CN104560781A - 提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法 - Google Patents

提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法，所述方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养。通过提高50％葡萄糖溶液加入量，提高培养基氨氮、总氮含量，控制空气通入量来提高活菌数，能够有效提高布氏杆菌病活疫苗的活菌率，并保持较高的菌体活力，提高冻干后保存期内细菌的存活率。利用本发明方法培养得到的菌液的菌活数可达到1800-2200亿/ml，保存期13个月其菌活数能达到1400-1700亿/ml，活菌率占63％-77％，具有产量高、保存期长、生产成本低等优点。

Description

提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布氏菌属(Brucella)成员引起的一种人畜共患传染病，严重威胁着人和多种动物的生命健康。OIE将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。该病流行范围广泛，遍及世界各地。病原为布鲁氏杆菌，为细小、两端钝圆的球杆菌或短杆菌，革兰氏染色阴性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。羊在国内为主要传染源，其次为牛和猪。研究认为，使用疫苗是预防和控制布病的有效方法。
目前市场上普遍使用的疫苗主要是布氏杆菌病活疫苗(S2株)、布氏菌病活疫苗(A19株)、布氏杆菌病活疫苗(M5或M5-90株)等，主要用于猪、牛、羊布氏杆菌病的防治。
现有布氏杆菌病活疫苗生产规程如下：
一级菌种制备：冻干菌种启封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其他适宜培养基上，在36-37℃培养2-3日。观察菌落形态，选取合适菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36-37℃培养48-72小时，作为一级菌种。在2-8℃，使用期应不超过1个月。
二级菌种制备：取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁瓶或其他适宜培养基，置36-37℃培养48-72小时，肉眼检查纯净后，每个扁瓶加蛋白胨水(pH 6.5-7.0)适量，将菌苔洗下，接种于1-2万ml的适宜液体培养基，置36-37℃培养36-72小时，用肝汤琼脂进行纯粹检验，并置2-8℃保存，使用期应不超过30日。
菌液培养：按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基体积的1％-2％接种二级菌种液，在36-37℃逐渐增大通气量，培养36小时，培养过程中可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1％-2％。
按现有规程进行布氏杆菌病活疫苗(A19株)、布氏菌病活疫苗(M5或M5-90株)、布氏杆菌病活疫苗(S2株)生产培养得到菌液的活菌数A19约为300亿/毫升左右，M5约为500亿/毫升左右，S2约为1200亿/毫升左右，通过对菌液的进一步浓缩，才能到达1400-1800亿/ml的菌活数。但是经过保存期实验，疫苗产品存放5个月后，其菌活数仅能达到600-800亿/ml，其活菌率约占33％-57％。
综上，采用现有规程生产工艺生产的疫苗产品存在菌活率低、保存期短、生产成本高等问题。
ZL201110180953.7公开了一种布氏杆菌病活疫苗的制备方法，具体涉及提高布氏杆菌病活疫苗(A19株)菌活数的方法，该方法通过在现有规程的基础上改变通气量的方式提高菌活数，得到的菌活数能达到1500-1800亿/ml。通过对该方法生产的活疫苗产品进行保存期试验，结果表明疫苗产品存放13个月后，其菌活数仅能达到800-1000亿/ml，其活菌率约占44％-61％。
发明内容
本发明的目的是克服现有的布氏杆菌病活疫苗的生产方法中生产的疫苗产品活菌率低、保存期短、生产成本高等问题，提供一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的新方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法，所述方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养。
其中，在一级菌种制备阶段，冻干菌种启封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其他适宜培养基上，在36-37℃培养2-3日。观察菌落形态，选取合适菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36-37℃培养48-72小时，作为一级菌种。在2-8℃，使用期应不超过1个月。
在二级菌种制备阶段，取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁瓶或其他适宜培养基上，置36-37℃培养48-72小时，肉眼检查纯净后，向扁瓶中加入蛋白胨水将菌苔洗下，接种液体培养基，置36-37℃通入洁净压缩空气培养36-72小时后，进行纯粹检验，并置2-8℃保存。使用期应不超过30日。
在菌液培养阶段，基础培养基中氨氮含量应不低于1.6mg/ml，总氮量不低于5.5mg/ml，另外向培养基中加入培养基重量0.003～0.005％的消泡剂，灭菌后按培养基体积的1％-2％接种二级菌种，同时按培养基体积的4％-6％加入浓度为50％的葡萄糖溶液，在36-37℃按照逐步增大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时；在通气培养过程中，根据需要加入浓度为50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总重量的1％-3％，且培养36小时后培养基的pH值为6.9-7.2(优选pH7.0)。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数，应符合质量标准。
前述的方法，在菌液培养阶段，所述逐步增大通气量是指单位时间内空气通入单位培养基气量，具体如下：
0～3小时：0.1～0.15m3/L·小时
3～6小时：0.15～0.2m3/L·小时
6～9小时：0.2～0.23m3/L·小时
9～12小时：0.23～0.24m3/L·小时
12～18小时：0.24～0.26m3/L·小时
18～24小时：0.26～0.3m3/L·小时
24～36小时：0.3～0.33m3/L·小时
本发明中使用的消泡剂为聚醚多元醇。
所述洁净压缩空气是指普通空气经无油压缩机压缩，再经吸附式压缩空气干燥器及多级过滤器、除味活性炭过滤器和末端0.22μm滤器除菌过滤，其中尘埃粒径≤0.01μm，脱臭≥99.5％，残油≤0.003ppm。
