CN103947541B - 一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻利用领域，尤其是水稻细胞质雄性不育系的选育方法。该方法包括：以东乡野生水稻为母本，分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；将第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行杂交，得到第二杂交子代；在第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代；将第三杂交子代作为父本，以雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系。本发明提供的水稻细胞质雄性不育系的选育方法，获得水稻细胞质雄性不育系根据其所具有的不同败育类型以及特点可以应用到水稻优良品种的选育中，使其杂种优势得到有效的利用和体现。

Description

一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法

技术领域

本发明涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法。

背景技术

三系杂交水稻利用的基础是细胞质雄性不育，自从野败型细胞质雄性不育系被发现并大面积推广应用以来，上世纪70年代到80年代中期，多达60多种细胞质源来源于野败型、云南滇型(Dian I和Dian Ⅱ)、红莲型、冈型、K型和马协型等。依据细胞质源和败育特点存在的差异，细胞质雄性不育系可分为孢子体不育和配子体不育两种类型。其中，云南滇型、包台型和红莲型为配子体不育系，野败型、D型、K型和冈型等为孢子体败育类型。

我国应用三系法培育杂交水稻获得成功，并在生产上大面积推广种植，实现了我国水稻单产的第二次飞跃。1976-2005年，我国杂交水稻累计种植面积52.5亿亩，增收稻谷约6.5亿吨。因此，发展杂交水稻是提高粮食产量、解决粮食安全问题的重要途径。

在相关技术中，东乡野生稻为多年生野生稻，是迄今为止发现的世界上分布最北的野生稻，被国内外誉为“野生植物大熊猫”。东乡野生稻具有特殊的强耐冷基因和丰富的抗病虫基因，利用价值极高。

但是，在相关技术中，将其与通过杂交并进行水稻细胞质雄性不育系的选育的工作开展较少，进而限制了其杂种优势的有效利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法，包括以下步骤：

以东乡野生水稻为母本，分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；其中，所述第一水稻品种包括：红优早籼、837、81-417或73-07；

将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行杂交，得到第二杂交子代；其中，所述第二水稻品种包括：红410或HA79317-7；

在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代；其中，所述第三水稻品种包括：B11、B51、培矮64、R4005或3037；

将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系。

本发明的实施例中提供的水稻细胞质雄性不育系的选育方法，其以东乡野生水稻为母本分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；

将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行回交，得到第二杂交子代；在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代；将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系，这样，通过将东乡野生水稻与多种栽培稻品种进行多次杂交之后获得了水稻细胞质雄性不育系，获得的水稻细胞质雄性不育系根据是败育特点可以分为典败类型以及无花粉类型，东乡野生水稻优良的耐性以及抗病虫性其可以稳定的遗传到水稻细胞质雄性不育系中，并且体现出杂种优势。而获得的水稻细胞质雄性不育系可以通过与常见的保持系或者特定筛选的恢复系再度杂交进而用于优良水稻品种的选育中，并可进行大面积的推广应用。

因此，本发明实施例提供的这种方法，其以东乡野生水稻作为基础，通过与多个栽培稻品种杂交的方式获得水稻细胞质雄性不育系，获得水稻细胞质雄性不育系根据其所具有的不同败育类型以及特点可以应用到水稻优良品种的选育中，使其杂种优势得到有效的利用和体现。

此外，通过本发明实施例提供的这种方法获得的获得水稻细胞质雄性不育系，其极大丰富了水稻细胞质不育类型，为水稻优良品种的选育以及水稻核质互作机理方面提供了新的极佳研究材料。

可选的，所述第一水稻品种为：73-07；所述第三水稻品种为：R4005。

可选的，在所述以东乡野生水稻为母本，分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代的步骤中，所述杂交具体包括：

将所述东乡野生水稻的雄蕊去除，15-20小时后，将所述第一水稻品种的花粉授在去除雄蕊后的所述东乡野生水稻的雌蕊上，并在花朵上套设牛皮纸袋。

可选的，在所述将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系的步骤之后，还包括：

根据配子体不育基因orf(H)79和孢子体不育基因WA352依次设计第一引物和第二引物；

分别以所述水稻细胞质雄性不育系、红莲型不育系粤泰A和滇型不育系楚粳23A的总DNA作为模板，用所述第一引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测；

分别以所述水稻细胞质雄性不育系、珍汕97A、冈46A、协青早A的总DNA为模板，用所述第二引物作为进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测。

