CN104531544A - 一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株，属于分子生物学和微生物学领域。该菌于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株相对于原始菌株细胞壁增厚一倍，能耐受50ng/mL米卡芬净、8％的乙醇、0.4M NaCl和无菌水中饥饿培养24h，模拟自溶实验数据及60h的扫描电镜结果均显示重组菌株的自溶性能明显优于原始菌株。本发明为更好地控制和利用酵母自溶现象提供了新思路，获得的菌株在改善啤酒风味、泡沫稳定性等品质方面有着很好的应用价值。

Description

一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株
技术领域
本发明涉及一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株，属于分子生物学和微生物学领域。
背景技术
酵母是最为重要的工业微生物之一，尤其在啤酒生产领域，被誉为啤酒生产的灵魂。然而近年来，酵母在啤酒生产的过程中，伴随着自然老化所发生的酵母自溶现象严重的影响了啤酒的风味稳定性、泡沫稳定性等品质，因此改善酵母的自溶性能是啤酒生产领域一个亟待解决的问题。
目前，针对防止酵母自溶的问题的研究多数集中于改善啤酒生产工艺，少数通过优化菌种来改善。由于技术和条件的限制，人们对酵母自溶机理的认识并不透彻，使得目前的这些解决方案往往无法从根本上解决问题。
本发明针对1,3-β-葡聚糖，通过过表达该物质的合成基因fks1来增加葡聚糖的合成量，改变细胞壁的厚度，从而改善酵母菌的自溶性能。本发明证明可以通过改变葡聚糖的含量来调控酵母的自溶，该方法为更好的控制和利用酵母自溶现象提供了新思路，获得的菌株在改善啤酒品质方面有着很好的应用价值。
发明内容
本发明首先提供了一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
TEM切片分析、抗逆性分析、模拟自溶实验及SEM分析结果表明，本发明提供的酿酒酵母相比野生菌，抗自溶的性能明显提高，且能耐受50ng/mL米卡芬净、8％的乙醇、0.4M NaCl和无菌水中饥饿培养24h。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种增强酿酒酵母抗自溶能力的方法，是通过过表达编码1,3-β-葡聚糖合成酶的基因fks1来增加葡聚糖的合成量，从而改变细胞壁的厚度，改善酵母菌的自溶性能。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种获得所述酿酒酵母CGMCC No.9628的方法，是以酿酒酵母基因组中具有多拷贝数的18SrDNA作为同源重组整合位点，将强启动子PGK1(SEQ ID NO.1)、抗性筛选基因KanMX(SEQ ID NO.2)以及fks1(SEQ ID NO.3)基因连接整合入酵母的基因组，通过G418抗性筛选获得阳性转化子。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：(1)扩增酿酒酵母基因组中的18SrDNA-上游、18SrDNA-下游、PGK1及fks1，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片段；(2)将获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与pMD-19T载体连接，最终通过双酶切获得目的片段；(3)采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整合入酵母基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选阳性转化子。
通过TEM切片分析、抗逆性分析、模拟自溶实验及SEM分析，本发明的酿酒酵母CGMCCNo.9628的抗自溶的性能明显优于原始菌株，结果如图3、4、5、6及表1、2所示。与现有其他改善酵母自溶现象的方法相比，本发明建立了1,3-β-葡聚糖含量和酵母自溶性能之间的关系，可从根本上解决酵母自溶的问题。本发明提供的酿酒酵母将能更好地用于啤酒酿造及相关食品行业。
生物材料保藏
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为构建fks1基因过表达质粒的全过程。
图2为采用不同引物对重组菌基因组PCR的电泳结果；A：泳道M为maker2000，泳道1为过表达重组菌，泳道2为野生菌，泳道3为空白对照；B：泳道M为maker2000，泳道1为过表达重组菌CGMCC No.9628，泳道2为野生菌，泳道3为空白对照。
图3为重组菌与野生菌的TEM分析(a、c图为重组菌，放大倍数相同；b、d图为野生菌，放大倍数相同)。
图4为重组菌与野生菌的平板抗逆性分析结果。
图5为重组菌与野生菌的模拟自溶实验结果(选取模拟自溶12h、24h、36h、48h、60h、84h、108h的样品，三角形：过表达重组菌CGMCC No.9628；正方形：野生菌；圆形：敲除重组菌)。
图6为模拟自溶实验过程中重组菌与野生菌的扫描电镜(a、b为野生菌，c、d为重组菌)
具体实施方式
1,3-β-葡聚糖含量的测定方法如下：1.0mol/L氢氧化钠溶液100mL，加入酵母泥5g，在90℃下反应3h。3000g离心15min，沉淀物水洗2次，然后用无水乙醇洗涤后蒸馏水定容。取0.1mL样品+1.9mL蒸馏水+4.0mL刚果红，混匀，于20℃精确保温10min，于550nm测吸光值。以2.0mL蒸馏水+4.0mL刚果红做空白。
β-葡聚糖含量(mg/L)＝A×K×1/v×20
A―试样吸光值；
K―标准曲线上吸光度为1时对应的β-葡聚糖μg数；
v―吸取稀释试样体积的毫升数；
20―试样稀释倍数。
实施例1fks1基因过表达质粒的构建
