CN104480057A - 一株产l-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明构建了基因 alr 的敲除载体，电转到宿主菌中，得到 alr 的缺陷菌株IWJ001Δ alr 。利用PCR扩增基因 fusA ， frr ， ilvBN ， ilvA ， ppnk ，将基因片段连接到过表达载体，然后电转入谷氨酸棒杆菌IWJ001Δ alr 中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌：产L-异亮氨酸基因工程菌IWJ001Δ alr /pJYW-4- fusA - frr - ilvBN-ilvA - ppnk 。本发明构建的产L-异亮氨酸基因工程菌在摇瓶发酵或发酵罐发酵均可提高L-异亮氨酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低L-异亮氨酸生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法，及其提高氨基酸产量的应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。
背景技术
L-异亮氨酸，又称L-异白氨酸，化学名为L-α-氨基-β-甲基戊酸，属于天冬氨酸族非极性、输水性氨基酸的一种。由于在α位和β位具有两个手性碳原子，所以有4种立体异构物，分别为D、L、D别、L别型，存在于自然界并具有生理功效的异亮氨酸只有L型。L-异亮氨酸广泛存在于多种动植物蛋白质中，是常见十八种氨基酸的一种，也是人体八种氨基酸之一，另外由于它与L-亮氨酸、L-缬氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称为支链氨基酸。
L-异亮氨酸作为人体必需的8种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，但体内无法自身合成，成年人每天需要从外界摄取20 mg/kg (体重)的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值。
在食品行业中，L-异亮氨酸可强化某些食品的营养，如小麦粉、麦谷蛋白、花生粉、马铃薯等所含L-异亮氨酸为限制性氨基酸，待强化。L-异亮氨酸与其他氨基酸结合，可改善面包、饼干、软糖、波纹面等食品的形态、性状、色泽、味道、营养。L-异亮氨酸与其他氨基酸配制成氨基酸能量饮料和运动员饮料，有形成肌肉、减轻肌肉疲劳，提高运动员的耐性，促进骨骼肌蛋白的合成速率及减少蛋白的降解速率，利于肌肉恢复。另外，L-异亮氨酸还可制作成生酮饮食治疗癫痫病。
在医药行业中，主要用于配制复方氨基酸输液，包括营养型氨基酸输液、治疗型高支链氨基酸输液及各种口服液制剂，为肝硬化患者提供蛋白和能量，促进冠动脉患者心肌蛋白周转，提高尿毒症患者的食欲和营养，避免营养不良，为间质性肝炎提供蛋白和能源。
在饲料行业中，L-异亮氨酸作为动物营养有着特殊的作用，因此受到研究者的广泛关注。目前，L-异亮氨酸制成饲料添加剂，节省蛋白质饲料，使饲料成分得到利用，提高饲料利用率，从而降低成本。在豆粕型基础日粮中添加L-异亮氨酸，可提高牛的肌肉生长。在猪饲料中添加L-异亮氨酸可提高肥猪对甲硫氨酸的利用。当L-异亮氨酸与其他氨基酸和蛋白一同饲喂奶牛，可提高牛奶中的蛋白含量。在泌乳型母猪的饲料中添加L-异亮氨酸，可改善母猪的采食量和泌乳代谢。在发情期的母羊饲料中添加L-异亮氨酸可提高母羊的排卵率。
在卫生保健行业中，L-异亮氨酸可提高人体的免疫力，促进人体能量的消耗，减少脂肪量，可用于减肥药的配制。通过糖皮质激素来控制血糖，减少中枢性疲劳。另外，L-异亮氨酸对治疗运动型障碍及外伤有一定作用，可减少迟发性运动障碍的症状，治疗伤口，改善受伤导致的认知障碍。
由于L-异亮氨酸的可用领域广泛，并且新的用途被不断发现，大大增加了市场需求量。目前，国内已有厂家进行批量生产L-异亮氨酸，但是这些企业生产的菌株产酸能力低，生产工艺和生产设备落后于日本等国，产量不能满足市场需求。因此，改善菌株生产能力、优化工艺流程、配备先进设备成为我国丞待解决的问题。
在本发明中，我们以L-异亮氨酸生产菌IWJ001为基础，构建了alr基因缺陷宿主菌，并在表达载体pJYW-4上表达了基因簇fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，由于该表达载体上带有alr基因，弥补了宿主菌的alr缺失，因此无需添加抗生素即可保证表达载体在菌体内的稳定存在及组成表达。本发明构建的工程菌提高了L-异亮氨酸产量。
发明内容
本发明的目的是提供一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，本发明构建的工程菌提高了L-异亮氨酸产量。
本发明的技术方案：一株产L-异亮氨酸基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2014529。
通过质粒回补基因组alr基因缺陷，从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能，所述菌株包括alr基因缺陷型表达宿主。
所述表达宿主是被敲除了编码丙氨酸消旋酶的基因alr的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
所述表达宿主是将alr敲除载体转化入谷氨酸棒杆菌，通过同源重组获得的alr缺陷型表达宿主，所述alr敲除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所解决的第一个技术问题是，alr缺陷型表达宿主，其构建方法，主要步骤为：
