CN104521745B - 一种d1型细胞质不育强恢复系的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杂交水稻应用领域，特别涉及一种D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，包括以下步骤：以含D1型不育细胞质的恢复系作为母本，与优良恢复系为父本进行杂交得到F1代；选择性状优良的F1代与父本进行回交，得到BC1F1代；选择性状优良的BC1F1代与父本进行回交，得到BC2F1代；这样依次将性状优良的子代与父本进行回交，得到BCnF1代；选择F1代以后的子代进行连续自交，至得到稳定的D1型细胞质不育强恢复系。该选育方法以同质恢复系作为强恢复系的细胞质供体，与优良恢复系杂交，通过回交和杂交得到稳定的D1型细胞质不育强恢复系，该方法可靠有效，极易获得携带多个恢复基因的强恢复率的恢复系。
Description
技术领域
本发明涉及杂交水稻应用领域，具体而言，涉及一种D1型细胞质不育强恢复系的选育方法。
背景技术
70年代我国应用三系法培育杂交水稻获得成功，并在生产上大面积推广种植，实现了我国水稻单产的第二次飞跃。1976-2005年，我国杂交水稻累计种植面积52.5亿亩，增收稻谷约6.5亿吨，因此杂交水稻的发展是提高粮食产量、解决粮食安全问题的重要途径(袁隆平，2008)。三系杂交水稻利用的基础是细胞质雄性不育，自从野败型细胞质雄性不育系被发现与大面积推广应用以来，上世纪70年代到80年代中期，育种家培育出多达60多种细胞质源来源于野败型、云南滇型(Dian I和Dian Ⅱ)、红莲型、冈型、K型和马协型等，尽管细胞质源和败育特点有较大差异，可分为孢子体不育和配子体不育两种类型(朱英国，2000)。其中，云南滇型、包台型和红莲型为配子体不育系，野败型、Dian型、K型和冈型等为孢子体败育类型，大部分的配子体败育恢保关系一致，而大部分孢子体败育类型的恢保关系一致，配子体败育和孢子体败育类型的恢保关系相反。
目前，国际公认细胞质雄性不育类型主要为野败、红莲、包台三种类型，其中前面两种不育细胞质都来源于普通野生稻。20世纪70年代，国内外育种家还利用普通野生稻为细胞质供体培育了其他13种细胞质类型，如崖城野生稻细胞质、田东野生稻细胞质等(朱英国，2000)，因此，从野生稻中挖掘细胞质是培育新型细胞质雄性不育系的一个重要途径。东乡野生稻为多年生野生稻，是迄今为止发现的世界上分布最北的野生稻，被国内外誉为“野生植物大熊猫”(黄依南等，2012)。
上世纪80年代，江西省农科院水稻所利用东乡野生稻作为细胞质供体培育出雄性不育系国际油粘A，但一直没有找到对该新型不育系育性恢复良好的恢复源，因此，没有得到推广和利用。近年来，江西省超级水稻研究发展中心与宜春农科所合作，以东乡野生稻为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，并以D1A为细胞质来源，分别与培矮64、天丰B、K17B、协青早B、II-32B、2454B、岳4B、9311等回交，获得一批新东野不育系。新型东野不育系D1A以及与新型东野不育系D1A杂交得到的新东野不育系，统称为新型东野D1型细胞质不育系。新型东野D1型细胞质不育系为孢子体不育系，分子标记鉴定该不育系不含有已克隆的孢子体不育基因WA352。花粉败育类型为无花粉败育，表现为花药瘦小、白色、部分畸形呈钩状,染色镜检，几乎连典败的花粉粒都检测不到，败育非常彻底，育性极易稳定，且保持谱广，绝大多数栽培品种可为其保持系，只在同质野生稻中找到恢复系，并实现同质野生稻恢复系恢复基因的栽培稻转育，最高恢复率达到85.1％。因此，它的败育特点、分子机理和恢保关系与目前推广的其他不育系完全不同，为一种新型孢子体不育类型，暂命名为D1型败育类型。该不育系的研究及应用推广对于丰富杂交水稻类型，促进杂交水稻的可持续发展具有重要价值。
植物线粒体基因组由于线粒体基因组重组导致植物线粒体基因组序列差异很大，产生了特异的序列，线粒体特异序列可开发出多态性标记用于细胞质、品种及纯度的鉴定。比较分析胡萝卜线粒体基因结构中，发现一个atp6-nad3-rps12序列为新型细胞质雄性不育系DCGMS特异序列区，该序列可开发成标记用于该不育系的鉴定(Lee et al.,2009)。洋葱中发现1个新嵌合基因orf725，利用该基因与cox1的序列特异性设计特异引物可将CMS-T、CMS-C和Normal三种细胞质类型型区分开(Kim et al.,2009)。根据水稻线粒体基因coxIII,cob,atp9,rps3and 18SrRNA的特异序列开发的CAPS标记可用于水稻雄性不育系Pusa6A的种子纯度鉴定(Umakanta et al.,2010)。通过比较水稻CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、N和Nipponbare线粒体基因组获得57个大小在102-5745bp的线粒体基因组特异序列，这些特异序列占到水稻线粒体基因组14.5％，通过比较分析获得了3个在所分析的14个不育系中均能扩出条带的分子标记，3个在所分析的7个配子体不育系均能扩出条带的分子标记，9个在所分析的7个孢子体不育系均能扩出条带的分子标记，该类型的特异标记可用于孢子体不育系和配子体不育系的鉴定(xie et al.,2014)。
