CN104560933B - 一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂 - Google Patents

一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂，属于酶制剂技术领域。本发明提供的脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂，具有极其优异的储存稳定性，在4℃保存一年，其酶活保留率仍达90％以上，在37℃保存15天，其酶活保留率仍达50％以上，保存30天，其酶活保留率仍高达45％以上，解决了由于产品运送或储存时间较长导致产品应用性能迅速下降的问题。本发明提供的液体酶制剂复配方法简单，原料来源丰富并且成本低，特别适合在工业上推广。

Description

一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂
技术领域
本发明涉及一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂，属于酶制剂技术领域。
背景技术
脯氨酸特异性内切蛋白酶是存在于微生物(包括细菌和真菌)的蛋白酶，其活性中心含有丝氨酸，组氨酸以及天冬氨酸，广泛用于生物技术、医药、食品以及酿造等行业。
脯氨酸特异性内切蛋白酶的最适反应温度主要在30℃-50℃之间，脯氨酸特异性内切蛋白酶保藏过程中，前期失活比较严重，当脯氨酸特异性内切蛋白酶在30℃时，其半衰期为1h，另外保存于37℃的脯氨酸特异性内切蛋白酶7天后就几乎完全丧失酶活，严重影响了脯氨酸特异性内切蛋白酶的贮存时间以及工业化应用。
因此，脯氨酸特异性内切蛋白酶酶制剂需要一种有效地复配方法来提高其贮存稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白酶复配酶制剂，尤其是一种具有良好储藏稳定性的脯氨酸特异性内切蛋白酶酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述复配酶制剂主要包含脯氨酸特异性内切蛋白酶、30％-90％的甘油、1-10mM CaCl2、1-10mM NaCl、1-10mM KCl、1-10g/L山梨醇、0.01-2g/L山梨酸钾、2％-10％的聚乙二醇以及0.5-1.5g/L明胶；所述百分比是体积百分比。不足部分以水补足。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶还可替换为其他类似的酸性蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，复配酶制剂中脯氨酸特异性内切蛋白酶的含量为1-10g/L。
在本发明的另一种实施方式中，所述复配酶制剂含脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L、30％-60％的甘油、4-6％的PEG400和1.0-1.5g/L的明胶、8-10g/L的山梨醇、0.01-2g/L的山梨酸钾，3-5mM的CaCl2、3-5mM的NaCl以及3-5mM的KCl。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于真菌曲霉(Aspergillus sp.)或产真菌曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是由野生脯氨酸特异性内切蛋白酶生产菌株或者基因工程菌株发酵得到。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于黑曲霉或者米曲霉。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于产脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因工程菌。如发明名称为“一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用”，申请号：201310567472.0的发明专利申请中记载的基因工程菌；或发明名称为“一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用”，申请号：201310568071.7的发明专利申请中记载的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是通过微生物发酵制备获得。
本发明提供的蛋白酶复配酶制剂具有极其优异的储存稳定性，在4℃保存一年，其酶活保留率仍达90％以上，在30℃保存15天，其酶活保留率仍达50％以上，保存30天，其酶活保留率仍高达45％以上，解决了由于产品运送或储存时间较长导致产品应用性能迅速下降的问题。本发明提供的酶制剂复配方法简单，原料来源丰富并且成本低，特别适合在工业上推广。
具体实施方式
脯氨酸特异性内切蛋白酶在复配酶制剂中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。
脯氨酸特异性内切蛋白酶活力的测定方法为：脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活测定方法参照Luppo Edens(Luppo Edens,Peter Dekker,Rob Van Der Hoeven,etal.Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7950-7957)。取适量发酵浓缩上清液，加入80μl柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)和10μl 2mmol/L的Z-Gly-Pro-pNA溶液，摇匀，37℃分别反应10min。测定反应前后溶液在410nm处的吸光度。在上述条件下，每分钟分解Z-Gly-Pro-pNA释放1μmol pN的酶量，定义为一个酶活单位(U/ml)。通过△A410计算脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活。U/ml＝(△A/min)*(V*/rvb)；其中△A/min为吸光度变化，V为反应体系体积(ml)，r为摩尔消光系数(cm2/mol)，v为样品量(ml)，b为比色杯光程(cm)。上述用量可按比例增加或减少。