（1）以C. glutamicum IWJ0001基因组为模板，分别以Alr-S-(+)/(-)及Alr-X-(+)/(-)为引物扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U、alr-D；以pDTW-202（Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, Xiaoqing Hu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）为模板，kan-lox-F/R为引物扩增kan抗性基因片段。alr-U以XhoI、BamHI酶切，alr-D以XbaI及PstI酶切，kan片段以BamHI、XbaI酶切，三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即alr敲除载体，命名为pJXW-1。
（2）将alr敲除载体转化宿主菌，通过同源重组获得alr基因缺陷型表达宿主菌。
本发明要解决的第二个技术问题是在载体pJYW-4表达基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk，主要步骤为：
（1）扩增fusA-frr基因片段：在fusA-frr两端分别引入NotI及NheI酶切位点；将PCR产物fusA-frr片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4，得到重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr；
（2）扩增ilvBN-ilvA-ppnk基因片段，在ilvBN-ilvA-ppnk两端分别引入SfiI及AScI酶切位点；将PCR产物ilvBN-ilvA-ppnk片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4-fusA-frr，得到重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk；
（3）将重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk转入通过alr敲除载体敲除alr基因的谷氨酸棒状杆菌，得基因工程菌IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk。
表达基因fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，其核苷酸序列分别为：fusA为SEQ ID NO.2，frr 为SEQ ID NO.3，ilvA 为SEQ ID NO.4，ilvBN 为SEQ ID NO.5， ppnk 为SEQ ID NO.6。
所述产L-异亮氨酸基因工程菌的应用，发酵产L-异亮氨酸。
本发明的有益效果：该菌株不依赖抗生素抗性即可维持表达载体稳定的存在于谷氨酸棒状杆菌细胞内，利于工业化生产。且能较大幅度提高L-异亮氨酸产量。
生物材料样品保藏：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2014年10月29日，保藏编号：CCTCC NO：M2014529。
附图说明
图1 alr基因敲除载体pJXW-1的构建。
图2表达载体pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk的构建。
图3 菌株摇瓶发酵及氨基酸产量变化示意。
图4 菌株罐上发酵的菌体生长量变化图。
具体实施方式
实施例1 alr敲除载体pJXW-1的构建
以C. glutamicum IWJ001基因组为模板，分别以Alr-S-(+)/(-)及Alr-X-(+)/(-)为引物扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U、alr-D；以pDTW-202（Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, Xiaoqing Hu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）为模板，kan-lox-F/R为引物扩增kan抗性基因片段。alr-U以XhoI、BamHI酶切，alr-D以XbaI及PstI酶切，kan片段以BamHI、XbaI酶切，三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即alr敲除载体，命名为pJXW-1（图2）。
实施例2 表达载体的构建
首先，以质粒pDXW-8-fusA-frr为模板，fusA-F，frr-R为引物，扩增fusA-frr基因片段，在fusA-frr两端分别引入NotI及NheI酶切位点；将PCR产物fusA-frr片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的pJYW-4，完成表达质粒构建pJYW-4-fusA-frr。
以质粒pDXW-8-ilvBN-ilvA-ppnk（Yin L, Zhao J, Chen C, Hu X, Wang X (2014) Enhancing the carbon flux and NADPH supply to increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum.）为模板，ilvBN-F，ppnk-R为引物，扩增ilvBN-ilvA-ppnk基因片段，在ilvBN-ilvA-ppnk两端分别引入SfiI及AscI酶切位点；将PCR产物ilvBN-ilvA-ppnk片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的pJYW-4-fusA-frr，完成表达质粒构建pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk。
