CN104569165B - 一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物葛兰心宁的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物葛兰心宁的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法检测所述药物组合物中的绞股蓝皂苷XLIX的含量，以及采用薄层色谱法以葛根素对照品和葛根对照药材为指标鉴定所述药物组合物中的葛根总黄酮。本发明所述的检测方法，可以有助于所述药物组合物质量达到稳定、可控、高效及安全，克服现有技术的不足，为更好的地满足医疗的需要提供有力保证。

Description

一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物葛兰心宁的检测方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物的检测方法，特别是涉及一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的软胶囊剂，即葛兰心宁软胶囊的检测方法。

背景技术

葛兰心宁软胶囊由葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷三种中药材提取物组成。三种提取物之间具有协同作用，符合中药组方原则，能够达到标本兼治的目的。该制剂吸收了经典古方之精华，具有活血化瘀，通络止痛之功效，用于治疗淤血闭阻所致的冠心病﹑心绞痛。在全国各地医院临床应用过程中，证明其具有显著的临床疗效，深得广大医务工作者和患者的信任。

在现有的葛兰心宁软胶囊的检测方法中，对葛根总黄酮中的葛根素进行了薄层色谱（TLC）鉴别和液相色谱（HPLC）含量测定，并对绞股蓝总苷进行了薄层色谱（TLC）鉴别。采用葛根素为对照品对葛根提取物进行鉴别存在一定的缺陷，没有全面反映出提取物的真实来源。对绞股蓝皂苷也未制定相关的含量测定控制方法，并且薄层色谱（TLC）鉴别所用对照品绞股蓝皂苷-A来源有限。为进一步有效控制该产品的质量、保证临床用药安全，需要对该产品的活性成分检测方法进行完善，从而更进一步保证该产品的质量和疗效。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物的检测方法。该检测方法能够更加有效控制药物的质量，使药物质量稳定可控，从而更好地满足医疗需要。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物葛兰心宁的检测方法，所述药物组合物包括葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总苷；所述检测方法包括采用高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX，采用薄层色谱法测定葛根总黄酮。

所述高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX的色谱法条件包括：

填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温为30℃；

采用蒸发光散射检测器，漂移管温度80-120℃，优选105℃；

流动相为由A、B混合溶剂组成，体积比A:B=20-50:80-50；A选自乙腈或甲醇，B选自水、0.5%（v/v）的磷酸溶液或0.5%（v/v）的冰醋酸溶液；

流速为1ml/min；

理论板数按绞股蓝皂苷XLIL峰计应不低于2000。

优选的，所述漂移管温度为105℃。

优选的，所述流动相中，A为乙腈，B为水，体积比乙腈:水=35:65。

优选的，本发明所述高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中绞股蓝皂苷XLIX，包括以下步骤：

1）对照品溶液的制备

精密称取80℃减压干燥3h的绞股蓝皂苷XLIX对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；

2）供试品溶液的制备

取待测的所述药物组合物约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得；

3）测定

分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，与供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，本发明所述薄层色谱测定葛根总黄酮的条件如下：

采用硅胶G薄层板和体积比为5-9：1-4：0.1-0.35，优选为7:2.5:0.25的C-D-E混合溶剂作为展开剂；紫外光灯365nm检视；其中：

所述C选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚，优选为三氯甲烷；

所述D选自乙酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮、乙醇或甲醇，优选为甲醇；

所述E选自水、甲酸甲酯、冰醋酸或甲酸，优选为水。

优选的，所述展开剂为体积比为7:2.5:0.25的三氯甲烷-甲醇-水。

优选的，所述薄层色谱测定葛根总黄酮包括如下步骤：

1）取待测的所述药物组合物，加甲醇超声提取，静置，滤过，滤液作为供试品溶液；

2）取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

3）取葛根对照药材，加70%乙醇加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为对照药材溶液。

4）吸取上述两种溶液各2～4μl，采用硅胶G薄层板，采用所述展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

