CN104450576A - 短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂，所述的液体制剂中包含保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌和蛭弧菌，所述的蛭弧菌为噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔尔蛭弧菌中的一种或多种。本发明还提供该液体制剂在清除弧菌引起的疾病中的应用。其优点表现在：可以广谱、有效地清除弧菌引起的疾病，添加到对虾饲料中不仅可以抑制对虾肠道病原弧菌的生长、减少对虾弧菌病的发生，还能促进对虾生长、降低养殖成本，值得在水产养殖中广泛应用。

Description

短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂及其应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体地说，是短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂及其应用。 

背景技术

弧菌属于弧菌科弧菌属，是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽孢的短杆状细菌，其中有的弧菌有一定的弯曲，欠柔软，有的弯曲不明显。弧菌是海洋细菌的优势类群之一，广泛分布于世界各地各类河口、内湾、沿岸、水体养殖区和外海的水体及沉积物中，各种海洋生物体表或体内也常生存着高密度海洋弧菌，在海洋环境中占据着重要的生态地位，具有多种多样的生理、生态功能，在海洋微食物环中扮演重要角色，对海洋的营养物的循环起着非常重要的作用。但同时，弧菌又是水生动物中的一类重要的病原菌。 

随着高密度海水养殖业快速发展，对养殖环境的污染日益加剧。水产品的病害已成为海水养殖业发展的主要问题。弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，该病在全球范围内广泛发生，其爆发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失，还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类的大量死亡。弧菌病是最严重的疾病之一，其死亡率甚至高达100％。 

为了控制病害，通常过度使用抗生素类药物，这不仅造成养殖产品的药物残留，而且还提高了病原细菌的耐药性，引起抗性基因的转移，导致生态失调。2005年，欧盟已禁止在动物养殖中使用一切非治疗性抗生素。因此，寻找抗生素的替代药物、探索新的防治方式已经迫在眉睫。 