然后，将pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk转入IWJ001Δalr，构建基因工程菌株IWJ001Δalr /pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilv A-ppnk。
实施例3 摇瓶发酵
从保藏菌株IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk的甘油管中划取一环菌液在固态活化培养基上划线，30℃培养36 h。利用接种环从活化好的平板上刮取一环菌苔转接到装有25mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min 培养18 h。从培养好的种子液中吸取2.4 mL菌液转接至装有23mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃培养6 h，加入终浓度为1 mM 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达直至发酵结束 (t=72h)。
发酵结束发酵液采用HPLC测定氨基酸含量，利用HPLC OPA (邻苯二甲醛)柱前衍生化法。发酵液12000 r/min离心30 min，上清液转移至一干净EP管中，用5%三氯乙酸稀释20倍 (摇瓶)或40倍 (发酵罐)，室温放置4h，12000 r/min离心30 min，0.22 μm水相针式滤器过滤，此时样品可直接上机检测。色谱柱：Agilent Hypersil ODS 4.0*250mm (5 μm)，柱温：40℃。流动相：水相A：无水乙酸钠 3.01 g，先溶于水，然后加三乙胺 200μL，四氢呋喃 5 mL，ddH2O定容1 L，5%乙酸调节至pH 7.2；有机相B：无水乙酸钠 3.01g，ddH2O定容为200 mL，5%乙酸调节至pH 7.2，然后再加400 mL甲醇(色谱纯)和400 mL乙腈(色谱纯)，流速为1 mL/min。样品跑柱子前需进行柱前衍生，衍生完成的样品进入色谱柱进行梯度洗脱，洗脱程序如下：
| 步骤 | 时间 | %A | %B |
| 1 | 0 | 92 | 8 |
| 2 | 27 | 40 | 60 |
| 3 | 31.5 | 0 | 100 |
| 4 | 32 | 0 | 100 |
| 5 | 34 | 0 | 100 |
| 6 | 35.5 | 92 | 8 |
本实验所用培养基：
活化斜面培养基 (g/L): 胰蛋白胨 10，NaCl 5，酵母提取物 5，葡萄糖5，牛肉浸提物 10，去离子水配制；
种子培养基 (g/L): 葡萄糖 30，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，MgSO4 0.5，玉米浆 30，利用5 M NaOH溶液调节pH 7.0；
发酵培养基 (g/L): 葡萄糖 100，(NH4)2SO4 35，KH2PO4 1，MgSO4 0.5，玉米浆 15，去离子水配制；利用5 M NaOH溶液调节pH 7.0；摇瓶发酵培养添加 20 g/L CaCO3 用于调节pH。
氨基酸产量变化见图3：经72h培养，IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk的异亮氨酸含量为12.4g/L；相同培养条件下，IWJ001Δalr/pJYW-4的L-异亮氨酸产量7.4 g/L，两者相比IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk较IWJ001Δalr/pJYW-4其产量提升67%。
实施例4 罐上发酵
从保藏菌株的甘油管中取一环菌液在固态活化培养基上划线，30℃培养36 h。从活化好的平板上刮取一接种环菌苔接入装有50mL种子培养基的500 mL三角瓶中，30℃200 r/min 培养18 h。将150 mL种子液中转接至装有1.2 L发酵培养基的3 L全自动发酵罐中。利用50%的氨水自动调控pH=7.0，利用冷却循环水和底座加热板自动控制温度为30℃，利用搅拌转速和溶氧偶联，维持溶氧30%，通气速率 (1.5 vvm)。当培养6 h时，加入终浓度为1 mM IPTG诱导蛋白表达。当培养基中的葡萄糖浓度低于 20 g/L时，利用蠕动泵补加一定体积的葡萄糖，维持葡萄糖浓度在20 g/L附近。发酵培养72 h。
IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk的异亮氨酸含量为28.6g/L；相同培养条件下，IWJ001Δalr/pJYW-4的异亮氨酸产量20.3 g/L。两者相比IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk较IWJ001Δalr/pJYW-4其产量提升40.9%。
表1 本发明涉及引物
| 引物名称 | 序列(5'-3') | 酶切位点 |
| alr-S-(+) | ATACTCGAGGTAGCAGACATCGCCGGCCCAG | XhoI |
| alr-S-(-) | ATATCTAGACATGCGCGGGAGAAATAACAGC | XbaI |
| alr-X-(+) | ACAGGATCCTGGACAAGGCACTTCCTATGG | BamHI |
| alr-X-(-) | GGTCTCGAGCAAGATCCAACAAAAGGTTCACT | PstI |
| kan-lox-F | ATGGATCCAATACGACTCACTATAGGGCG | BamHI |
| kan-lox-R | ACCTCTAGAGCGCAATTAACCCTCACTAAAG | XbaI |
| alr-P-(+) | ACGAGATCTCCTTTGTGGTCTGGCATGAAG | BglII |