本发明所述药物组合物葛兰心宁为软胶囊剂，原料组成及配比如下：

葛根总黄酮100-400重量份、山楂提取物30-120重量份、绞股蓝总苷10-40重量份、色拉油125-500重量份、蜂蜡3-15重量份、氢化棕榈油10-40重量份、大豆磷脂5-20重量份、甲基硅油0.2-1.0重量份；

优选地，所述原料组成及配比如下：

葛根总黄酮200重量份、山楂提取物60重量份、绞股蓝总苷20重量份、色拉油254重量份、蜂蜡6重量份、氢化棕榈油20重量份、大豆磷脂10重量份、甲基硅油0.5重量份。

所述药物组合物葛兰心宁通过如下方法制备：

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。

在一个优选的具体实施方案中，所述药物组合物为通过上述制备方法制备得到的所述软胶囊剂，所述药物组合物的检测方法包括采用高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX的含量，和采用薄层色谱法测定葛根总黄酮。

高效液相色谱法检测所述软胶囊剂的绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX的含量，色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

采用蒸发光散射检测器，漂移管温度80-120℃；

流动相：由A、B混合溶剂组成，体积比A:B=20-50:80-50；A选自乙腈或甲醇，B选自水、0.5%（v/v）的磷酸溶液或0.5%（v/v）的冰醋酸溶液；

流速：1ml/min；

理论板数：按绞股蓝皂苷XLIL峰计应不低于2000；

具体包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：准确称取80℃减压干燥3h的绞股蓝皂苷XLIX对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

（2）供试品溶液的制备：取待测软胶囊10粒内容物，尽量取尽胶囊内壁残留，将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

（3）测定：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，以及供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

薄层色谱法测定所述软胶囊剂的葛根总黄酮，薄层色谱条件为：

采用硅胶G薄层板，体积比为5-9：1-4：0.1-0.35的C-D-E混合溶剂作为展开剂，其中：

所述C选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚，优选为三氯甲烷；

所述D选自乙酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮、乙醇或甲醇，优选为甲醇；

所述E选自水、甲酸甲酯、冰醋酸或甲酸，优选为水；

紫外光灯365nm检视；

包括如下步骤：

（1）取所述软胶囊剂10粒内容物，尽量取尽胶囊内壁残留，将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，静置，滤过，滤液作为供试品溶液；

（2）取葛根素对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

（3）取葛根对照药材适量，加70%乙醇加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为对照药材溶液。

（4）吸取上述两种溶液各2～4μl点于所述硅胶G薄层板上，以所述展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述药物组合物可以是葛兰心宁软胶囊，该软胶囊一个处方量（即制1000粒）配比如下：葛根总黄酮200g、山楂提取物60g、绞股蓝总苷20g、色拉油254g、蜂蜡6g、氢化棕榈油20g、大豆磷脂10g、甲基硅油0.5g。

上述葛兰心宁软胶囊通过如下方法制备：

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。

所述葛兰心宁软胶囊的检测方法，包括采用高效液相色谱法定量测定所述绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX，和采用薄层层析法定性鉴别所述葛根总黄酮。其中，采用高效液相色谱法定量测定所述绞股蓝皂苷XLIX，色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

采用蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃；

流动相：体积比为35:65的乙腈-水；

流速：1ml/min；

理论板数：按绞股蓝皂苷XLIL峰计应不低于2000。

具体包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：准确称取80℃减压干燥3h的绞股蓝皂苷XLIX对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

（2）供试品溶液的制备：取本品10粒内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

（3）阴性对照溶液的制备：按葛兰心宁软胶囊处方比例和工艺制备的不含绞股蓝总苷的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。

（4）测定：精密吸取对照品溶液10μl、20μl，与供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

上述检测方法中，阴性样品无干扰，样品峰型良好，重现性良好，可以作为测定葛兰心宁软胶囊中绞股蓝总苷含量的依据。

采用薄层层析法定性鉴别所述葛根提取物，薄层色谱条件为：

采用硅胶G薄层板，体积比为7:2.5:0.25的三氯甲烷-甲醇-水；

紫外光灯365nm检视。

具体包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：取葛根素对照品（中检院提供，批号为110752-200912）,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。