本发明中涉及的布氏杆菌病活疫苗包括但不限于S2株、A19株、M5株或M5-90株。
本发明提供了一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的生产工艺，为布氏杆菌病活疫苗的生产提供了新技术。通过提高50％葡萄糖溶液加入量，提高培养基氨氮、总氮含量，控制空气通入量来提高活菌数，能够有效提高布氏杆菌病活疫苗的活菌率，并保持较高的菌体活力，提高冻干后保存期内细菌的存活率。利用本发明方法培养得到的菌液的菌活数可达到1800-2200亿/ml，保存期13个月其菌活数能达到1400-1700亿/ml，活菌率占63％-77％，具有产量高、保存期长、生产成本低等优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例所述洁净压缩空气是指普通空气经无油压缩机压缩，再经吸附式压缩空气干燥器及多级过滤器、除味活性炭过滤器和末端0.22μm滤器除菌过滤，其中尘埃粒径≤0.01μm，脱臭≥99.5％，残油≤0.003ppm。
实施例1布氏杆菌病活疫苗(S2株)的制备
一、菌种
猪种布氏菌弱毒菌S2株，由中国兽医药品监察所供应。
二、生产用种子制备
一级菌种的制备与鉴定：
按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开启布氏杆菌病活疫苗(S2株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划线接种酶胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。
观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。
二级菌种的制备：
取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后分别接种肝汤琼脂三角瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6只用适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的种子培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹检验及活菌计数，然后保压降温存放或放入种子瓶中置2-8℃存放。
三、制苗用菌液制备与检验
制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)，配制后经管道输入反应缸内，另外加培养基重量0.004％的消泡剂聚醚多元醇，116-119℃高压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。
菌液培养：按培养基量的1.5％接入二级菌种液，同时按培养基体积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。
单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：
0～3小时：0.15m3/L·小时
3～6小时：0.2m3/L·小时
6～9小时：0.22m3/L·小时
9～12小时：0.24m3/L·小时
12～18小时：0.25m3/L·小时
18～24小时：0.28m3/L·小时
24～36小时：0.32m3/L·小时
在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总体积的2％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数，应符合质量标准。
制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。
对比例1
分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例1的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(S2株)的制备，结果如表1所示。
表1三种工艺参数比较
将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例1的改进工艺分别制备的布氏杆菌病活疫苗(S2株)冻干后放置0个月、3个月、5个月、7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数如表2所示，并计算活菌率。
表2不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率
实施例2布氏杆菌病活疫苗(A19株)的制备
一、菌种
原始菌种：
牛种布氏菌弱毒菌A19株，由中国兽医药品监察所供应。
二、生产用菌种制备
一级菌种的制备与鉴定：
按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开启布氏杆菌病活疫苗(A19株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划线接种酶胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。
观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。
二级菌种的制备：
取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后接种肝汤琼脂三角瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6只用适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的菌种培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹检验及活菌计数，然后保压降温存放或放入菌种瓶中置2-8℃存放。
三、制苗用菌液制备与检验
制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)，配制后经管道输入反应缸内，另外加培养基重量0.003的消泡剂聚醚多元醇，116-119℃高压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。
菌液培养：按培养基量的1％接入二级菌种液，同时按培养基体积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。
单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：
0～3小时：0.1m3/L·小时
3～6小时：0.15m3/L·小时
6～9小时：0.23m3/L·小时
9～12小时：0.23m3/L·小时
12～18小时：0.26m3/L·小时
18～24小时：0.3m3/L·小时
24～36小时：0.3m3/L·小时