杂交选育恢复系是目前恢复系选育的一种常用方法，一般是选择两个或多个都携带恢复基因的材料杂交、回交、自交选育成新恢复系，或者选择携带恢复基因的材料与没有恢复基因材料杂交、回交和自交，高代选单株测恢选择恢复率强的单株获得新强恢复系。前者，不需要担心恢复的问题，获得的杂交后代都能正常的恢复不育系，后者则需要通过测恢鉴定杂交后代的恢复度。D1型细胞质不育系为一种新型孢子体不育系，其败育特点、分子机理和恢保关系与目前推广的其他不育系完全不一样，本研究团队经过多年研究表明，该不育系存在多个主效恢复基因，同时还有几个微效恢复基因起调控作用，由于恢复基因多，恢复基因和不育基因的作用模式复杂，导致杂交组合F2的恢复度在0％-85.1％之间，绝大部分单株的育性低于70％，无法作恢复系用；另外，D1型不育只在同质野生稻鉴定到恢复源，恢复谱比较窄，绝大部分水稻品种对它都是保持系，特别是优良的栽培品种都是其保持系。因此，获得优良的D1型不育的新强恢复系必须通过携带恢复基因的材料与没有恢复基因优良栽培材料杂交、回交和自交，但由于杂交导致的染色体重组，携带多个恢复基因的强恢复系(恢复率大于80％)株系较少，如果选单株分别去测恢，工作量非常的大，而且效果又不好，极难获得育性高，综合农艺性状又好的恢复系候选株系。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，该方法可靠有效，极易获得携带多个恢复基因的强恢复率的恢复系。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，包括以下步骤：
以含D1型不育细胞质的恢复系作为母本，与优良恢复系为父本进行杂交，得到F1代；
选择性状优良的F1代与父本进行回交，得到BC1F1代；
选择性状优良的BC1F1代与父本进行回交，得到BC2F1代；
这样依次将性状优良的子代与父本进行回交，得到BCnF1代；
选择F1代以后的子代进行连续自交，至得到稳定的D1型细胞质不育强恢复系。
本发明提供的D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，以同质恢复系作为强恢复系的细胞质供体，与优良恢复系杂交，得到的F1代，将F1代与父本回交，再选择具有育性的、性状优良的子代与父本进行回交，每个子代经回交后，得到的株系只要育性正常，均是D1型强恢复系选育的目标单株，不需要测恢鉴定恢复率，只要考虑其他农艺性状；然后再通过将回交得到的株系进行自交，至得到稳定的D1型细胞质不育强恢复系。该方法可靠有效，极易获得携带多个恢复基因的强恢复率的恢复系。
优选地，所述含D1型不育细胞质的恢复系为DR2、DR3、DR5中的任一种。DR2、DR3、DR5具体见申请号201410190251所述，这三种株系的可育花粉率、结实率均较高，利于获得强恢复系。
更优选地，所述含D1型不育细胞质的恢复系为DR5。DR5的自然结实率达到85％以上，是一种具有高恢复度的D1型细胞质的恢复系。
优选地，所述父本为优良恢复系9311或优良恢复系华占。经验证，父本为优良恢复系9311或优良恢复系华占，与含D1型不育细胞质的恢复系作为母本进行杂交，易于积累D1型细胞质的恢复系的主效恢复基因，最终得到的D1型细胞质不育强恢复系综合农艺性状更为优良。
进一步地，所述性状优良为育性高，株型好的株系。通过挑选性状优良的株系进行回交，利于积累D1型细胞质的恢复系的主效恢复基因，从而获得D1型细胞质不育强恢复系。
进一步地，性状优良的株系还进行了分子鉴定，选择含D1型不育细胞质的株系。通过分子鉴定，进一步确定用于回交或自交的株系含有D1型细胞质，节约程序，并保证D1型细胞质的恢复系的主效恢复基因的积累，从而获得D1型细胞质不育强恢复系。
优选地，所述分子鉴定采用PCR进行，所述PCR采用的引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种；
其中，所述引物DM-1为：
F：5’-GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3’
