CN1044665C - 乳蛋白部分水解产物及其制备方法 - Google Patents

乳蛋白部分水解产物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开经酶法水解得到的乳蛋白部分水解产物及用其制成的婴儿配方。该水解产物的抗原性得以降低，要用乳清蛋白和酪蛋白的混合物得到该水解产物，其水解程度为4-10%。

Description

乳蛋白部分水解产物及其制备方法
本发明涉及乳蛋白部分水解产物及其制备方法。
大量婴儿配方基于牛乳蛋白。对乳蛋白确实过敏的婴儿就要求婴儿配方中的蛋白大量水解而含有最少量的剩余分子结构。对于非过敏性婴儿，低抗原性婴儿配方具有预防作用，其中该配方延迟或防止了敏化作用，否则就会导致临床过敏症状。牛乳蛋白配方的潜在过敏性可通过蛋白水解而降低。
为了理想地满足人乳组成，婴儿配方中的牛乳蛋白应含适当比例的乳清蛋白和酪蛋白。尽管有大量全乳蛋白食品满足了要求的乳清蛋白/酪蛋白比例，但几乎所有的市售部分水解配方都基于100％乳清蛋白。
文献中所述部分水解产物制备方法一般涉及多步骤水解及水解后的物理分离以去除酶和/或剩余蛋白。大多数方法要求在水解期间进行恒定pH值控制。而且，除非引入另外的工艺步骤，否则所得水解产物通常含大量盐，这可给婴儿配方带来组成上的问题，其中矿物质量通常要调为一定量。
US 5039532说明了酶法水解而得要求特性水解产物的两个步骤。该专利还说明了婴儿配方制备方法，其中该配方进行超高温(UHT)灭菌。US 4293571和4981704均说明了用胰酶得到的部分水解产物，其中涉及水解后的膜分离工艺，以除去剩余蛋白和酶。
蛋白水解产物，尤其是含酪蛋白水解产物的普通特性是带来了苦味，据推测这是因为有带疏水端基的肽释放出来。而且，蛋白的乳化性一般随水解程度的提高而降低。日本专利JP 1160458说明了乳蛋白水解产物(5-20％)水解)，该产物在食品如冰淇淋和搅打稀奶油中具有表面活性和乳化性。但是，在经历敏化过程的食品如液体婴儿配方中，蛋白水解产物的进一步变性使其在乳液中的功能降低。这在食品中表现为乳清和奶油分层。通常优选在常用高压杀菌釜中采用UHT灭菌工艺的高温短时条件以防止极为不利的受热。
因此，仍急需低抗原性蛋白部分水解产物，其中乳清蛋白/酪蛋白比例可使其达到类似于人乳的蛋白组成，并且其味道和/或乳化性得到改进。
本发明涉及蛋白混合物部分水解产物，其中该蛋白混合物包括乳清蛋白和酪蛋白，该水解产物的水解程度为4-10％，并且还涉及含该部分水解产物的婴儿配方。
本发明还涉及蛋白混合物部分水解产物的制备方法，其中包括在可使水解程度达到4-10％的条件下将乳清蛋白和酪蛋白的混合物与包括至少1800USP胰蛋白酶单位/mg和至少350USP胰凝乳蛋白酶单位/mg的水悬浮液态酶混合物接触。
本发明提出宜于制成低抗原性营养食品的乳清蛋白和酪蛋白混合物的部分水解产物及其制备方法。与现有蛋白部分水解产物相比，本发明的部分水解产物还与人乳的乳清蛋白/酪蛋白比例较为接近。此外，本发明部分水解产物优选还改进了其味道和乳化活性。
本发明方法用包括乳清蛋白和酪蛋白的混合物并且其比例优选类似于人乳中该比例的原料进行。优选蛋白混合物包括约60-约80％乳清蛋白和约40-约20％酪蛋白，更优选约40-约60％乳清蛋白和约60-约40％酪蛋白(均以重量计)。乳清蛋白可源于干酪制造过程中得到的乳清，尤其是甜乳清如酪蛋白经凝乳酶凝固而得到的乳清。乳清蛋白也可以35-80％超滤得到的蛋白(UF乳清)浓缩物形式应用。该乳清原料还可任选经离子交换和/或电渗析而脱矿物质(ED乳清)。酪蛋白源也可是酸酪蛋白或无脂肪乳固体(NFDM)。乳清蛋白和酪蛋白也可以液体浓缩物或粉状应用。本发明方法中，蛋白可稀释或复原成含约10-约60g蛋白/升，优选约40-约60g蛋白/升的溶液。
本发明方法中，应用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物，其中各酶的特异性或专一性是互相外充的。该酶混合物中优选不含其它污染性蛋白酶如羧基肽酶A和B或亮氨酸氨基肽酶。该混合物中的胰蛋白酶量等于或大于800USP单位/mg，优选等于或大于1000USP单位/mg，更优选等于或大于1800USP单位/mg。1个USP胰蛋白酶单位为5分钟试验时间，pH7.6,25±1℃和N-苯甲酰-L-精氨酸乙基酯盐酸盐(BAEE)作为底物的条件下引起的吸收率变化为0.003/分钟的活性。