（2）对照药材溶液的制备：取葛根对照药材（中检院提供，批号为121551-200902）1g，加70%乙醇加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为对照药材溶液。

（3）供试品溶液的制备：取本品10粒内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约一粒重，置锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，静置，滤过，滤液作为供试品溶液。

（4）葛根总黄酮阴性样品溶液的制备：再取按葛兰心宁软胶囊处方比例和工艺制备的不含葛根提取物的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。

（5）吸取上述两种溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7：2.5：0.25的三氯甲烷－甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。

上述检测方法中，阴性样品无干扰，样品斑点清晰，重现性良好，可以作为鉴别葛兰心宁软胶囊中葛根提取物的依据。

与现有技术相比，本发明至少存在以下有益效果：

1、本发明增加了绞股蓝总苷中绞股蓝皂苷XLIX的液相色谱检测方法，更换绞股蓝总苷的指标性成分绞股蓝皂苷-A为绞股蓝皂苷XLIX，解决了法定对照品难以获得的问题。检测方法由薄层层析法提升为高效液相法，能更加有效控制产品质量。试验过程可操作性强，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且绞股蓝总苷阴性样品无干扰，可以作为控制所述药物组合物内在质量的方法之一。

2、在对葛根总黄酮的定性检测中，本发明增加了葛根对照药材。现有技术中，仅以葛根素为对照品，该方法存在的不足之处在于即使得到阳性结果，也无法给出总黄酮的来源信息。本发明通过以葛根素和葛根标准药材同时为对照，对所述药物组合物进行定性鉴别，以待测药物组合物制备的供试品是否在与对照相应的位置出现颜色相同的斑点为依据，就可以准确地鉴别出所述药物组合物中葛根总黄酮的真实来源，从而更有效地保证药物质量。此方法阴性无干扰，样品重现性良好，可以作为鉴别本发明所述药物组合物中葛根总黄酮的依据。

总之，本发明所述的检测方法，有助于更加准确控制所述冠心病﹑心绞痛的药物组合物，尤其是葛兰心宁软胶囊的质量，使葛兰心宁软胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，克服现有技术的不足，为更好的地满足医疗的需要提供有力保证。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是实施例2中专属性试验的液相色谱图，1a为供试样品的液相色谱图，1b为阴性样品的溶液相色谱图，1c为绞股蓝皂苷XLIX对照品，其中1号峰为绞股蓝皂苷XLIX的吸收峰。

图2是实施例3的薄层色谱鉴定图，其中，1-5、7-11为10批样品制备的供试品溶液；6、12为葛根素对照品溶液。

图3是实施例4的薄层色谱鉴定图，1、3、5、7、9为供试品溶液；2、12为葛根总黄酮；4、14为葛根对照药材溶液；8为不含葛根总黄酮的阴性样品溶液。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

其中，绞股蓝皂苷XLIX对照品，购自西安鸿程生物科技有限公司，批号为20100718，HPLC纯度为99.9%。；

葛根素对照品购买自中国食品药品检定研究院，批号为110752-200912；

葛根对照药材购买自中国食品药品检定研究院，批号为121551-200902。

实施例1一种治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物（葛兰心宁软胶囊）

1、处方：葛根总黄酮200g、山楂提取物60g、绞股蓝总苷20g、色拉油254g、蜂蜡6g、氢化棕榈油20g、大豆磷脂10g、甲基硅油0.5g，制成1000粒。

2、制备方法：取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。

实施例2液相色谱法检测绞股蓝皂苷XLIX含量的方法学建立

1、溶液配制及测定：

对照品溶液的制备

准确称取80℃减压干燥3h的绞股蓝皂苷XLIX对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备

取实施例1制备的软胶囊10粒的内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

阴性溶液的制备

葛根总黄酮200g、山楂提取物60g、色拉油254g、蜂蜡6g、氢化棕榈油20g、大豆磷脂10g、甲基硅油0.5g，制成1000粒。

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，得到阴性对照胶囊。

取上述制备的阴性对照胶囊10粒的内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为阴性溶液。

测定法

分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，阴性对照溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