中国专利文献CN101275119公开了一种蛭弧菌在消除淡水产品及其养殖水体中致病菌的应用，特别适用于消除淡水产品食用或加工前、运输过程及其养殖水体中携带的致病菌。在污染了致病菌的淡水产品养殖水体中、食用前、加工前或运输过程中加入蛭弧菌浓缩液，使其浓度至少达到10³pfu/ml。淡水产品食用或加工前、运输过程中或养殖水体中应用该法时，蛭弧菌游泳体浓度范围分别为10⁵～10¹³pfu/ml；10⁴～10¹²pfu/ml；10³～10⁷pfu/ml。中国专利文献CN101781627A公开了一种海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，涉及一种海水微生态制剂，需要提供适合于海水养殖用的蛭弧菌制剂的制备方法。该发 明由以下步骤组成：制备宿主菌悬液；蛭弧菌的分离、纯化；蛭弧菌增殖培养，其特征是将施氏假单胞菌接斜面活化后，在试管中加入生理盐水制得菌悬液，然后用营养肉汤增殖培养，在所得菌液中加入絮凝剂，摇匀后静置沉淀，加入生理盐水得到10¹²cfu/mL的宿主菌悬液；用双层琼脂平板法对采集的海水和底泥样品进行蛭弧菌的分离和纯化，将含有宿主菌悬液和采集样品的培养基混匀后倒入下层海水琼脂上培养，将宿主菌和分离得到的蛭弧菌加入到灭菌天然海水中培养至蛭弧菌浓度为10⁸～10⁹pfu/mL，备用。中国专利文献CN101948784A公开了一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用。发酵方法包括以下步骤：(1)宿主菌悬液的制备；(2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备；(3)蛭弧菌制剂的制备。中国专利文献CN102217655A公开了一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法，以沸石粉作为赋形载体，利用喷雾干燥技术制备粉状噬菌蛭弧菌制剂。中国专利文献CN102726634A公开了一种海参用微生态饲料及其制备方法，饲料包括噬菌蛭弧菌、枯草芽孢杆菌和辅料；所述噬菌蛭弧菌在微生态饲料中的浓度为10⁶-10¹⁰个/g，所述枯草芽孢杆菌在微生态饲料中的浓度为10⁶-10¹⁰个/g，所述辅料包括氮源、碳源和磷酸盐。中国专利文献CN103719535A公开了一种噬菌蛭弧菌微胶囊，所述微胶囊的壁为明胶，颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，所述颗粒粒径大小为3～12μm，分布基本均匀，且其中，噬菌蛭弧菌的含量为3.69×10⁷pfu/g～3.70×10⁷pfu/g，大肠杆菌DH5α的含量为8.6×10⁹pfu/g～2.10×10¹⁰pfu/g。该微胶囊的制备方法，其包括步骤：1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备；2)噬菌蛭弧菌培养液的制备；和3)将步骤1)的大肠杆菌DH5α菌悬液和步骤2)的噬菌蛭弧菌培养液与无菌明胶溶液均匀混合后，进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊。中国专利文献CN103907596A公开了一种蛭弧菌颗粒剂，由植物油、质量浓度为5％-10％的琼脂和蛭弧菌含量为10¹⁰-10¹¹CFU/mL的菌液按照体积比为3：50：100的比例混合，然后加入质量浓度为2％的羧甲基纤维素钠并混合均匀，将混合液滴入到质量分数为10％的CaCl₂溶液中固化12h，再将蛭弧菌固化颗粒于-20℃条件下冷冻干燥24h制得的颗粒剂。中国专利文献CN104099268A公开了一种水产养殖复合微生物菌剂，其包括如下菌剂及其重量份：枯草芽孢杆菌5-10份，地衣芽孢杆菌0.5-4份，巨大芽孢杆菌1-6份，胶质红假单胞菌0.2-1份，荚膜红假单胞菌0.5-3份，噬菌蛭弧菌2-8份。中国专利文献CN101356927公开了一种蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，在污染了致病性弧菌的海产品和/或养 殖水体中加入蛭弧菌浓缩液，使蛭弧菌的浓度至少达到10²pfu/ml。海产品食用前、运输过程以及养殖水体中应用该法时，蛭弧菌浓度范围分别为10⁴～10¹²pfu/ml、10³～10¹¹pfu/ml、10²～10⁶pfu/ml。 

中国专利文献CN103525723A公开了一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC M 2013240。该发明还提供这种短小芽孢杆菌的应用以及以这种短小芽孢杆菌或其发酵液为活性成分的微生物制剂。该发明以紫色杆菌为筛选模型，利用“T”型划线法和滤纸片法筛选出一株能够抑制紫色杆菌紫色色素产生的菌株F3-1，试验结果表明菌株F3-1能够抑制紫色杆菌的QS信号分子，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。 

但是关于本发明的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂及其应用目前还未见报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂。 

本发明的再一的目的是，提供一种短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂的应用。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂，所述的液体制剂中包含保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌和蛭弧菌，所述的蛭弧菌为噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔尔蛭弧菌中的一种或多种。 

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂在制备饲料添加剂中的应用。 

所述的饲料添加剂可以清除弧菌引起的疾病。 

所述的弧菌包括：霍乱弧菌、拟态弧菌、梅契尼科夫弧菌、霍利斯弧菌、海鱼弧菌、河流弧菌、弗尼斯弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、辛辛那提弧菌、鲨鱼弧菌。 

所述的饲料添加剂为对虾饲料添加剂。 

所述的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂在制备饲料中的应用。 

所述的饲料为对虾饲料。 

本发明优点在于： 

本发明的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂，可以广谱、有效地清除弧菌引起的疾病，添加到对虾饲料中不仅可以抑制对虾肠道病原弧菌的生长、减少对虾弧菌病的发生，还能促进对虾生长、降低养殖成本，值得在水产养殖中广泛应用。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 