该混合物中的胰凝乳蛋白酶量等于或大于150USP单位/mg，优选等于或大于200USP单位/mg，更优选等于或大于350USP单位/mg。1个USP胰凝乳蛋白酶单位为5分钟试验时间，pH7.6,25±0.1℃和N-乙酰基-L-酪氨酸乙基酯(ATEE)作为底物的条件下引起的吸收率变化为0.0075/分钟的活性。
宜用于本发明的市售酶源包括Novo Nordisk Bioindustrials,Inc.,Danbury,CT,U.S.A.(尤其是PEM2500S),EnzymeDevelopment Corp.,New York,NY,U.S.A.,Intergen Company,Purchase,NY,U.S.A．和Scientific Protein Labs.,Waunakee,WI,U.S.A.。
为了得到要求性能的水解产物，一般需使胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物中以上述的USP单位计的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶之比达到约1.3-约18，优选约1.3-约10，更优选约4-约6。本发明中酶混合物用量一般为被水解总蛋白量的约0.4-约1.2Wt％(重量百分比)，优选约0.6-约0.8Wt％。
水解前的任选预操作步骤是使蛋白液预热以保证乳清蛋白组分如血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(尤其是IgG)变性。该步骤通常会使免疫化学评价(如下所述)时的剩余抗原性降低。该预处理步骤中通常是经过约10-约30分钟加热到约75-约85℃。而水解本身通常是在约30-约50℃下进行约2-约6小时，其中下限温度对应于上限时间，反之亦然。水解期间通常不要求保持pH，因为水解一般在pH6.5-6.8下进行而无需另外进行pH控制。pH应保持在约6.5-8.0范围内，其中调节或不调节pH。
不管水解条件如何，水解产物优选还另外进行酶失活步骤。这种酶失活作用可为热处理，其中包括历经约10分钟加热到约85℃。另一方面，可通过超高温灭菌(如约130℃进行大约45秒)使酶失活，然后以液态保存产物。该水解产物也可通过蒸发浓缩或喷雾干燥。
为了监控水解程度，可采用the United States Pharmacopeia(USP)甲醛滴定法，其中可通过氢氧化钠滴定而评估肽水解期间游离氨基的增加量。水解程度为4-10％，优选为5-7％。水解程度低于某些现有方法达到的程度正是本发明的优点，本发明还可使抗原性明显降低。
用尺寸筛析层析法(SEC)确定水解产物肽分子量分布。在TSKG-2000 SWXL柱中按分子尺寸将水解产物中的肽分开，柱保持在37℃并用TFA和乙腈在KCL中以0.7ml/分钟的速度洗脱。用UV检测器测出214nm下的吸收性与保持时间的关系并将其与已知分子量的标准蛋白和肽的同样曲线比较。本发明部分水解产物优选平均分子量为2000，最大分子量19000，由如下分布的肽构成，以下按其摩尔质量列出：
摩尔质量          ％分子量分布
(g/mol)
MM＞5000          8.2
5000＞MM＞3000    14.5
3000＞MM＞2000    15.8
2000＞MM1000      26.2
1000＞MM＞500     17.8
MM＜500           17.5
本发明水解产物优选不含可检测到的全乳蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)可显示出水解产物中不存在全乳蛋白。SDS-PAGE用4-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶进行。15μg水解蛋白用SDS处理，用2-巯基乙醇还原，加热后涂在单线上。电泳分离结束时，凝胶上涂银以显示出剩余肽。在相同凝胶中用5μg未被水解的蛋白原料直接进行对比。
水解产物的剩余抗原性用酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。将来被水解的乳蛋白固定在固相上，其浓度落入该试验中确定的线性剂量-反应范围内。水解产物制剂也类似地被固定。后续用兔抗牛乳蛋白和可与兔IgG反应的酶缀合体顺序保温表明有抗原性可识别的蛋白和肽存在。以质量为基础将用水解产物得到的结果与用未被水解的蛋白原料得到的结果进行比较。然后计算水解产物的抗原性降低百分比。本发明水解产物的抗原性降低至少约80％，优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。