| alr-P-(-) | CACCTGCAGAGACGTCCAAAATCACCACATCGCCAGCTTC | AatII |
| ilvBN-F | TTGGCGCGCCTGCTTCTGGCGTCAGGC | AscI |
| ppnk-R | TATGGCCGGCGGGGCCTTTTACCCCGCTGACCTGGGAT | SfiI |
| fusA-F | TAGCTAGCAGAAGGAGTAAATCGGTGGCTCAAGAAGTGCTTAAG | NheI |
| frr-R | ATAAGAATGCGGCCGCTATGGCCGGCGGGGCCTTGGCGCGCCCTAGACCTCCATC | NotI |
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<160> 6
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1086
<212> DNA
<213> alr
<400> 1
atgaacttgc tgaccaccaa aattgacctg gatgccatcg cccataacac gagggtgctt 60
aaacaaatgg cgggtccggc gaagctgatg gcggtggtga aggcgaatgc atataaccat 120
ggcgtagaga aggtcgctcc ggttattgct gctcatggtg cggatgcgtt tggtgtggca 180
actcttgcgg aggctatgca gttgcgtgat atcggcatca gccaagaggt tttgtgttgg 240
atttggacac cggagcagga tttccgcgcc gccattgatc gcaatattga tttggctgtt 300
atttctcccg cgcatgccaa agccttgatc gaaactgatg cggagcatat tcgggtgtcc 360
atcaagattg attctgggtt gcatcgttcg ggtgtggatg agcaggagtg ggagggcgtg 420
ttcagcgcgt tggctgctgc cccgcacatt gaggtcacgg gcatgttcac gcacttggcg 480
tgcgcggatg agccagagaa tccggaaact gatcgccaaa ttattgcttt tcgacgcgcc 540
cttgcgctcg cccgcaagca cgggcttgag tgcccggtca accacgtatg caactcacct 600
gcattcttga ctcgatctga tttacacatg gagatggtcc gaccgggttt ggccttttat 660
gggttggaac ccgtggcggg actggagcat ggtttgaagc cggcgatgac gtgggaggcg 720
aaggtgagcg tcgtaaagca aattgaagct ggacaaggca cttcctatgg cctgacctgg 780
cgcgctgagg atcgcggctt tgtggctgtg gtgcctgcgg gctatgccga tggcatgccg 840
cggcatgccc aggggaaatt ctccgtcacg attgatggcc tggactatcc gcaggttggg 900
cgcgtatgca tggatcagtt cgttatttct ttgggcgaca atccacacgg cgtggaagct 960
ggggcgaagg ccgtgatatt cggtgagaat gggcatgacg caactgattt tgcggagcgt 1020
ttagacacca ttaactatga ggtagtgtgc cgaccaaccg gccgaactgt ccgcgcatat 1080
gtttaa 1086
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 2130
<212> DNA
<213> fusA
<400> 2
gtggcacaag aagtgcttaa gatctaaaca aaggtccgca acatcggcat catggcgcac 60
atcgatgctg gtaagaccac gaccaccgaa cgcatcctct tctacaccgg catcaaccgt 120
aaggtcggtg agacccacga cggtggcgca accaccgact ggatggagca ggagaaggaa 180
cgcggcatca ccattacctc cgccgcggtt acctgtttct gggataacaa ccaggtcaac 240
atcattgaca cccctggcca cgttgacttc accgttgagg ttgagcgttc cctccgcgtg 300
cttgacggcg cagttgctgt gttcgacggc aaggaaggcg ttgagccaca gtctgagcag 360
gtttggcgtc aggctaccaa gtacgacgtt ccacgtatct gcttcgtgaa caagatggac 420
aagctcggtg ctgacttcta cttcaccgtt ggcaccatcg aggaccgcct gggtgcaaag 480
ccattggtta tgcagctccc aatcggtgct gaggacaact tcgacggcgt catcgacctt 540
cttgaaatga aggcactgac ctggcgtgga gttaccccaa ttggtaccga agctaccgtt 600
gaggagatcc cagcagagct cgcagaccgc gcagctgagt accgtgagaa gcttctcgag 660