在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总体积的1％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数，应符合质量标准。
制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。
分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例2的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(A19株)的制备，结果如表3所示。
表3三种工艺参数比较
将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例2的改进工艺分别制备的布氏杆菌病活疫苗(A19株)冻干后放置0个月、3个月、5个月、7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数如表4所示，并计算活菌率。
表4不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率
实施例3布氏杆菌病活疫苗(M5株)的制备
一、菌种
原始菌种：
羊种布氏菌弱毒菌M5株，由哈尔滨兽医研究所供应。
二、生产用菌种制备
一级菌种的制备与鉴定：
按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开启布氏杆菌病活疫苗(M5或M5-90株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划线接种酶胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。
观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。
二级菌种的制备：
取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后接种肝汤琼脂三角瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6只用适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的菌种培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹检验及活菌计数，然后保压降温存放或放入菌种瓶中置2-8℃存放。
三、制苗用菌液制备与检验
制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)配制后经管道输入反应缸内，另外加0.005％消泡剂聚醚多元醇，116-119℃高压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。
菌液培养：按培养基量的2％接入二级菌种菌液，同时按培养基体积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。
单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：
0～3小时：0.15m3/L·小时
3～6小时：0.2m3/L·小时
6～9小时：0.23m3/L·小时
9～12小时：0.24m3/L·小时
12～18小时：0.26m3/L·小时
18～24小时：0.3m3/L·小时
24～36小时：0.33m3/L·小时
在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的3％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数，应符合质量标准。
制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。
分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例3的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(M5株)的制备，结果如表5所示。
表5三种工艺参数比较
将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例3的改进工艺分别制备的布氏杆菌病活疫苗(M5株)冻干后放置0个月、3个月、5个月、7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数如表6所示，并计算活菌率。
表6不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法，其特征在于，所述方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；
其中，在二级菌种制备阶段，取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁瓶中，置36-37℃培养48-72小时，肉眼检查纯净后，向扁瓶中加入蛋白胨水将菌苔洗下，接种液体培养基，置36-37℃通入洁净压缩空气培养36-72小时后，进行纯粹检验，并置2-8℃保存；
在菌液培养阶段，基础培养基中氨氮含量不低于1.6mg/ml，总氮量不低于5.5mg/ml，另外向培养基中加入培养基重量0.003～0.005％的消泡剂，灭菌后按培养基体积的1％-2％接种二级菌种，同时按培养基体积的4％-6％加入浓度为50％的葡萄糖溶液，在36-37℃按照逐步增大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时；在通气培养过程中，根据需要加入浓度为50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总重量的1％-3％，且培养36小时后培养基的pH值为6.9-7.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在菌液培养阶段，所述逐步增大通气量是指：
0～3小时：0.1～0.15m3/L·小时
3～6小时：0.15～0.2m3/L·小时
6～9小时：0.2～0.23m3/L·小时
9～12小时：0.23～0.24m3/L·小时
12～18小时：0.24～0.26m3/L·小时
18～24小时：0.26～0.3m3/L·小时
24～36小时：0.3～0.33m3/L·小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消泡剂为聚醚多元醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洁净压缩空气中尘埃粒径≤0.01μm，脱臭≥99.5％，残油≤0.003ppm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述布氏杆菌病活疫苗为S2株、A19株、M5株或M5-90株。
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