本发明水解产物宜用于婴儿配方，并经常用于食品工业按普通单元操作加工。可用上述的ELISA方法测定这些配方与相应的未被水解蛋白比较的抗原性降低。
用本发明水解产物得到的本发明婴儿配方与相应的未被水解的蛋白混合物比较，其抗原性降低至少约80％，优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。本发明婴儿配方可为粉状，浓缩液态或即用液体。
此外，本发明婴儿配方与用部分水解的乳清蛋白得到的相应配方相比，其味道得到改善。
本发明婴儿配方可含有用来满足婴儿营养需求的成分。因此，除本发明部分蛋白水解产物之外，典型婴儿配方可含有脂源，碳水化合物源和其它营养素如维生素和矿物质。一般来说，可将动物油，植物油，淀粉，蔗糖，乳糖和/或玉米糖浆固体加入配方中以提供部分或全部以上营养素。
优选的是，本发明婴儿配方是营养完全的。所谓“营养完全”，指其组成中可含适当营养素以长期维持健康人的生活。
蛋白部分水解产物量/100kcal总配方一般为约1.8g-约4.5g，脂源量/100kcal总配方一般为约3.3g-约6g，而碳水化合物源量/100kcal总配方一般为约7g-约14g。
在婴儿配方中的碳水化合物源可为本技术领域已知的任何适宜的碳水化合物以使其宜用于婴儿配方。典型的碳水化合物源包括蔗糖，果糖，葡萄糖，麦芽糖糊精，乳糖，玉米糖浆，玉米糖浆固体，大米糖浆固体，大米淀粉，改性玉米淀粉，改性木著淀粉，米粉，豆粉等。
婴儿配方中的脂源可为本专业已知的任何宜用于婴儿配方的类脂或脂肪。典型类脂源包括乳脂肪，红花油，蛋黄脂，橄榄油，椰子油，棕榈油，棕榈仁油，豆油，葵花籽油，鱼油及其衍生物如甘油三棕榈油酯，中等链长甘油三酸酯(MCT)以及脂肪酸酯，其中脂肪酸例子为例如花生四烯酸，亚油酸，棕榈酸，硬脂酸，二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸，亚麻酸，油酸，月桂酸，癸酸，辛酸，己酸等。各种形式的高油酸油如高油酸葵花籽油和高油酸红花油也可用于此。中等锭长甘油三酸酯的辛酸和癸酸浓度高于常用油，如总脂肪酸含量中的约四分之三为辛酸，而四分之一为癸酸。
含本发明蛋白部分水解产物的婴儿配方中还可任意补充各种游离氨基酸以提供营养平衡的氨基酸含量。这类游离氨基酸例子包括L-色氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-酪氨酸和L-精氨酸。
营养完全的组合物含有日常饮食中被认为是基本的维生素和矿物质并且这些成分应以足够营养量存在。所属技术领域里的技术人员应知道发挥正常生理功能所需维生素和矿物质最低量。本发明实施人员也明白，需提供适当附加量(过量)维生素和矿物质成分以补偿这些组合物加工和贮存过程中的某些损失。
用于婴儿配方的特定维生素或矿物质的选择要求考虑所选化合物适应加工和贮存的化学性质。
可任选存在于本发明组合物中的矿物质，维生素和其它营养素例子包括维生素A，维生素B6，维生素B12，维生素E，维生素K，维生素C，叶酸，硫胺素，肌醇，核黄素，烟酸，生物素，泛酸，胆碱，钙，磷，碘，铁，镁，铜，锌，锰，氯化物，钾，钠，硒，铬，钼，牛磺酸和L-肉毒碱。矿物质通常以盐的形式加入。除考虑到相容性和稳定性之外，特定矿物质和其它维生素的存在与否及其量可在一定程度上根据考虑到的婴儿群体而变化。
本发明婴儿配方一般还含乳化剂和稳定剂如大豆卵磷脂，卡拉胶等。
本发明婴儿配方还可任选含有可起有利作用的其它物质如乳铁蛋白，核苷酸，核苷，免疫球蛋白等。
本发明液体婴儿配方(准备消费时)的重量渗透压浓度一般为约100-约500mOsm/kgH2O，更通常为约200-约400mOsm/kgH2O。
本发明婴儿配方必要时可灭菌，例如用本领域已知的技术如高压蒸汽灭菌或过热蒸汽灭菌等热处理技术灭菌。
本发明婴儿配方可用本领域已知用于保藏营养食品的任何类型容器如玻璃，加内衬纸板，塑料，涂层金属罐等包装。
以下实施例详述本发明，但并不限制本发明。
实施例1