具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，其释放出来的蛋白酶可以淬灭群体感应信号分子，进而使致病菌调控毒力因子表达的机能丧失或者减弱，那么致病菌就是一头没有獠牙的狼，而宿主有足够的时间把它围困进而依靠自身免疫消除抗原。 

将具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和蛭弧菌组合在一起使用，将二者的作用共同发挥出来，可以更好地清除弧菌引起的疾病。 

本发明实施例优选的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌。保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌的分类命名：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏单位：中国典型培养物中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期：2013年06月02日，保藏编号为CCTCC NO:M2013240。 

本发明实施例优选的蛭弧菌为噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)。 

实施例1液体制剂 

本发明的液体制剂可以通过将短小芽孢杆菌和蛭弧菌分别进行液态发酵培养，然后将二者的浓缩液混合，即得到本发明的液体制剂。本实施例制备的液体制剂用于实施例3、实施例4、实施例5的试验。本实施例具体的制备方法如下： 

将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方(W/V):豆饼粉3％，淀粉1.5％，玉米浆1％，葡萄糖0.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，NH₄Cl 0.1％，KH₂PO₄ 0.05％，NaH₂PO₄ 0.5％，MgSO₄ 0.05％，MnSO₄ 0.05％，发酵培养条件为28-37℃，通风培养36-48h，活菌数≥10⁹cfu/ml。 

蛭弧菌与副溶血弧菌浓缩液混合后加入到含有DNB培养基的三角锥瓶中，恒温摇床250rpm，28℃培养24h。培养物经过5000rpm、4℃离心20min，取上清液，再16000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，加入适量DNB 液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，制成浓度≥10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液。 

将短小芽孢杆菌的浓缩液和蛭弧菌的浓缩液按照体积比为10:1的比例进行混合，即得到本发明的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂。 

实施例2粉状制剂 

本发明的粉状制剂可以通过将短小芽孢杆菌和蛭弧菌分别进行固态发酵培养，然后将二者的粉状固体混合；也可以通过将短小芽孢杆菌和蛭弧菌分别进行液态发酵培养，然后将二者混合，再进行干燥制得粉状制剂。本实施例制备的粉状制剂用于实施例4、实施例5的试验。本实施例具体的制备方法如下： 

短小芽抱杆菌接种于LB培养基中，37℃静止培养12h，调整菌浓度至5×10¹¹cfu/ml，按重量比菌液：载体为1：1的配比加入载体玉米芯粉，60℃烘干24h制成活菌数≥5×10⁸cfu/g短小芽孢杆菌菌粉。 

将蛭弧菌菌种接种于100ml于1/10NB培养基中，加入100L浓度为1.0×10⁶cfu/ml大肠杆菌菌悬液，于35℃温度下100r/min下摇床振荡培养48h，检测菌落总数，调蛭弧菌菌液浓度为1.0×10¹¹cfu/ml备用。花生油、质量浓度为5％的琼脂和蛭弧菌含量为1.0×10¹¹cfu/ml的菌液按照体积比为3:50:100的比例放入搅拌容器中，然后加入质量浓度为2％的羧甲基纤维素纳，25℃恒温搅拌30min，使之混合均匀，将混合液滴入到质量分数为10％的CaCl₂溶液中固化12h，再将蛭弧菌固化颗粒于-20℃条件下冷冻干燥24h，制得颗粒剂。蛭弧菌颗粒的含量≥1.0×10¹¹cfu/g。 

将短小芽孢杆菌菌粉与蛭弧菌颗粒按照质量比为20:1的比例混合，即得到本发明的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的粉状制剂。 

实施例3抑制弧菌谱分析 

采用平板滤纸片扩散法对实施例1制得的液体制剂进行抑制弧菌谱分析。根据抑菌圈的大小判定抑菌能力的强弱，抑菌谱分析结果见表1： 

表1组合物的抑制弧菌活性分析 

注：+++：抑菌活性强；++：抑菌活性中等；+：有抑菌活性。 

由表1可见，从分析的常见的病原弧菌看，本发明的短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂具有广谱的抑制弧菌活性。 