可选的，

所述第一引物的序列为：

GAGGAGCCGAAGATTTTAG

TTACTTAGGAAAGACTACAC；

所述第二引物的序列为：

ATGACGAGAGATAGAATGAG

CTAGGAGGCTGAGTTTTG。

可选的，在所述将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系的步骤之后，还包括：

以所述水稻细胞质雄性不育系作为细胞质供体，分别与保持系Ⅱ-32B、岳4B、K17B和荣丰B杂交，得到雄性不育的F1代，将所述F1代进行连续回交，获得物无花粉型的水稻细胞质雄性不育系。

可选的，在所述将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系的步骤之后，还包括：

以所述东乡野生水稻为父本，与栽培稻M1256杂交，得到第一杂种；将所述第一杂种与爱红1号杂交，得到第二杂种；

所述第二杂种并经过多代回交和自交，获得了多个稳定株系；

将多个所述稳定株系分别与水稻细胞质雄性不育系进行测交，根据测交后代的自然结实率筛选出能够使所述水稻细胞质雄性不育系自然可育的恢复系。

可选的，所述在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代的步骤中，所述分离出雄性不育株具体包括：

在第二杂交子代的植株中，取当日要开的颖花，用1％的I2-KI溶液染色，镜检着色花粉粒；同时，计算所述植株3个穗的自然结实率和套袋结实率；

挑选出自然结实率在5％以下、套袋结实率为0、着色花粉粒占总花粉数5％以下的植株，得到雄性不育株。

附图说明

图1示出了本发明实施例一提供的水稻细胞质雄性不育系的选育方法的流程图；

图2示出了本发明实施例二中配子体不育基因orf(H)79对D1A、红莲型不育系粤泰A和滇型不育系楚粳23A总DNA PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；

图3示出了本发明实施例三中野败型不育基因WA352引物对孢子体不育系珍汕97A、冈46A、协青早A和D1A总DNAPCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；

图4示出了本发明实施例三中获得的不育系D1A与协青早A花粉KI-I2染色图；

图5示出了本发明实施例四中筛选获得的5株恢复系对不育系D1A的恢复结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

在本发明的实施例中提供了一种水稻细胞质雄性不育系的选育方法，包括以下步骤，请参考图1：

步骤101：以东乡野生水稻为母本，分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；

其中，所述第一水稻品种包括：红优早籼、837、81-417或73-07。

红优早籼、837、81-417或73-07均为较为优良的水稻栽培种，其与东乡野生水稻杂交获得的后代可以，可以继承双亲优良性状的同时还可以较好的体现出杂种优势，进而为后续的选育工作提供保障。

步骤102：将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行杂交，得到第二杂交子代；

在步骤102中，所述第一水稻品种包括：红410或HA79317-7；第一杂交子代继续与第二水稻品种进行杂交，获得第二杂交子代。

步骤103：在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代。

其中，所述第三水稻品种包括：B11、B51、培矮64、R4005或3037；

由于B11、B51、培矮64、R4005、3037等属于较适宜在我国南方种植的栽培种，因此，将其与适栽范围较大的野生东乡水稻来源的杂种杂交可以获得适宜南方栽培的雄性不育系。

步骤104：将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系。

第三杂交子代均表现为完全雄性不育，再选株成对回交，经多代核置换，即可转育成多个不育系。主要为两种类型，与B11杂交获得的不育系为典败类型。其余杂交为无花粉类型，表现为花药瘦小、白色、部分畸形呈钩状，染色镜检，仅含稀少典败花粉。需要指出的是，东野/73-07//R4005经多代回交选择，败育彻底，为完全无花粉类型(图1)，是一种非常典型的水稻细胞质雄性不育系，其可以很好的用于水稻优良品种的选育中。

本发明的实施例中提供的水稻细胞质雄性不育系的选育方法，其以东乡野生水稻为母本分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；

将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行回交，得到第二杂交子代；在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代；将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系，这样，通过将东乡野生水稻与多种栽培水稻品种进行多次杂交之后获得了水稻细胞质雄性不育系，获得的水稻细胞质雄性不育系根据是败育特点可以分为典败类型以及无花粉类型，东乡野生水稻优良的耐性以及抗病虫性其可以稳定的遗传到水稻细胞质雄性不育系中，并且体现出杂种优势。而获得的水稻细胞质雄性不育系可以通过与常见的保持系或者特定筛选的恢复系再度杂交进而用于优良水稻品种的选育中，并可进行大面积的推广应用。