蛋白质50℃下溶解而达到4-6％蛋白浓度。这相当于10-25％固体，具体值取决于所用蛋白类型。预热处理时在75℃下保持30分钟。混合物冷至50℃后加酶混合物。水解可在30-50℃温度范围内进行2-6小时。水解时间和温度相互关联，其中温度下限对应于时间上限，反之亦然。混合物的pH可在水解期间加以调节或不调节。为了使酶失活，可向水解产物中注入130℃蒸汽达45秒钟。该高温处理步骤与预热处理和酶法水解步骤一起产生低抗原性水解产物。必要时用氢氧化钾将pH调为至少6.6以防止在热处理期间出现热凝固。
实施例2
重复例1的操作，只是85℃下预热处理10分钟前用KOH将pH调为7.5。为了使酶失活，10分钟内将部分水解产物加热到85℃。如例1将pH调为至少6.6后再进行下一步骤。
不同工艺参数到在下表中，其中示出了例1和2的水解产物制备方法。在所有情况下，乳清蛋白∶酪蛋白重量比为80∶20。
参数 方法例    ％D.H.   ％抗原性降低(水解产物)
胰蛋白酶/胰凝孔蛋白酶之比  1.35.38.8 2 6.77 92.5
    2     6.50     94.3
    2     7.24     93.7
酶浓度          0.8(蛋白的％)      0.60.4     2     5.50     92.7
    2     4.88     91.3
    2     4.72     91.3
水解时间(小时)          2233446 1 4.53 90.5
    2     4.55     91.8
    1     4.57     92.4
    2     5.48     93.9
    1     5.35     92.4
    2     6.50     94.3
    2     6.73     94.6
水解温度(c)     (℃)304050 2 4.58 89.9
    2     5.71     91.6
    2     5.76     94.6
实施例3
对于液体婴儿配方，向例1的部分水解产物中加入乳糖和先溶解的矿物质。混合物在换热板中加热到70℃。然后加入由甘油三棕榈油酯，葵花籽油，椰子油，豆油，卵磷脂，甘油单和二酸酯及脂肪可溶维生素组成的脂肪。油熔化后再加入混合物中。预热到约75℃后混合物中45秒钟内直接注入蒸汽，加热到140℃后用冷却板冷却到70℃。然后分两步均化，第一步在17500千帕(175巴)下进行，第二步在3500千帕(35巴)下进行。混合物再经冷却板冷却到5-7℃并贮存在中间贮存罐中，该罐中加入了水可溶维生素。该工艺的主体产品热凝固时间均超过30分钟。该产品经常用高压灭菌系统灭菌。
所得液体组成如下：
肽            1.65％
脂肪          3.60％
碳水化合物    6.52％
矿物质        0.48％
维生素        微量
实施例4
对于另一液体婴儿配方，则用例2的部分水解产物按例1的方法制造，只是直接注入蒸汽温度为121℃并且液体于145℃下灭菌4.97秒后无菌包装在容器中。产品组成同于例3。
实施例5
对于婴儿配方奶粉，则用例1或2的部分水解产物按例3的方法制造，只是所得产品不注入高温蒸汽而直接于12500千帕(125巴)和5000千帕(50巴)下进行2步均化。该奶粉基底物料可蒸发到50％固体后再喷雾干燥。
该奶粉组成如下：
肽            13.1％
脂肪          28.6％
碳水化合物    51.8％
矿物质        3.8％
维生素        0.2％
水分          2.5％
按例1-5的方法得到的婴儿配方如下表所示表现出低抗原性。
产品形式(乳清蛋白：酪蛋白之重量比，蛋白源)    方法例 ％抗原性降低
液体(80∶20.UF*乳清，NFDM**)     1.4     92.4
液体(80∶20.UF乳清，NFDM)     2.4     94.3
液体(80∶20.UF乳清，NFDM)     -1,3     92.1
液体(80∶20.UF乳清，酪蛋白)     1,4     81.4
液体(60∶40.UF孔清，NFDM)     1,4     87.8
液体(60∶40.ED***乳清，NFDM)     1,4     94.6
奶粉(80∶20.UF乳清，NFDM)     -2,5     92.3
*UF=超滤
**NFDM=无脂肪干燥乳品
***ED=电渗析
实施例6