实施例1脯氨酸特异性内切蛋白酶的制备
脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于产脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因工程菌，其构建方法参见发明名称为“一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用”，申请号：201310568071.7的发明专利申请。
基因工程菌的发酵培养基(3L)：
摇瓶种子培养基(YPD)：酵母浸提物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
甘油生长相培养基(基础盐培养基)：CaSO4 0.93g/L，85％H3PO4 28.70mL/L，MgSO4·7H2O14.90g/L，K2SO4 18.20g/L，KOH 4.13g/L。用此培养基配制成含4％(W/V)的甘油和4mL/L PTM1的发酵培养基。
甘油过渡相补料培养基：50％(W/V)甘油，其中PTM1含量为12mL/L。
甲醇诱导相培养液:纯甲醇诱导液，其中PTM1含量为24mL/L。
微量元素PTM1溶液：CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.08g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，ZnSO4·7H2O 42.2g/L，FeSO4.7H2O 65.0g/L，CoC12·6H2O 0.5g/L，Biotin 0.2g/L，H2SO4 5.0mL/L。
基因工程菌的发酵培养条件：
7L发酵罐培养，准确配制2.5L甘油生长相培养基置于7L发酵罐内，安装好挡板、搅拌桨、补料针等，并插入已离线标定好的DO、pH和消泡电极，封口保护电极头，接上两个空气过滤器，中间用夹子包扎好，连接好取样器，然后放置于灭菌锅内121℃灭菌20min。取出室温冷却，连接上发酵调控器，调节空气流量为2.5L/min，初始搅拌转速为300r/min，菌体生长温度为30℃，用氨水自动调控pH值为5.5。将5瓶种子液并种，并加入10.875mL过膜除菌的PTM1溶液，火焰接种，接种量为10％，当DO值稳定后较100％，在甘油生长相期间通过蛇管冷却或加热套加热以及自动流加氨水控制温度与pH在设定值，并通过调节转速维持溶氧值在50％以上。发酵过20-25h，此时溶氧值会急剧上升，这表明培养基中的底物甘油已基本耗尽，维持此状态半小时后开始流加50％的甘油过渡相培养基，进入甘油间歇补料阶段。同时连接上甲醇控制仪，预热。每4h取样检测菌体浓度，当其值达到需要的诱导菌浓时，停止补加甘油，维持此状态30min，使得甘油彻底耗尽，目的是避免过剩甘油阻遏启动子AOX1，重新校正溶氧值为100％，同时调节诱导温度至28℃。开始进入甲醇相，利用甲醇控制仪变速的向发酵液中流加甲醇诱导液，起初慢慢增加甲醇补料速率，以免菌体无法适应甲醇而中毒(适应期为8h左右)，当菌体逐渐适应了甲醇之后，提高流加速率维持甲醇浓度在0.1±0.02％(V/V)左右，并通过调节转速，增加流量，混合通纯氧的方式维持溶氧值在10％-20％之间，诱导脯氨酸特异性内切蛋白酶的高效表达。28℃条件下诱导培养72h后下罐，将发酵液12000rpm4℃离心20min除去菌体，得到上清液，抽滤过0.22μm的水相滤膜除菌，即为含脯氨酸特异性内切蛋白酶的水溶液。
实施例2
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L
甘油 20％-30％(v/v)
PEG400 5-10％(v/v)
明胶 1.0-1.5g/L
山梨醇 8-10g/L
山梨酸钾 0.05-1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为90％-95％和85％-92％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为30％-40％和20％-25％，见表1。
实施例3
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶 1-10g/L
甘油 30-40％(v/v)
PEG400 5-8％(v/v)
明胶 0.5-1g/L
山梨醇 8-10g/L
山梨酸钾 0.05-1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为93％-97％和90％-95％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为30％-40％和20％-25％，见表1。
实施例4
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L
甘油 40-50％(v/v)
PEG400 5-10％(v/v)
明胶 0.5-0.8g/L
山梨醇 4-10g/L
山梨酸钾 0.05-1g/L
CaCl2 1.5-3mM
NaCl 1.5-3mM
