验例1

方法重现性试验

标准品溶液配制：准确称取丝氨酸标准品0.0509g，置于100ml容量瓶中，加入流动相进行溶解，溶解后加入2-氯吡啶2.5ml，超声振荡使丝氨酸标准品充分混匀，70℃保温30min充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释至100ml刻度处，得到标准品溶液备用。

样品溶液配制：称取待测样品约0.05g(精确至0.0002g)6份，分别置于容积为100ml的容量瓶中，加流动相溶解，溶解后的样品加入2-氯吡啶2.5ml，超声振荡使充分混匀，70℃保温30min充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温后，用流动相稀释至100ml刻度处，得到样品溶液待测。

测试与数据处理

在268nm波长下检测，按式1计算样品中丝氨酸的含量，结果列于表2：

表2重复性试验

由表中数据可见，该方法实验结果重现性良好。

试验例2

方法精密度试验

样品处理，标准品配置，色谱条件，测试与结果计算方法同试验例1。不同试验人员称取待测样品约0.05g(精确至0.0002g)6份，按上述方法进行检测，得到一组精密度试验数据，结果列于表3，

表3精密度试验

由表中数据可见，该方法实验结果精密度良好。

Claims (6)

1.一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)丝氨酸标准品溶液的配制：将丝氨酸标准品加入流动相溶解后，再加入2-氯吡啶，混匀，于70～80℃条件下静置保温30～40min使丝氨酸标准品充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释得到0.5g/l的丝氨酸标准品溶液；

样品溶液的配制：将待测样品加入流动相溶解后，再加入2-氯吡啶，混匀，于70～80℃条件下静置保温30～40min使待测样品充分衍生化得到溶液，将上述溶液冷却至室温，用流动相稀释得到0.5g/l样品溶液；

其中，流动相为体积比为30：70的乙腈与水的混合溶液，该溶液pH值为2.0～2.5；

2)采用高效液相色谱对标准品溶液和样品溶液进行检测，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：VP-ODS，5μm，4.6×150mm不锈钢柱；

流动相组成：乙腈与水的体积比为30：70，磷酸调节流动相pH至2.0～2.5；

流动相流速：1.0ml/min；

柱室温度：35℃；

检测波长：254～270nm；

进样量：25μl。

2.根据权利要求1所述的一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：所述的检测顺序是按标准品、试样、试样、标准品的顺序依次进行。

3.根据权利要求1所述的一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：所述的2-氯吡啶与丝氨酸的摩尔比大于1。

4.根据权利要求3所述的一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：所述的2-氯吡啶与丝氨酸的摩尔比为50～55：1。

5.根据权利要求1所述的一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：所述磷酸的质量浓度为10％～15％。

6.根据权利要求1所述的一种丝氨酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于：所述的检测器为紫外检测器，检测波长为268nm。