CN104436214A - Timp-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术领域，具体涉及TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用。用TIMP-1基因和腺病毒载体或慢病毒载体构建携带TIMP-1基因的重组表达载体；将携带TIMP-1基因的重组表达载体和腺病毒载体穿梭质粒共转染HEK293细胞，获得携带TIMP-1基因的重组腺病毒；将携带TIMP-1基因的重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞，提高TIMP-1表达水平；本发明证明TIMP-1可以抑制由于高糖导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合，也为发明TIMP-1基因作为防治糖尿病足部慢性溃疡新的治疗靶点和药物提供依据。

Description

TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用。

背景技术

随着人们生活方式的改变以及人均寿命的延长，糖尿病发病率急剧增加。在我们国家，糖尿病已经成为慢性皮肤伤口的主要病因。糖尿病足溃疡是糖尿病足的主要表现，也是导致糖尿病患者截肢的重要原因。糖尿病患者皮肤易损伤，且足溃疡一旦发生，治疗非常困难，很难愈合，而且治疗周期长，医疗费用高，严重影响患者的生活质量。因此，糖尿病皮肤病变的防治研究是临床急待探讨的重要课题之一。

生物因子失调是糖尿病创面愈合延迟的重要原因之一。多种细胞因子被证明可以局部应用在糖尿病创面，加速创面愈合，达到预防或者治疗糖尿病足的作用。组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)基因(Genbank No.NC_000023.11)编码的TIMP-1因具有广泛地抑制金属蛋白酶活性的作用而得到大家的关注，但未见其本身作为一种蛋白因子作用于皮肤成纤维细胞，发挥抗凋亡作用而促进糖尿病皮肤慢性溃疡愈合的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，该TIMP-1基因编码的TIMP-1蛋白可以作为糖尿病足治疗的生物因子之一，加速糖尿病皮肤创面愈合，降低糖尿病足导致的截肢率减少医疗费用和提高患者生活质量。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，所述的TIMP-1基因作为糖尿病足治疗的生物因子之一，抑制由于高糖(糖基化终末产物)导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合。

所述的治疗糖尿病皮肤创面产品包括：用TIMP-1基因和腺病毒载体或慢病毒(HIV)载体构建携带TIMP-1基因的重组表达载体；将携带TIMP-1基因的重组表达载体(骨架质粒)和腺病毒载体穿梭质粒共转染HEK293细胞，获得携带TIMP-1基因的重组腺病毒；将携带TIMP-1基因的重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞，提高TIMP-1表达水平；

所述的携带TIMP-1基因的重组表达载体，是将TIMP-1基因序列与腺病毒载体或慢病毒(HIV)载体连接得到的；

所述的腺病毒载体优选为pDC316-mCMV-EGFP；

所述的携带TIMP-1基因的重组表达载体的制备方法，包含如下步骤：

(1)引物设计：

根据NCBI数据库中TIMP-1基因的CDS序列信息，设计带有Not I、EcoRV酶切位点的扩增引物，引物序列如下：

TIMP-1NotIF：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3'；

TIMP-1EcoRVIR：

5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG-3'；

(2)TIMP-1基因CDS片段的获得：

以人cDNA为模板，使用步骤(1)设计的引物TIMP-1NotIF和TIMP1EcoRVIR扩增回收TIMP-1基因CDS片段；

(3)携带TIMP-1基因的重组表达载体的构建

将步骤(2)中回收后的TIMP-1基因CDS片段与载体pDC316-mCMV-EGFP分别用Not I、EcoR酶切并连接，得到携带TIMP-1基因的重组表达载体；

所述的携带TIMP-1基因的重组腺病毒的制备方法，包含如下步骤：

1)重组腺病毒AD-TIMP-1的包装

采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统，腺病毒载体穿梭质粒和携带TIMP-1基因的重组表达载体(骨架质粒)共转染HEK293细胞，在Cre-loxp重组酶作用下包装形成E1/E3缺失的复制型腺病毒；当大部分细胞(80％以上细胞)收缩变圆、脱落时，离心收集细胞，反复冻融裂解细胞后收集上清，得到第一代重组腺病毒；

2)重组腺病毒AD-TIMP-1的扩增

培养扩增HEK293细胞，当细胞汇合度达到80～90％时加入第一代重组腺病毒；感染48h后收集细胞，反复冻融裂解细胞，离心、收集病毒上清，得到第二代重组腺病毒；

3)高滴度重组腺病毒的获得

重复步骤2)，反复感染HEK293细胞，获得高滴度重组腺病毒；

步骤1)中所述的共转染优选采用脂质体法进行共转染；

步骤1)和步骤2)中所述的反复冻融裂解细胞的具体操作优选为-80℃/37℃反复冻融3次；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明证明TIMP-1可以抑制由于高糖(糖基化终末产物)导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合，也为发明TIMP-1基因作为防治糖尿病足部慢性溃疡新的治疗靶点和药物提供依据。