实施例4微生物制剂对对虾生长的促进作用 

取南美白对虾一批，平均体长7.9cm，平均体重7.2g。暂养3天后，分为对照组、实验组一和实验组二，每组100尾对虾。实验组一对虾投喂添加本发明液体制剂的商品对虾饲料("粤海牌"南美白对虾饲料3号料)，实验组二对虾投喂添加本发明粉状制剂的商品对虾饲料("粤海牌"南美白对虾饲料3号料)，对照组则只投喂上述商品对虾饲料。其中，实验组一的液体制剂的添加方法：液体制剂按照每千克饲料添加10ml量取，加入到一定量的海水(15％的饲料重量)中，搅匀，然后将此海水均匀地加入到饲料中，搅匀，吸附20分钟后即可投喂。实验组二的粉状制剂的添加方法，粉状制剂按照每千克饲料添加20g称取，加入一定量的海水(15％的饲料重量)中，搅匀，然后将此海水均匀地加入到饲料中，搅匀，吸附20分钟后即可投喂。对照组、实验组一、实验组二每天投喂4次。记录各组的饲料用量。养殖水温30℃，每天换水两次，每次换水50％。平均每15天取20尾对虾统计体重，然后取出肝脏称重，计算肝体指数。养殖周期45天，共统计3次，45天后统计饵料系数。具体结果如表2所示。 

表2微生物制剂对南美白对虾的促生长效果 

由表2可见，随着养殖周期的增长，实验组一和实验组二与对照组相比，体重增加明显，肝体指数降低逐渐明显。至实验结束时，实验组一和实验组二的对虾与对照组相比，平均体重明显高于对照组，饵料系数明显低于对照组，肝体指数低于对照组。由此说明，在对虾的养殖中，使用本发明的微生物制剂可以明显地降低饵料系数，促进对虾生长，从而缩短养殖周期，减少养殖成本和风险。并且同时也明显改善了对虾的商品品质，增加了出肉率。 

实施例5微生物制剂对对虾弧菌感染的抑制作用 

取南美白对虾一批，平均体长7.9cm，平均体重7.2g。暂养3天后，分为对照组、实验组一和实验组二，每组各200尾对虾，每组各分成4个小组分别培养，每小组为50尾对虾。实验组一对虾投喂添加有本发明液体制剂的商品对虾饲料("粤海牌"南美自对虾饲料3号料)，实验组二对虾投喂添加有本发明粉状制剂的商品对虾饲料("粤海牌"南美自对虾饲料3号料)，对照组则只投喂上述商品对虾饲料。具体投喂方法同实施例4。分别于饲养5天、10天、15天、20天时对不同小组的对虾养殖缸中加入哈氏弧菌E385悬液，使哈氏弧菌E385在饲养水体的终浓度为2×10⁶cfu/ml，对虾在含哈氏弧菌E385的水中浸泡24小时后，正常换水、投喂，观察对虾的摄食表现并统计死亡率，结果见表3。 

表3微生物制剂对南美白对虾哈氏弧菌感染的抑制效应 

由表3可见，实验组一和实验组二的对虾表现明显优于对照组，对虾的死亡率也明显优于对照组。由此说明，使用添加本发明的微生物制剂的对虾饲料可以大大降低对虾弧菌病的患病率，能基本杜绝弧菌病的发生。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 

Claims (7)

1.一种短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂，其特征在于，所述的液体制剂中包含保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌和蛭弧菌，所述的蛭弧菌为噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔尔蛭弧菌中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的液体制剂在制备饲料添加剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的饲料添加剂可以清除弧菌引起的疾病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的弧菌包括：霍乱弧菌、拟态弧菌、梅契尼科夫弧菌、霍利斯弧菌、海鱼弧菌、河流弧菌、弗尼斯弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、辛辛那提弧菌、鲨鱼弧菌。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，所述的饲料添加剂为对虾饲料添加剂。

6.根据权利要求1所述的液体制剂在制备饲料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的饲料为对虾饲料。