因此，本发明实施例提供的这种方法，其以东乡野生水稻作为基础，通过与多个栽培水稻品种杂交的方式获得水稻细胞质雄性不育系，获得水稻细胞质雄性不育系根据其所具有的不同败育类型以及特点可以应用到水稻优良品种的选育中，使其杂种优势得到有效的利用和体现。

接下来，为了使得本发明实施例一的水稻细胞质雄性不育系的选育方法得到更好的应用，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是实施例一的水稻细胞质雄性不育系的选育方法的进一步限定和增加，现做详细的阐述和解释：

实施例二

本实施例的水稻细胞质雄性不育系的选育方法包括以下步骤：

1、以东乡野生水稻为母本，与73-07进行杂交，得到第一杂交子代；

具体的，在上述步骤中，杂交的操作按照以下操作进行：将所述东乡野生水稻的雄蕊去除，15-20小时后，将所述第一水稻品种的花粉授在去除雄蕊后的所述东乡野生水稻的雌蕊上，并在花朵上套设牛皮纸袋。

2、将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行杂交，得到第二杂交子代；其中，所述第二水稻品种包括：红410或HA79317-7；

3、在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，与R4005进行杂交，得到第三杂交子代。

4、将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系。

在本实施例中，具体的，通过将东乡野生水稻与特定水稻品种杂交，即东野/73-07//R4005进而获得一种新的水稻细胞质雄性不育系，在本发明中，将该不育系命名为D1A。

通过研究发现，D1A败育彻底，为完全无花粉类型，且该不育系与野败型、红莲型和滇型恢复系测交F1代完全不育，所以D1A为一种与现有技术中推广应用的其他细胞质败育类型均不一样的不育败育类型，极大丰富了水稻细胞质不育类型。

5、根据配子体不育基因orf(H)79和孢子体不育基因WA352依次设计第一引物和第二引物；

在该步骤中，具体的，第一引物和第二引物的序列请参考表1：

表1不育基因orf(H)79和WA352检测引物序列信息

6、分别以所述水稻细胞质雄性不育系、红莲型不育系粤泰A和滇型不育系楚粳23A的总DNA作为模板，用所述第一引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测；

在该步骤中，具体的，通过检测得到的目的条带，可以判断D1A是否含有配子体不育基因orf(H)79；如果D1A中含有该基因，则说明该不育系为配子体不育基因orf(H)79导致的不育类型，如果过如果D1A中不含有该基因，则说明该不育系不是配子体不育基因orf(H)79导致的不育类型。

具体的，电泳检测的结果请参考图2，通过附图2可以看出，D1A中不含有配子体不育基因orf(H)79。紧接着，对其进行后续的操作以检测是否含有孢子体不育基因WA352。

7、分别以所述水稻细胞质雄性不育系、珍汕97A、冈46A、协青早A的总DNA为模板，用所述第二引物作为进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测。

在步骤7中，通过检测得到的目的条带，可以判断D1A是否含有孢子体不育基因WA352；如果D1A中含有该基因，则说明该不育系为孢子体不育基因WA352导致的不育类型，如果过如果D1A中不含有该基因，则说明该不育系不是孢子体不育基因WA352导致的不育类型。

电泳检测的结果请参考图3，通过附图3可以看出，D1A中不含有孢子体不育基因WA352，因此该不育系也不属于孢子体不育基因WA352导致的不育类型。

通过上述的操作可知，本实施例获得的D1A其不育类型不属于现有技术中常见的配子体细胞质雄性不育系，也不属于孢子体型细胞质雄性不育系，其是一种新的水稻细胞质雄性不育系。进而丰富了水稻细胞质不育系的类型。为三系杂交水稻的选育提供了极佳的新的材料。

另外，在本发明中，为了实现将上述实施例二提供的D1A应用到水稻杂交组合选育工作中，本发明还提供的以下具体实施例：

实施例三

在本实施例中，在上述实施例二的提供的步骤1-4的基础之上，还包括以下步骤：

以所述水稻细胞质雄性不育系(D1A)作为细胞质供体，分别与保持系Ⅱ-32B、岳4B、K17B和荣丰B杂交，得到雄性不育的F1代，将所述F1代进行连续回交，获得物无花粉型的水稻细胞质雄性不育系。

保持系Ⅱ-32B、岳4B、K17B和荣丰B为目前市面上推广应用的孢子体保持系，D1A通过与多个保持系连续回交选育，可以得到败育彻底的无花粉型的水稻细胞质雄性不育系，进而有效的用于杂交组合的选育中。