2、色谱条件与系统适用性实验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温30℃；采用蒸发光散射检测器，乙腈和水为流动相，流速为1ml/min。对漂移管温度和流动相体积比进行了考察，结果见表1和表2。

表1漂移管温度考察

表2流动相比例考察

从表1可以看出，漂移管温度为105℃时，基线噪音低且理论塔板数最高。因此，漂移管温度优选为105℃。

从表2可以看出，乙腈-水的体积比为35:65时，绞股蓝皂苷XLIX的保留时间和理论塔板数皆适中。因此，流动相优选为体积比为35:65的乙腈-水。

在上述优选条件下，理论板数按绞股蓝皂苷XLIX峰计应不低于2000。

3、专属性试验：

取上述阴性溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，阴性样品的色谱图在与绞股蓝皂苷XLIX对照品色谱峰相同保留时间处未见明显色谱峰。结果见图1，显示阴性无干扰。

4、线性关系考察：

精密称定绞股蓝皂苷XLIX对照品12.83mg，置于25ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，浓度为0.5132mg/ml。按上述色谱条件进行测定，分别进样1、2、4、6、8、10、15、20μl，以对照品的进样量（μg）对数值为横坐标，以峰面积积分值对数值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为:Y(峰面积对数值)=1.56X+5.25，R=0.999，结果表明绞股蓝皂苷XLIX进样量在0.513～10.254μg范围内线性关系良好，结果见表3。

表3绞股蓝皂苷XLIX线性试验峰数据

5、提取方法考察

甲醇直接超声和水浴回流。结果杂质峰面积非常大。

因此对提取溶剂、提取方式、提取液的后处理等主要影响因素进行了考察，实验条件、分组和测定结果见表2。提取效果拟定提取方法：取本品10粒内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。见表4。

根据实验结果，确定的供试品溶液优选的提取和制备方法是：

取软胶囊10粒的内容物（尽量取尽胶囊内壁残留），将内容物混匀，取约1.5g，置锥形瓶中，加10%甲醇40ml，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10ml水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，再分别用氨试液30ml和正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液。正丁醇液蒸干，残渣加甲醇并定容于10ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

表4提取方法实验结果

6、精密度试验：

取对照品溶液连续进样6次进行测定。绞股蓝皂苷XLIX的平均保留时间的和平均峰面积。见表5。

表5绞股蓝皂苷XLIX精密度试验峰面积数据

测定结果表明，本方法精密度良好。

7、稳定性试验

供试品溶液，分别于制备后0、4.5、9.5、14.5、21.5、30.5、39.5小时进样，测定峰面积，绞股蓝皂苷XLIX峰面积的RSD为0.31%。表明样品溶液在制备后39.5小时内稳定。见表6。

表6绞股蓝皂苷XLIX稳定性试验峰面积数据

结果表明，供试品溶液39.5小时内稳定性良好。

8、重复性试验：

取实施例1制备的软胶囊，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液进行测定。分别计算绞股蓝皂苷XLIX的含量。绞股蓝皂苷XLIX的平均含量为1.27mg/粒，RSD为2.1%。见表7。

表7绞股蓝皂苷XLIX重复性试验结果

结果表明，本方法重复性良好。

9、回收率试验：

精密称取绞股蓝皂苷XLIX对照品30.35mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为1.214mg/ml。取6份上述对照品溶液2ml分别置6个锥形瓶中，蒸干甲醇。取已知含量的实施例1制备的软胶囊内容物6份，精密称定，分别置上述各锥形瓶中，按供试品溶液的制备方法制备测试品溶液，测定测试品溶液中绞股蓝皂苷XLIX的总量，按照下式计算回收率。