KCl 1.5-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为90％-96％和90％-94％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为30％-38％和20％-24％，见表1。
实施例5
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L
甘油 50％-60％(v/v)
PEG400 5-8％(v/v)
明胶 0.5-1.0g/L
山梨醇 6-10g/L
山梨酸钾 0.05-0.1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为95％-98％和95％-97％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为50％-55％和40％-45％，见表1。
实施例6
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L
甘油 60％-70％(v/v)
PEG400 5-10％(v/v)
明胶 0.5-1.0g/L
山梨醇 6-10g/L
山梨酸钾 0.05-0.1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为90-93％和90-92％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为30-35％和15-20％，见表1。
实施例7
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L
甘油 70-80％(v/v)
PEG400 5-10％(v/v)
明胶 0.1-1.0g/L
山梨醇 5-10g/L
山梨酸钾 0.05-0.1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在3.0-6.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为85-90％和85-88％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为25-30％和15-20％，见表1。
而对照1组实验数据表明，未添加保护试剂的pH 5.0的脯氨酸特异性内切蛋白酶溶液，放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为80-88％和70-75％，37℃保存的脯氨酸特异性内切蛋白酶溶液7天后就几乎完全丧失酶活，见表1。
实施例8
复配液体酶制剂各组分的含量如下：
酸性蛋白酶1-10g/L
甘油 50-60％(v/v)
PEG400 5-10％(v/v)
明胶 0.5-1.0g/L
山梨醇 6-8g/L
山梨酸钾 0.05-0.1g/L
CaCl2 3-5mM
NaCl 1-3mM
KCl 1-3mM
调复配酶制剂pH在4.0-5.0。
复配后的液体酶制剂放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为90-96％和90-93％，37℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为40-50％和35-39％，见表1。
而对照2组实验数据表明，未添加保护试剂的pH 5.0的酸性蛋白酶溶液，放置于4℃保存15天以及30天，其酶活保留率分别为80-86％和70-75％，37℃保存的酸性蛋白酶溶液10天后就几乎完全丧失酶活，见表1。
表1 复配酶制剂的保存效果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种蛋白酶复配酶制剂，其特征在于，主要包含脯氨酸特异性内切蛋白酶、30％-90％的甘油、1-10mM CaCl2、1-10mM NaCl、1-10mM KCl、1-10g/L山梨醇、0.01-2g/L山梨酸钾、2％-10％的聚乙二醇以及0.5-1.5g/L明胶；所述百分比是体积百分比，复配剂的pH为3-6；
所述脯氨酸特异性内切蛋白酶的编码基因来源于米曲霉。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶复配酶制剂，其特征在于，含有脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L。
3.根据权利要求1所述的复配酶制剂，其特征在于，含有脯氨酸特异性内切蛋白酶1-10g/L、30-60％的甘油、4-6％的PEG400和1.0-1.5g/L的明胶、8-10g/L的山梨醇、0.05-1g/L的山梨酸钾，3-5mM的CaCl2、3-5mM的NaCl以及3-5mM的KCl。
4.根据权利要求1所述的复配酶制剂，其特征在于，用2mol/L柠檬酸溶液调节复配酶制剂的pH至3-6。
5.根据权利要求2所述的复配酶制剂，其特征在于，用2mol/L柠檬酸溶液调节复配酶制剂的pH至3-6。
6.根据权利要求3所述的复配酶制剂，其特征在于，用2mol/L柠檬酸溶液调节复配酶制剂的pH至3-6。
7.根据权利要求1所述的复配酶制剂，其特征在于，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是通过微生物发酵制备获得的。
8.根据权利要求2所述的复配酶制剂，其特征在于，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是通过微生物发酵制备获得的。
9.根据权利要求3所述的复配酶制剂，其特征在于，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是通过微生物发酵制备获得的。
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