R：5’-CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3’；
所述引物DM-2为：
F：5’-CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3’
R：5’-CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3’；
所述引物DM-3为：
F：5’-ACTTCTACGGCCTTACGA-3’
R：5’-GTGGACCTGGGATGACTA-3’。
采用这三个引物进行基因扩增，特异性强，得到的产物条带清晰，能快速、准确、高效、灵敏地检测出所测株系是否含有D1型不育细胞质；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
优选地，所述PCR采用的模板为鉴定株系的总基因组。本发明提供的各引物扩增的基因序列均为线粒体特异性的基因序列，但是，提取线粒体基因组需要的原料多，提取过程复杂。而本发明选用的这三对引物均为不育线粒体特异性强的标记，以提取含D1型不育细胞质的总基因组为模板进行PCR即可得到清晰条带，很好的满足鉴定的要求，简便易行。
为了减少杂质基因序列的影响，得到的条带更单一和清晰，并且易于提取得到所测株系的总基因组，优选地，所述总基因组的提取材料为所述鉴定株系生长为两叶一心的幼苗。
优选地，PCR体系中，所述模板的终浓度为8-15ng/μl。经验证，该浓度的模板得到的PCR产物条带清晰，很好的满足了鉴定的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，是以含东乡野生稻D1型不育细胞质的恢复系亲本为母本，与其他强恢复系亲本杂交、回交和自交，在连续自交后代中选育出高育性的强恢复系，该方法方便快捷准确有效；
(2)在选育的过程中结合线粒体特异分子标记辅助选择，可加快D1型强恢复系的选育，促进D1型杂交组合的大面积推广应用；
(3)本发明通过特定选用优良恢复系9311或优良恢复系华占作为父本，并与具有高恢复度的含D1型不育细胞质的恢复系作为母本进行杂交，易于积累D1型细胞质的恢复系的主效恢复基因，最终得到的D1型细胞质不育强恢复系性能更为优良。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中不同系别的水稻的PCR扩增产物电泳图；
图2为本发明实施例2中提及的D1型细胞质不育强恢复系的选育方法示意图；
图3为本发明实施例2中引物DM-1对DR5/9311杂交的BC2F2群体部分单株扩增电泳图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
A、D1型细胞质不育系D1A线粒体特异序列的鉴定
提取新型东野D1型细胞质不育系D1A线粒体DNA，完成D1A线粒体全基因组的测序，分别以D1A线粒体基因组与已测序的水稻线粒体基因组WA-CMS、LD-CMS、CW-CMS、N、Nipponbare、RT98C比对分析，获得大于300bp新型东野不育系特异序列13条，其中，完全为新型东野不育系D1A线粒体特异的5条，其长度分别为5797bp、3858bp、532bp、333bp和1623bp。
B、新型东野不育系D1A线粒体特异分子标记筛选
(1)代表性水稻细胞质雄性不育系和保持系材料：分别是红莲型不育系粤泰A、保持系粤泰B；包台型不育系包源A及保持系包源B；滇型不育系楚粳23A及保持系楚粳23B；野败型不育系珍汕97A及保持系珍汕97B；马协型不育系马协A及保持系马协B；矮败型不育系协青早A及保持系协青早B；K型不育系K17A及保持系K17B；印水型不育系Ⅱ-32A及保持系Ⅱ-32B；冈型不育系G46A及保持系G46B，以及本研究组已培育出的D1型不育系D1A、DPA、DTA及其保持系D1B、培矮64、天丰B，其中红莲型、包台型、滇型为配子体不育系，野败型、马协型、印水型、K型、冈型、矮败型、新东野型为孢子体不育。每个材料取生长至两叶一心幼苗0.5克装入EP管中，在震荡打样机打碎，CTAB法提取总DNA，参照冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
(2)线粒体特异标记PCR扩增体系：
标准的PCR扩增反应体系为20μl，组成如下：
10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl21.6μl，25μM dNTP 1μl，1U/μl Taq酶0.8μl，10pM的引物F 1μl，10pM的引物R 1μl，160-300ng/μl总DNA 1μl，补去离子无菌水至20μl，加矿物油覆盖。PCR程序如下：94℃预变性5min；32循环:94℃30sec,52℃30sec,72℃1min；72℃10min；4℃保藏；