40位消费者评审团评价并比较基本如例4所述的本发明婴儿配方和含有类似成分，但蛋白组分为部分水解的100％乳清蛋白的市售配方(Good StartTM Iron Fortified Infant Formula，可从CarnationCompany,Glendale,CA,USA得到)。样品室温下配给并由评审团评价。采用9点嗜好程度评定标准(9=极相似，1=极不相似)比较婴儿配方的特殊感官特性如苦味，余味，口感以及整体香味评价。结果见下表。
          本发明配方    Good Start
外观          7.3           6.7*
香味          4.0           3.3*
风味浓度      4.5           4.0
甜味          4.8           4.1*
奶味          5.4           5.1
奶油味        5.0           4.5
肉味          4.4           4.1
苦味          3.6           3.6
余味          3.0           3.7
总体评价      4.2           3.6*
受欢迎程度    68％          32％
结论          苦味8％       苦味18％
              颜色差8％*表明95％信任程度下样品间有明显差异。
本发明配方明显优于Good Start。评审团成员的评价表明GoodStart的苦味是导致本发明配方优于Good Start的主要原因。
以上特别参照本发明优选实施方案详述了本发明，但应注意到在本发明构思和保护范围内还可进行各种改变和修饰。

Claims (11)

1．蛋白混合物的部分水解产物，其中该蛋白混合物包括60-80Wt％乳清蛋白和40-20Wt％酪蛋白，并且该水解产物的水解程度为4-10％，其中该水解产物平均分子量为2000，最大分子量为19000并且包括其分布如下的肽，以下按其摩尔质量列出：
摩尔质量          ％分子量分布
(g/mol)
MM＞5000          8.2
5000＞MM＞3000    14.5
3000＞MM＞2000    15.8
2000＞MM＞1000    26.2
1000＞MM＞500     17.8
MM＜500           17.5。
2．如权利要求1的部分水解产物，其中与相应的未被水解蛋白混合物相比，该水解产物经ELISA测定的抗原性降低至少80％。
3．如权利要求1的部分水解产物，其中与相应的未被水解蛋白混合物相比，该水解产物经ELISA测定的抗原性降低至少85％。
4．如权利要求1的部分水解产物，其中与相应的未被水解蛋白混合物相比，该水解产物经ELISA测定的抗原性降低至少90％。
5．如权利要求1的部分水解产物，其中与相应的未被水解蛋白混合物相比，该水解产物经ELISA测定的抗原性降低至少95％。
6．如权利要求1的部分水解产物，其中该蛋白混合物包括40-60Wt％乳清蛋白和60-40Wt％酪蛋白。
7．权利要求1所述的蛋白混合物的部分水解产物的制备方法，所述蛋白混合物包含乳清蛋白和酪蛋白，所述方法包括：
(a)进行预处理步骤，所述预处理步骤包含将所述蛋白混合物在75℃-85℃下加热10分钟至30分钟；
(b)使步骤(a)中得到的蛋白混合物与包含至少1800USP胰蛋白酶单位/mg和至少350USP胰凝乳蛋白酶单位/mg的酶混合物在其中胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的USP单位之比为1.3至18的水悬浮液中、在30℃-50℃的温度下、在pH值为6.5-8.0的条件下接触2-6小时，其中按混合物中蛋白重量为准计，酶混合物的量为0.4％-1.2％；和
(c)使所述酶混合物失活。
8．按照权利要求7的方法，其中胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的USP单位之比为1.3-10。
9．按照权利要求7的方法，其中胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的USP单位之比为4-6。
10．按照权利要求7的方法，其中所述酶混合物是通过加热至85℃历经10分钟或130℃历经45秒来进行失活的。
11．按照权利要求10的方法，其中该方法后续进行蒸发或喷雾干燥脱水的另外步骤。
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