CN104515820A - 一种替加环素中间体的分析检测方法 - Google Patents

一种替加环素中间体的分析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种替加环素中间体的分析检测方法，用于替加环素中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，用10%氨水调节流动相pH值为6.80～7.20，以流速为0.6～1.2mL/min，检测波长为245nm，柱温为25～35℃，进行高效液相色谱法分析检测。本发明的分析检测方法选用普通的色谱柱及液相色谱系统，价格低廉，实用性高，操作简单，可以有效的将替加环素中间体及其杂质分开。

Description

一种替加环素中间体的分析检测方法
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是一种替加环素中间体的分析检测方法。
背景技术
替加环素由美国惠氏公司研究开发，是首个被批准用于临床的静脉内给药的甘氨酰环素类抗生素，其作用机制与四环素类抗生素相似，都是通过与细菌核糖体结合，阻止转移RNA的进入，使得氨基酸无法结合肽链，最终起到阻断细菌蛋白质合成，限制细菌生长的作用，但替加环素与核糖体的结合能力是其他四环素类药物的5倍。
9-氨基米诺环素盐酸盐是合成替加环素的重要中间体，其化学式为C23H28N4O7·HCl，结构式为：
该中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品的质量。专利US2007/0049561A1以及US2009/0099376A1中公开了该中间体的高效液相色谱检测方法，但这些方法采用的色谱柱价格较贵，且方法较为繁琐，在研发及生产中普遍应用的实用性低。所以建立一种使用普通色谱柱及液相系统且操作简单，但稳定有效的分析检测方法对替加环素中间体进行分析检测是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用普通色谱柱及液相系统且操作简单，但稳定有效的替加环素中间体的高效液相色谱分析检测方法，用于替加环素中间体的质量控制。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
一种替加环素中间体的分析检测方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，用10%氨水调节流动相pH值为6.80～7.20，以流速为0.6～1.2mL/min，检测波长为245nm，柱温为25～35℃，进行高效液相色谱法分析检测。
所述色谱柱为C18柱，4.6×250mm，5μm。
所述流动相是0.05mol/L的醋酸铵溶液、N,N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸以及乙二胺四乙酸的混合体系，0.05mol/L的醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸的体积比为50～70:49.8～29.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol。
进一步的，流动相中0.05mol/L的醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸的体积比优选为60:39.8:0.2，流动相的pH值优选为7.02。
所述的流速优选为1.0mL/min，柱温优选为30℃。
与现有技术相比，本发明涉及的分析检测方法，操作简单，耐用性好，选用普通的C18色谱柱，价格低廉，实用性高，而且可以有效的将替加环素中间体及其杂质分开，所得峰形对称性较好，结果稳定可靠，即本发明虽采用成本低廉的普通色谱柱，却取得了意想不到的分析检测效果，从而可以用于替加环素中间体的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。
附图说明
图1实施例1的替加环素中间体HPLC图谱。
图2实施例2的替加环素中间体HPLC图谱。
图3实施例3的替加环素中间体HPLC图谱。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），检测波长245nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，流动相：0.05mol/L醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸=60:39.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol，用10%的氨水调pH值至7.02。
实验步骤：将替加环素中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含替加环素中间体约0.3mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。
附图1表明，在该色谱条件下，替加环素中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，其中替加环素中间体峰的保留时间在16.192min，对称因子1.108。
实施例2
仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），检测波长245nm，柱温30℃，流速0.6mL/min，流动相：0.05mol/L醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸=50:49.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol，用10%的氨水调pH值至7.02。
实验步骤：将替加环素中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含替加环素中间体约0.3mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。
附图2表明，在该色谱条件下，替加环素中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，其中替加环素中间体峰的保留时间在14.611min，对称因子1.088。
实施例3
仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），检测波长245nm，柱温30℃，流速1.2mL/min，流动相：0.05mol/L醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸=70:29.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol，用10%的氨水调pH值至7.02。
实验步骤：将替加环素中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含替加环素中间体约0.3mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。
附图3表明，在该色谱条件下，替加环素中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，其中替加环素中间体峰的保留时间在13.144min，对称因子1.113。
实施例4
系统适应性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算替加环素中间体峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。
表1替加环素中间体系统适用性实验结果
由表1可知，替加环素中间体峰的对称因子为1.12左右，理论板数4800左右，峰面积的相对标准偏差为2.48%，保留时间的相对标准偏差为0.154%。可见，该色谱条件下，替加环素中间体峰峰形较好，所得结果稳定可靠。
实施例5
耐用性实验
仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），检测波长245nm，流动相：0.05mol/L醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸=60:39.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol。
实验步骤：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和流动相pH，记录替加环素中间体含量的变化情况（按面积归一化法计算），实验结果见表2。
表2替加环素中间体耐用性实验结果
由表2可知，改变柱温、流速和流动相pH后，替加环素中间体含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。

Claims (5)

1.一种替加环素中间体的分析检测方法，采用高效液相色谱法进行分析检测，其特征在于：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，用10%氨水调节流动相pH值为6.80～7.20，以流速为0.6～1.2mL/min，检测波长为245nm，柱温为25～35℃，进行高效液相色谱法分析检测；
所述流动相是0.05mol/L的醋酸铵溶液、N,N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸以及乙二胺四乙酸的混合体系，0.05mol/L的醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸的体积比为50～70:49.8～29.8:0.2，每升前三者的混合溶液中含乙二胺四乙酸0.01mol。
2.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述色谱柱为C18柱，4.6×250mm，5μm。
3.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述流动相中0.05mol/L的醋酸铵溶液：N,N-二甲基甲酰胺：三氟乙酸体积比为60:39.8:0.2。
4.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述流动相的pH值为7.02。
5.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述的流动相流速为1.0mL/min，柱温为30℃。
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