其中，根据获得的D1型不育细胞质线粒体特异的5条基因序列，设计PCR引物，每个特异序列设计一对引物。PCR引物及其参数如表1所示。
表1 D1型不育细胞质线粒体特异标记引物序列
以5对D1型不育细胞质线粒体特异标记引物序列为扩增引物对18个代表性水稻不育系以及本研究组培育的D1型细胞质不育系D1A、DPA、DTA及其保持系D1B、培矮64、天丰B进行PCR扩增；同时，以actin引物扩增为阳性对照。将PCR产物进行电泳，结果如图1所示。
从图1可以看出，以actin引物扩增为阳性对照均扩增出对应条带，说明提取的DNA质量没有问题。PCR结果表明，分子标记引物DM-1、DM-2、DM-3只在新型东野不育系D1A、新型东野不育系D1A的杂合体DPA、新型东野不育系D1A的杂合体DTA均能扩增出对应条带，而其保持系和其他水稻不育系及相应的保持系均未扩增出条带，说明这3个标记为新型东野不育系D1A及其杂合体所特异的分子标记；由于D1A、DPA和DTA的细胞质都是一样的，均来自东野，即它们的线粒体组型都一样，但是细胞核核不一样，因此，该标记序列为不育系线粒体基因组所特异，核基因组没有该序列。
而分子标记引物DM-4和DM-5在D1A、DPA、DTA和红莲型不育系粤泰A均能扩增出条带，其他材料均无扩增带，说明这两个分子标记引物为新型东野不育系D1A及其杂合体和红莲型不育系所共有的线粒体特异分子标记，利用这两个标记和前面3个完全为D1型不育系所特异的标记可用于红莲型不育系的鉴定。
此外，为了进一步验证筛选出的D1型细胞质不育系线粒体特异序列及标记的特异性，随机选取120个水稻品种，包括80个亚洲栽培稻品种、40个普通野生稻，提取DNA，分别用DM-1、DM-2和DM-3进行PCR扩增，电泳结果表明，3对引物都没有在任何材料扩增出对应条带。进一步证明了获得的3个D1型不育系线粒体特异序列及标记的具有D1型不育系特异性。
将DR2、DR3、DR5分别提取DNA，分别用DM-1、DM-2和DM-3进行PCR扩增，电泳结果表明，3对引物均稳定扩增出对应条带。
实施例2
1、杂交亲本的选择及杂交与回交；
以含D1型不育细胞质的高恢复度(自然结实率为85.1％)的恢复系DR5为母本，分别与优良恢复系9311、华占杂交，获得杂交F1代；将F1代以及父本和母本分别测定套袋结实率和自然结实率，具体如表2所示。
表2 亲本DR5、9311、华占及杂交F1代育性统计
| 杂交亲本及组合 | 世代 | 套袋结实率(％) | 自然结实率(％) |
| DR5/9311 | F1 | 63.4±3.2 | 85.9±3.6 |
| DR5/华占 | F1 | 56.1±4.3 | 83.7±2.4 |
| DR5 | 母本 | 57.2±3.6 | 85.1±2.9 |
| 9311 | 父本 | 72.6±4.9 | 90.3±3.1 |
| 华占 | 父本 | 68.4±2.5 | 92.6±3.5 |
从表2可以看出，杂交F1代的自然结实率都超过了80％，略低两个杂交父本。
2、将F1代单株再分别与各自的父本回交，每个获得200株的BC1F1群体。具体杂交图见图2所示。在200株的BC1F1回交群体选育性高(自然结实率>75％)、综合农艺性状好的单株继续回交获得BC2F1，选育性高、综合农艺性状好的单株根据需要回交n代。田间取摘取叶片0.5克装入EP管中，在震荡打样机打碎，CTAB法提取总DNA，参照冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
以特异标记引物DM-1对选择的优良株系DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系以及程序同实施例1。PCR扩增的产物进行电泳，得到的结果如图3所示。
扩增均以ddH2O为扩增模板的PCR为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果可靠，无污染；在引物DM-1扩增中，能扩增出对应大小带型的株系为强恢复系的目标株系，而没有扩增出条带的为混杂株系，淘汰该株系。
3、自交选择
选择子代开始自交选择：将BCnF1(n>1)中选出的强恢复系的目标株系进行自交，自交群体中选育性高、综合农艺性状的单株通过分子标记鉴定，获得目标株系，该目标株系子代每个种植100株的小群体，结合分子标记鉴定选单株，经多次自交选择筛选出稳定强恢复系的目标株系。
按照2中的方法在BCnF1(n>1)自交群体中，同样选育性高、综合农艺性状的单株，通过分子标记鉴定，筛选强恢复系的目标株系，回交代数可根据育种的需要调整。