accgttgcag agtccgacga agagctcatg gagaagtact tcggtggcga agagctcagc 720
atcgctgaga tcaaggcagc tatccgtaag atggttgtta actctgagat ctaccctgtt 780
tactgtggca ccgcctacaa gaacaagggc atccagccac tgctcgacgc agtcgttgac 840
ttcctgcctt ccccactgga tctcggcgag accaagggca ctgacgttaa ggatcctgag 900
aaggttctga cccgtaagcc ttccgacgaa gagccactgt ctgcacttgc attcaagatt 960
gcagctcacc cattcttcgg taagctgacc ttcgttcgtc tgtactccgg caaggttgag 1020
ccaggcgagc aggttcttaa ctccaccaag aacaagaagg aacgcattgg taagctgttc 1080
cagatgcacg ccaacaagga aaaccctgtt gaggttgcac acgctggtaa catctacgcg 1140
ttcatcggcc tgaaggacac caccaccggt gacaccctct gtgacgcaaa cgctccaatc 1200
attcttgagt ccatggactt cccggatcca gttatccagg ttgctattga gcctaagacc 1260
aagtctgacc aggagaagct cggcgtagct atccagaagc ttgctgaaga agacccaacc 1320
ttcaccgttc acttggacga tgagtccggc cagaccgtca ttggcggcat gggcgagctg 1380
cacctcgatg ttcttgttga ccgcatgaag cgcgagttca aggttgaggc aaacatcggt 1440
gacccacagg ttgcttaccg tgagaccatc cgtaagcctg ttgagtccct cagctacacc 1500
cacaagaagc agactggtgg ttccggtcag ttcgctaagg tcatcatcac cattgagcct 1560
tacgcacctg aggcagacga gcttgaagag ggcgagtccg caatctacaa gttcgagaac 1620
gctgtcaccg gtggtcgtgt tccacgtgaa tacatcccat ccgttgacgc tggtatccag 1680
gacgcaatgc agtacggctt cctggctggc tacccactgg ttaacgtcaa ggcaaccctt 1740
gaagatggcg cttaccacga cgttgactcc tctgaaatgg ccttcaagct cgccggttcc 1800
caggcgttca aggaagctgt tgcaaaggca aagccagtcc tcctcgagcc aatcatgtcc 1860
gttgaaatca ccactcctga ggagtacatg ggtgaagtca tcggtgacgt gaactcccgc 1920
cgtggccaga tcgcttccat ggatgaccgt gcaggcgcca agctggttaa ggctaaggtt 1980
ccactgtctc agatgttcgg ttacgtcggt gaccttcgct ctaagaccca gggtcgtgca 2040
aactactcca tggtcttcga ttcctacgct gaggtcccag ccaacgttgc cgcagatgtt 2100
attgctgagc gcaacggcac cgcttcctaa 2130
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 558
<212> DNA
<213> frr
<400> 3
atgattgatg aaattctgtt cgaagcggaa gagcgcatga ccgcaacggt cgagcacacc 60
cgcgaagact tgaccaccat tcgtaccggt cgcgcaaacc cggctatgtt caacggtgtc 120
atggctgaat actacggcgt gcctactcct attactcaga tgtcaggcat cactgttcca 180
gagcctcgca tgctgctgat caagccttat gagatgtctt ccatgcaggt cattgagaat 240
gctatccgta actctgacct tggtgttaac cccaccaacg atggccaggt gctgcgtgtg 300
accatcccac agcttactga agagcgtcgt aaggacatgg tcaagcttgc taagggtaag 360
ggcgaagacg gcaagattgc cattcgtaac atccgccgca agggcatgga ccagctaaag 420
aagctgcaaa aagatggcga cgctggcgaa gatgaagtac aggcagcaga aaaagaacta 480
gataaagtca ccgctggttt tgttgcgcag gtcgatgaag tcgttgctcg caaggaaaag 540
gaactgatgg aggtctag 558
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 1311
<212> DNA