以酿酒酵母模式菌株W303(模式菌株)为宿主菌，提取其基因组，通过PCR扩增所需片段：18SrDNA-up、18SrDNA-down、PGK1及fks1，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片段。将获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与pMD-19T vector连接，最终通过双酶切获得目的片段。分子操作全过程如图1所示。
实施例2重组酵母菌的构建与验证
采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整合入酵母基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选转化子。结果如图2所示。提取转化子基因组，设计引物1、2来筛选验证阳性转化子，其中引物1截取18SrDNA中间部分作为上游引物，PGK1中间位置作为下游引物，若扩增成功则有1270bp；引物2截取KanMX与18SrDNA各自中间位置作为上下游引物，若成功则有975bp条带。
所得阳性转化子于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3重组菌株TEM分析
为了直观的观察菌株的细胞壁变化，重组菌与野生菌细胞的切片在透射电镜下进行了观察。图3显示重组菌的细胞壁较野生菌明显增厚。经计算，野生菌的细胞壁厚度约200nm，重组菌CGMCC No.9628的约为500nm，是野生菌的两倍之多。细胞壁厚度的增加源于1,3-β-葡聚糖含量的积累，重组菌CGMCC No.9628细胞壁中的1,3-β-葡聚糖的含量较野生菌提高了62.51％，该结果证明了基因过表达方法的良好效果。
实施例4重组菌株抗逆性分析
在啤酒的生产过程中，酵母会受到来自于环境的各种压力，溶氧、渗透压、高乙醇浓度、饥饿压力等。为检验菌株的抗逆性，首先将重组菌CGMCC No.9628与野生菌分别在28℃下于YPD液体培养基中培养20h，然后离心收集细胞，用0.9％的生理盐水将菌浓调节至OD＝1.0。最后采用10倍稀释梯度的方式点种于含有适当浓度的乙醇、NaCl、米卡芬净的YPD平板。培养结果如图4所示。表明重组菌对环境的各种压力条件有着更高的抵抗能力。这种表象和菌株细胞壁的葡聚糖成分增加有着直接的联系，也从侧面证明了该过表达方法的有效性。
实施例5重组菌株模拟自溶实验及SEM分析
模拟自溶实验是评价酵母自溶性能的最直接依据。将酵母在0.1mol/L柠檬酸缓冲液(1L:10.507g柠檬酸+14.705g柠檬酸钠)即模拟自溶液中于150rpm条件下28℃培养，定期取样，测定样品的酵母细胞死亡率及A260/A280，这两组数据分别反映了不同菌株的生长状况，同时也可以作为评价酵母自溶性能的辅证，结果见表1、2(表中W303代表出发菌株，Fks1-KT代表过表达fks1的菌株，Fks1-QT为将fks1基因敲除后的酿酒酵母菌株)。然而，最重要的指标是两者的比值，即(A260/A280)/酵母细胞死亡率，随着酵母自溶程度的增加，该比值逐渐减小，如图5所示，重组菌CGMCC No.9628的A260/A280高于野生菌及敲除了fks1的菌种，重组菌的自溶性能，也就是抗自溶的能力明显优于野生菌。同时，实验中选取模拟自溶60h的酵母细胞进行SEM观察，结果如图6所示，重组菌CGMCC No.9628生长状况良好，抗自溶性能明显优于原始菌株，该结果表明已成功构建一株抗自溶性能良好的酵母菌株。Fks1-QT为将fks1基因敲除后获得的酿酒酵母菌株，通过三者的对比更能说明问题。
模拟自溶实验方法如下：1)酵母细胞死亡率的测定：定时对自溶液取样，适当稀释后与等量0.1％美蓝染色液混匀染色5min后加到血球计数板上镜检，蓝色为死细胞无色为活细胞，记录细胞总数和死细胞数，酵母死亡率＝死细胞数/细胞总数*100％；2)A260和A280的测定与比值计算：取一定量的缓冲液过滤分别测滤液在260nm和280nm处的分光光度值，计算A260/A280比值，DNA纯品的A260/A280为1.8，若比值高则说明含有RNA，比值低说明有残余蛋白质的存在。
表1 不同菌株在模拟自溶液中死亡率随时间的变化
表2 不同菌株在模拟自溶液中A260/A280随时间的变化
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.一种获得权利要求1所述酿酒酵母CGMCC No.9628的方法，其特征在于，是以酿酒酵母基因组中具有多拷贝数的18SrDNA作为同源重组整合位点，将强启动子PGK1、抗性筛选基因KanMX以及fks1基因连接整合入酵母的基因组，通过G418抗性筛选获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：(1)扩增酿酒酵母基因组中的18SrDNA上下游的基因、PGK1及fks1，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片段；(2)将获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与pMD-19T载体连接，最终通过双酶切获得目的片段；(3)采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整合入酵母基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选阳性转化子。
4.一种增强酿酒酵母抗自溶能力的方法，其特征在于，是通过过表达编码1,3-β-葡聚糖合成酶的基因fks1来增加葡聚糖的合成量，从而增加细胞壁的厚度，改善酵母菌的抗自溶性能。
5.一种使酿酒酵母细胞壁增厚的方法，其特征在于，是通过过表达编码1,3-β-葡聚糖合成酶的基因fks1来增加葡聚糖的合成量，从而增加细胞壁的厚度。
6.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.9628的应用。
7.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.9628在啤酒酿造中的应用。
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