4、强恢复株系验证
在DR5/9311和DR5/华占杂交的BC2F3代群体中的分别挑选出4个和5个优良恢复系株系与优良D1型不育系D1A进行测配分析，结果如表2所示。
表3 DR5/9311和DR5/华占杂交的BC2F3代优良株系测配统计
| 测配组合 | 测配恢复株系 | 套袋结实率(％) | 自然结实率(％) |
| D1A/1 | DR5/9311 | 68.7±3.2 | 84.1±5.2 |
| D1A/2 | DR5/9311 | 71.3±6.0 | 86.4±4.6 |
| D1A/3 | DR5/9311 | 50.2±3.7 | 71.5±3.2 |
| D1A/4 | DR5/9311 | 66.8±1.9 | 81.6±3.7 |
| D1A/5 | DR5/华占 | 74.6±3.1 | 87.3±2.5 |
| D1A/6 | DR5/华占 | 65.4±3.5 | 82.3±3.9 |
| D1A/7 | DR5/华占 | 73.4±5.1 | 89.1±2.8 |
| D1A/8 | DR5/华占 | 65.2±5.2 | 82.6±3.4 |
| D1A/9 | DR5/华占 | 74.5±2.2 | 85.4±3.4 |
从表3可以看出，测配的杂交组合除DR5/9311杂交中的一个株系的育性低于80％外，其余组合的自然结实率均大于80％，符合强恢复系的育性要求，且多个杂交组合的结实率在85％以上，株叶形态好，米质优，理论产量高，为候选强杂交组合。因此，测配的结果表明本方法可靠有效。
本发明提供一个全新的D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，是一种准确、快速选育出优良D1型细胞质不育强恢复系的非常有效的途径，极大丰富水稻杂种优势利用方法。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (7)
1.一种D1型细胞质不育强恢复系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
以含D1型不育细胞质的恢复系DR5作为母本，与优良恢复系为父本进行杂交，得到F1代；
选择性状优良的F1代与父本进行回交，得到BC1F1代；
选择性状优良的BC1F1代与父本进行回交，得到BC2F1代；
这样依次将性状优良的子代与父本进行回交，得到BCnF1代；
将回交得到的BCnF1代进行连续自交，n≥1，至得到稳定的D1型细胞质不育强恢复系；
所述父本为优良恢复系9311或优良恢复系华占。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述性状优良为育性高，株型好的株系。
3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，性状优良的株系还进行了分子鉴定，选择含D1型不育细胞质的株系。
4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，所述分子鉴定采用PCR进行，所述PCR采用的引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种；
其中，所述引物DM-1为：
F：5’-GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3’
R：5’-CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3’；
所述引物DM-2为：
F：5’-CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3’
R：5’-CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3’；
所述引物DM-3为：
F：5’-ACTTCTACGGCCTTACGA-3’
R：5’-GTGGACCTGGGATGACTA-3’。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，所述PCR采用的模板为鉴定株系的总基因组。
6.根据权利要求5所述的选育方法，其特征在于，所述总基因组的提取材料为所述鉴定株系生长为两叶一心的幼苗。
7.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，PCR体系中，所用模板的终浓度为8-15ng/μl。
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