<213> ilvA
<400> 1
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 2413
<212> DNA
<213> ilvBN
<400> 5
gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60
gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540
gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600
gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660
aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720
gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780
ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900
tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960
attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020
gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080
gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140
cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260
gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320
accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380
gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500
cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560
ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620
gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680
ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740
ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800
gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860
gttgaatcga ccgaggcata aggagagacc caagatggct aattctgacg tcacccgcca 1920
catcctgtcc gtactcgttc aggacgtaga cggaatcatt tcccgcgtat caggtatgtt 1980
cacccgacgc gcattcaacc tcgtgtccct cgtgtctgca aagaccgaaa cacacggcat 2040
caaccgcatc acggttgttg tcgacgccga cgagctcaac attgagcaga tcaccaagca 2100
gctcaacaag ctgatccccg tgctcaaagt cgtgcgactt gatgaagaga ccactatcgc 2160
ccgcgcaatc atgctggtta aggtctctgc ggacagcacc aaccgtccgc agatcgtcga 2220
cgccgcgaac atcttccgcg cccgagtcgt cgacgtggct ccagactctg tggttattga 2280
atccacaggc accccaggca agctccgcgc actgcttgac gtgatggaac cattcggaat 2340
ccgcgaactg atccaatccg gacagattgc actcaaccgc ggtccgaaga ccatggctcc 2400
ggccaagatc taa 2413
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 963
<212> DNA
<213> ppnk
<400> 6
atgactgcac ccacgaacgc tggggaactc aggcgagttt tgctggttcc acacaccggg 60
cgttcttcca atattgaatc cgccatcttg gcagccaagc tgctcgacga tgctggaatc 120
gatgtgaggg tgctgatcaa tgatgcagat gatccaattg cagagcactc cgttttaggc 180
cgtttcaccc atgtcaggca cgctgcagac gccgctgacg gcgcagaact agttctggtg 240
ctgggtggag atggcacctt cctccgcgca gcagatatgg cccacgctgt tgatttgcct 300
gttctgggca tcaacctagg ccatgtggga ttcttggctg aatgggagtc tgactcactt 360
gaagaggcac tcaaacgtgt gatcgaccgc gattaccgta ttgaagatcg catgacctta 420