其中，A是供试品中原有绞股蓝皂苷XLIX的量；B是绞股蓝皂苷XLIX对照品加入量；C是实际测得的绞股蓝皂苷XLIX的总量；

实验结果见表8，平均回收率为101.6%，RSD为2.4%。结果表明，本方法具有良好的回收率。

表8回收率试验结果

^*：A是供试品中原有绞股蓝皂苷XLIX的量；B是绞股蓝皂苷XLIX对照品加入量；C是实际测得的绞股蓝皂苷XLIX的总量；

10、转移率

按照下述公式计算转移率：

转移率%=测定值/理论值×100%

结果见表9。

表9转移率测定结果

根据测定结果可知，本品工艺方法及含量测定提取方法具有良好的转移率。

11、测定

按照实施例1的处方和制备方法，制备9批样品，按照所述测定方法，进行测定，计算含量，结果如表10所示。

表109批样品含量测定结果

通过对9批样品含量测定，考虑到药材来源以及制剂生产、贮藏、转移率等因素，制定本品每粒含绞股蓝总苷以绞股蓝皂苷XLIX（C₅₂H₈₆O₂₁）计，不得少于1.0mg。

实施例3葛根素的薄层色谱鉴定

1、试验条件：双槽展开缸（上海信谊）；硅胶G（薄层色谱用，青岛海洋化工厂）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。

2、试验步骤：取实施例1制备的软胶囊内容物0.6g，置锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，静置，滤过，滤液作为供试品溶液。

取葛根素对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。

照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇-水(7：2.5：0.25)为展开剂，展开，取出，晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。

结果见图2，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例4葛根总黄酮的薄层色谱鉴定

1、试验条件：双槽展开缸（上海信谊）；硅胶G（薄层色谱用，青岛海洋化工厂）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。

2、试验步骤：取实施例1制备的软胶囊内容物0.6g，置锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，静置，滤过，滤液作为供试品溶液。

取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。

取葛根对照药材1g，加70%乙醇加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为对照药材溶液。

再取按实施例1所述处方比例和工艺制备的不含葛根总黄酮的阴性样品，按照本实施例所述供试品溶液的制法制成葛根总黄酮阴性供试品溶液。

照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述四种溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇-水(7：2.5：0.25)为展开剂，展开，取出，晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。

结果见图3。在供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱斑点清晰，比移值适中，葛根总黄酮阴性样品无干扰。

从薄层色谱图中可以看出，除葛根素外，葛根总黄酮还含有多种成分。如果仅以葛根素单一成分作为葛根总黄酮的定性鉴别指标，不够全面，无法判断总黄酮的真实来源。但是现有技术中，仅以葛根素为对照品，供试品中只要求有一个主斑点能与对照品一致即可。本发明增加葛根对照药材，要求供试品至少有三个斑点能与对照药材一致。所以，与现有技术相比，本发明能够反映出葛根总黄酮的真实来源，即来源于葛根药材。因此，本发明所述检测方法能更有效控制产品的质量。

总之，本发明所述的检测方法，有助于更加准确地控制所述治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物，尤其是葛兰心宁软胶囊的质量，使葛兰心宁软胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，克服现有技术的不足，为更好的地满足医疗的需要提供有力保证。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (18)

1.一种治疗冠心病﹑心绞痛的药物组合物葛兰心宁的检测方法，所述药物组合物包括葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总苷；其特征在于，所述检测方法包括采用高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX，采用薄层色谱法测定葛根总黄酮；

所述高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX的色谱条件如下：

色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温为30℃；

采用蒸发光散射检测器，漂移管温度80-120℃；

流动相由A、B混合溶剂组成，体积比A:B＝20-50:80-50；A选自乙腈或甲醇，B选自水、0.5％(v/v)的磷酸溶液或0.5％(v/v)的冰醋酸溶液；

流速为1mL/min；

理论板数按绞股蓝皂苷XLIL峰计应不低于2000。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，漂移管温度为105℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相中，A为乙腈，B为水，体积比乙腈:水＝35:65。