请参考图4，图4示出了无花粉型的水稻细胞质雄性不育系(D1A)与协青早A不育系的KI-I2的染色对比图，通过附图可知，本实施例的方法获得的这种不育系D1A是一种无花粉类型的不育系，因此，其败育彻底。

具体的，在该操作中，回交BC3代的花粉育性统计结果请参考表2：

表2不育系D1A与不同孢子体不育保持系回交BC3代的花粉育性统计

当然，在本发明中，为了使得上述实施例二获得的细胞质雄性不育系D1A能够得到推广和应用，使其能够自然结实；需要寻找并建立其恢复系。因此，在本发明中，还提供了与D1A对应的恢复系的筛选方法，请参考以下实施例：

实施例四

在本实施例中，在上述实施例二的提供的步骤1-4的基础之上，还包括以下步骤：

A：以所述东乡野生水稻为父本，与栽培稻M1256杂交，得到第一杂种；将所述第一杂种与爱红1号杂交，得到第二杂种；

B：所述第二杂种并经过多代回交和自交，获得了多个稳定株系；

在上述的步骤中，通过杂交选育的方法，获得了多个稳定的株系，并用于与D1A测交，通过检测测角后代的自然可育性，进而筛选其恢复系。

C：将多个所述稳定株系分别与水稻细胞质雄性不育系进行测交，根据测交后代的自然结实率筛选出能够使所述水稻细胞质雄性不育系自然可育的恢复系。

具体的，多个稳定的株系与D1A测交后，其测交子代大多数为完全不育，仅有5个株系体现出了不同程度的恢复，并依次命名为DR1、DR2、DR3、DR4、DR5；具体的测恢复数据请参考图5，通过图5可以看出：测恢育性最低的DR4，自然结实率为25.5％,而DR5恢复度强，自然结实率达85.1％，具体结果请参考图5。因此，该株系的恢复基因的转育可用于培育D1A类型的强恢复系。

综上，本发明上述实例提供的这种水稻细胞质雄性不育系的选育方法，其得到的水稻细胞质雄性不育系(D1A)，其属于无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，且保持谱广，绝大多数栽培品种可为其保持系，极易获得优良保持系。

通过同质恢复系恢复基因的成功转育，可获得优良恢复系，配制杂交组合，实现新型不育系三系配套，能够用与大面积推广应用，另外，由于其特异的败育特点、恢保关系，可以为水稻核质互作机理研究提供了新的极佳研究材料。

因此，通过上述方法获得的D1A，其鉴定及利用，极大的丰富了杂种优势利用的途径。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种水稻细胞质雄性不育系的恢复系选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

以东乡野生水稻为母本，分别与第一水稻品种杂交，得到第一杂交子代；

所述杂交具体包括：将所述东乡野生水稻的雄蕊去除，15-20小时后，将所述第一水稻品种的花粉授在去除雄蕊后的所述东乡野生水稻的雌蕊上，并在花朵上套设牛皮纸袋。

其中，所述第一水稻品种包括：红优早籼、837、81-417或73-07；

将所述第一杂交子代作为母本，并与第二水稻品种进行杂交，得到第二杂交子代；其中，所述第二水稻品种包括：红410或HA79317-7；

在所述第二杂交子代中分离出雄性不育株，并作为母本，分别与第三水稻品种进行杂交，得到第三杂交子代；

所述分离出雄性不育株的具体操作为：在第二杂交子代的植株中，取当日要开的颖花，用1％的I₂-KI溶液染色，镜检着色花粉粒；同时，计算所述植株3个穗的自然结实率和套袋结实率；

挑选出自然结实率在5％以下、套袋结实率为0、着色花粉粒占总花粉数5％以下的植株，得到雄性不育株。

其中，所述第三水稻品种包括：B11、B51、培矮64、R4005或3037；

将所述第三杂交子代作为父本，以所述雄性不育株作为母本，进行回交，转育成水稻细胞质雄性不育系；

以所述东乡野生水稻为父本，与栽培稻M1256杂交，得到第一杂种；将所述第一杂种与爱红1号杂交，得到第二杂种；

所述第二杂种并经过多代回交和自交，获得了多个稳定株系；

将多个所述稳定株系分别与水稻细胞质雄性不育系进行测交，根据测交后代的自然结实率筛选出能够使所述水稻细胞质雄性不育系自然可育的恢复系。

2.根据权利要求1所述的水稻细胞质雄性不育系的恢复系选育方法，其特征在于；

所述第一水稻品种为：73-07；

所述第三水稻品种为：R4005。