actgtcgttg tcctagacgg cggtggagaa gaaatcggcc gaggctgggc tctcaatgag 480
gtcagtattg aaaacttaaa ccgcagggga gtgctcgatg caaccctcga ggtagatgca 540
cgaccagttg cttcctttgg ttgcgatggc gtgctgattt ccaccccaac cggctccacc 600
gcttatgcat tttccgccgg tggtcctgta ctgtggccag aactcgatgc catcttggtg 660
gttcctaata acgcccacgc gctgtttacc aaaccgctgg ttgtgagccc aaaatccacc 720
gtagctgtgg aatccaattc agatacttca gcagcgatgg ccgtcatgga tggtttccgt 780
cccattccta tgcctccagg atcccgtgtt gaggtcacca ggggtgagcg tcccgtgcgt 840
tgggtgaggc ttgattcttc accgtttacc gaccgacttg tgagcaaatt aaggctcccc 900
gttaccggtt ggcggggtcc gcaaaaacag gcggaaaata aagatcccag gtcagcgggg 960
taa 963
Claims (8)
1.一株产L-异亮氨酸基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2014529。
2.根据权利要求1所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，通过质粒回补基因组alr基因缺陷，从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能，所述菌株包括alr基因缺陷型表达宿主。
3.根据权利要求2所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，所述表达宿主是被敲除了编码丙氨酸消旋酶的基因alr的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
4.根据权利要求2或3所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，所述表达宿主是将alr敲除载体转化入谷氨酸棒状杆菌，通过同源重组获得的alr缺陷型表达宿主，所述alr敲除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
5.根据权利要求4所述产L-异亮氨酸基因工程菌，所述alr缺陷型表达宿主，其构建方法，其特征在于，主要步骤为：
（1）以C. glutamicum IWJ001基因组为模板，分别以Alr-S-(+)/(-)及Alr-X-(+)/(-)为引物扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U及alr-D；以pDTW-202为模板，kan-lox-F/R为引物扩增kan抗性基因片段；alr-U以XhoI、BamHI酶切，alr-D以XbaI及PstI酶切，kan片段以BamHI、XbaI酶切，三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即alr敲除载体，命名为pJXW-1；
（2）将alr敲除载体转化宿主菌，通过同源重组获得alr基因缺陷型表达宿主菌。
6.根据权利要求1或5所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，共表达了基因fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk，其核苷酸序列分别为：fusA为SEQ ID NO.2，frr 为SEQ ID NO.3，ilvA 为SEQ ID NO.4，ilvBN 为SEQ ID NO.5， ppnk 为SEQ ID NO.6。
7.根据权利要求1、5或6所述产L-异亮氨酸基因工程菌，所述表达载体pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA -ppnk，其构建方法，其特征在于，主要步骤为：
（1）扩增fusA-frr基因片段：在fusA-frr两端分别引入NotI及NheI酶切位点；将PCR产物fus-frr片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4，得到重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr；
（2）扩增ilvBN-ilvA-ppnk基因片段：在ilvBN-ilvA-ppnk两端分别引入SfiI及AscI酶切位点；将PCR产物ilvBN-ilvA-ppnk片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4-fusA-frr，得到重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk；
（3）将重组表达质粒pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk转入通过alr敲除载体敲除alr基因的谷氨酸棒状杆菌，得基因工程菌IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk。
8.权利要求1、5或6所述产L-异亮氨酸基因工程菌的应用，其特征在于用于发酵产L-异亮氨酸。
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