4.根据权利要1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测绞股蓝总苷中的绞股蓝皂苷XLIX，包括以下步骤：

1)对照品溶液的制备

精密称取80℃减压干燥3h的绞股蓝皂苷XLIX对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备

取待测的所述药物组合物约1.5g，置锥形瓶中，加10％甲醇40mL，水浴回流40分钟，用少量棉花滤过，用10mL水洗涤玻璃容器和棉花，滤液合并于分液漏斗中，用乙醚40mL振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40mL，合并正丁醇液，再分别用氨试液30mL和正丁醇饱和的水30mL洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，即得；

3)测定

分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，与供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱测定葛根总黄酮的条件如下：

采用硅胶G薄层板和体积比为5-9:1-4:0.1-0.35的C-D-E混合溶剂作为展开剂；紫外光灯365nm检视；其中：

所述C选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚；

所述D选自乙酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮、乙醇或甲醇；

所述E选自水、甲酸甲酯、冰醋酸或甲酸。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述C-D-E混合溶剂的体积比为7:2.5:0.25。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述C为三氯甲烷，所述D为甲醇，所述E为水。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述展开剂为体积比为7:2.5:0.25的三氯甲烷-甲醇-水。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱测定葛根总黄酮包括如下步骤：

1)取待测的所述药物组合物，加甲醇超声提取，静置，滤过，滤液作为供试品溶液；

2)取葛根素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

3)取葛根对照药材，加70％乙醇加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为对照药材溶液；

4)吸取上述三种溶液各2～4μL，采用硅胶G薄层板，采用所述展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

10.根据权利要求1、2、3、5、6、7或8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁为软胶囊剂，原料组成及配比如下：

葛根总黄酮100-400重量份、山楂提取物30-120重量份、绞股蓝总苷10-40重量份、色拉油125-500重量份、蜂蜡3-15重量份、氢化棕榈油10-40重量份、大豆磷脂5-20重量份、甲基硅油0.2-1.0重量份。

11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述原料组成及配比如下：

葛根总黄酮200重量份、山楂提取物60重量份、绞股蓝总苷20重量份、色拉油254重量份、蜂蜡6重量份、氢化棕榈油20重量份、大豆磷脂10重量份、甲基硅油0.5重量份。

12.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁通过如下方法制备：

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。

13.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁为软胶囊剂，原料组成及配比如下：

葛根总黄酮100-400重量份、山楂提取物30-120重量份、绞股蓝总苷10-40重量份、色拉油125-500重量份、蜂蜡3-15重量份、氢化棕榈油10-40重量份、大豆磷脂5-20重量份、甲基硅油0.2-1.0重量份。

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述原料组成及配比如下：

葛根总黄酮200重量份、山楂提取物60重量份、绞股蓝总苷20重量份、色拉油254重量份、蜂蜡6重量份、氢化棕榈油20重量份、大豆磷脂10重量份、甲基硅油0.5重量份。

15.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁通过如下方法制备：

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。

16.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁为软胶囊剂，原料组成及配比如下：

葛根总黄酮100-400重量份、山楂提取物30-120重量份、绞股蓝总苷10-40重量份、色拉油125-500重量份、蜂蜡3-15重量份、氢化棕榈油10-40重量份、大豆磷脂5-20重量份、甲基硅油0.2-1.0重量份。

17.根据权利要求16所述的检测方法，其特征在于，所述原料组成及配比如下：

葛根总黄酮200重量份、山楂提取物60重量份、绞股蓝总苷20重量份、色拉油254重量份、蜂蜡6重量份、氢化棕榈油20重量份、大豆磷脂10重量份、甲基硅油0.5重量份。

18.根据权利要求16所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物葛兰心宁通过如下方法制备：

取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除泡，药液压制成软胶囊，即得。