附图说明

图1是实施例1中两组足部伤口皮肤Cleaved Caspase-3免疫组化染色后免疫反应评分结果分析图，其中，对照组为非糖尿病组；*：与对照组对比，p<0.05。

图2是实施例1中两组足部伤口皮肤TUNEL-POD细胞凋亡染色后凋亡指数结果分析图，其中，对照组为非糖尿病组；*：与对照组对比，p<0.05。

图3是实施例1中两组足部伤口皮肤TIMP-1免疫组化染色后免疫反应评分结果分析图，其中，对照组为非糖尿病组；*：与对照组对比，p<0.05。

图4是实施例2中不同因素作用72h对人皮肤成纤维细胞凋亡率影响比较分析图，*：与正常浓度糖组对比，p<0.01；#：与持续高糖组对比，p<0.05。

图5是实施例2中糖基化终末产物(AGEs)对人皮肤成纤维细胞TIMP-1表达影响的结果分析图，*：与对照组对比，p<0.05。

图6是实施例3中TUNEL法检测rhTIMP-1作用72h对糖基化终末产物诱导的原代皮肤成纤维细胞凋亡的影响结果分析图，其中，*：与对照组对比，p<0.05；#：与糖基化终末产物组对比，p<0.05。

图7是实施例3中Western Blot检测rhTIMP-1(10ng/mL)作用72h对糖基化终末产物诱导的Cleaved Caspase-3表达水平的影响结果分析图，其中，*：与对照组对比，p<0.05；#：与糖基化终末产物组对比，p<0.05。

图8是实施例4中扩增TIMP-1基因片段PCR产物以及重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，A，TIMP-1基因片段PCR产物鉴定结果，M：DL2000DNAMarker，泳道1：TIMP-1基因片段PCR产物；B，重组质粒酶切鉴定结果，M：DL2000DNA Marker；泳道1～2：分别为空载酶切前后；泳道3～4：分别为pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1酶切前后。

图9是实施例4中AD-TIMP-1和AD-EGFP转染后到获得P1代病毒的绿色荧光图(×40)。

图10是实施例4中AD-TIMP-1和AD-EGFP感染HEK293细胞扩增病毒图(×40)。

图11是实施例4中AD-TIMP-1作用48h对人皮肤成纤维细胞的转染率比较分析图，其中，A：转染率平均值和标准差；B：转染流式细胞计数图例。

图12是实施例4中人皮肤成纤维细胞感染AD-TIMP-1不同时间的存活率比较分析图，*：与MOI＝0对比，p<0.05。

图13是实施例4中EGFP在人皮肤成纤维细胞的表达的荧光图(×100)。

图14是实施例4中TIMP-1在人皮肤成纤维细胞的表达分析图，其中，*：与无感染组(CON)对比，p<0.05；#：与AD-EGFP组对比，p<0.05。

图15是实施例4中AD-TIMP-1转染逆转AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡结果分析图，A：凋亡率比较；B：TUNEL检测图例(×100)。与CON组对比，p<0.05；△：与AGEs对比，p<0.05；#：与AGEs+AD-EGFP对比，p<0.05。

图16是实施例5中糖尿病大鼠创面边缘点状注射药物示意图。

图17是实施例5中4组心肝肾组织HE染色图(×400)。

图18是实施例5中不同时间4组TIMP-1蛋白表达水平的比较分析图，其中，A：PBS对照组；B：rh-TIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组；*与PBS组对比，p<0.05；#与rhTIMP-1组对比，p<0.05；△与AD-EGFP组对比，p<0.05。

图19是实施例5中不同时间4组伤口愈合情况的比较分析图。

图20是实施例5中4组伤口形成第7天和14天细胞凋亡TUNEL染色分析图(×200)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1糖尿病患者伤口皮肤细胞凋亡及TIMP-1表达的检测

实验对象与取材：皮肤标本

糖尿病足组：自2011年6月至2013年4月于我科因糖尿病足住院的2型糖尿病患者18例，平均年龄为62±13.14岁；非糖尿病组：自2011年6月至2013年4月于我院骨科因足部外伤行外科手术治疗的住院的非糖尿病患者18例，平均年龄为55±15.45岁。所取标本经患者知情同意。所有皮肤标本均在局部感染控制后取材，距离足部伤口边缘0.5cm。剪取皮肤标本后以质量分数为4％的多聚甲醛溶液固定，制作厚度5μm石蜡切片；

(1)糖尿病患者伤口皮肤细胞凋亡检测

①活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)免疫组织化学染色：

Caspase家族是细胞凋亡的介导者和执行者，在引起凋亡中起关键作用，Cleaved Caspase-3表达增高时提示依赖Caspase途径的细胞凋亡增加。

采用SABC(链霉亲和素-生物素复合物)法染色：即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，一抗为兔抗人的Cleaved Caspase-3单克隆抗体(CST公司)，二抗为生物素标记的山羊抗兔第二抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；具体的实验方法和步骤按照试剂盒中的说明进行，染色过程中均设有阴性对照。结果判断标准：细胞浆有棕色着色的细胞为阳性细胞，无棕色着色的为阴性细胞。免疫组化染色结果按照IRS标准(参考文献：Remmele W,Stegner.Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score(IRS)forimmunohistochemical estrogen receptor detection(ER-ICA)in breast cancer tissue.Pathologe,1987,8(3):138-140.)进行评分，IRS＝P*I。P为阳性细胞百分比：没有阳性细胞，P＝0；阳性细胞占1～24％，P＝1；阳性细胞占25～49％，P＝2；阳性细胞占50～74％，P＝3；阳性细胞占75～100％，P＝4。I为染色强度：没有染色，I＝0；染色浅，I＝1；染色中等强度，I＝2；染色深，I＝3。每个标本随机选取5个高倍视野评分，取平均值。

②TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测：

采用In situ cell death detection kit-POD法，试剂盒购自罗氏公司(Cat.NO.11684817910)，方法和步骤按照试剂盒中的说明进行。实验过程设有阴性对照。每个标本随机选取10个高倍视野，计数>1000个细胞，细胞核中有棕黄色者即为凋亡细胞，计算凋亡指数(AI)，AI＝凋亡细胞数/细胞总数×100％。

(2)糖尿病患者伤口皮肤TIMP-1检测

TIMP-1主要定位于细胞膜和细胞浆，为多功能蛋白，广泛表达于创面皮肤角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞。

采用SABC法染色：即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，一抗为兔抗人的TIMP-1单克隆抗体(EPITOMICS公司)，方法和步骤按照试剂盒中的说明进行。

结果分析：

(1)糖尿病患者足部伤口皮肤细胞凋亡情况

本实施例通过Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色法和TUNEL两种方法检测非糖尿病患者和糖尿病患者足部伤口皮肤细胞凋亡情况；结果表明：糖尿病患者皮肤创面细胞凋亡明显增加，发生凋亡的细胞以真皮层中的成纤维细胞为主，有少量角质形成细胞发生；Cleaved Caspase-3在非糖尿病组和糖尿病组的表达(IRS评分)分别为1.04±0.23和3.04±0.31(图1)，差异具有统计学意义(p<0.05)；两组TUNEL检测凋亡率分别为3.8±0.8％和8.4±1.5％(图2)，差异具有统计学意义(p<0.05)。

(2)糖尿病患者足部伤口皮肤TIMP-1的蛋白表达情况

TIMP-1蛋白主要定位在细胞浆和胞膜，在糖尿病患者和非糖尿病患者皮肤创面的表皮层和真皮层成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞均有表达，但两者分布不同，强弱不等。在非糖尿病皮肤创面，TIMP-1在表皮靠近基底层的角质细胞呈强阳性表达，在真皮层呈中等强度阳性表达。在糖尿病患者皮肤创面，TIMP-1在巨噬细胞呈强阳性表达，在角质细胞和成纤维细胞呈弱阳性表达。糖尿病组和非糖尿病组IRS评分分别为6.2±1.76和3.5±1.01(图3)，差异具有统计学意义(p<0.05)，表明较之非糖尿病组，糖尿病组皮肤创面TIMP-1的蛋白表达水平下降。

实施例2糖基化终末产物(AGEs)对人皮肤成纤维细胞凋亡和TIMP-1表达的影响

(1)细胞来源本院泌尿外科或小儿外科正常儿童包皮环切术后的手术标本，均经患者家属同意后留取标本。实验对象为第4～6代细胞；

人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按1×10⁴/孔的密度接种至6孔板，细胞长至对数生长期60％融合，更换体积分数为0.5％的胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为2组：一组为正常对照组(含NG 5.6mmo/L，此处的NG是指正常浓度葡萄糖，以下细胞培养的所有的组都含NG的，因为NG是正常培养基的成份)，一组为糖基化终末产物(AGEs)组(含NG 5.6mmo/L和AGEs 150ug/mL)，按实验分组更换含或不含糖基化终末产物的培养基；继续培养72h；

(2)采用流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测细胞凋亡情况；

①用不含EDTA的胰酶消化细胞并用PBS洗涤；

②重悬细胞并计数(数量不少于10⁵)，然后1000g离心5min，收集细胞；

③加入400μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞；

④加入5μL AnnexinV-FITC(中山大学孙逸仙纪念医院医研中心提供)，轻轻混匀，室温避光孵育15min；

⑤加入10μL PI(中山大学孙逸仙纪念医院医研中心提供)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min；

⑥在30min内进行流式细胞仪检测；

(3)采用ELISA法测定上清中TIMP-1蛋白水平，测定方法如下(TIMP-1ELISA试剂盒，BLUE GENE公司)：

①收集步骤(2)细胞培养后的细胞上清液后4℃3000rpm离心30min，上清液于-80℃以下保存，待酶联免疫法测定；

②同步胰酶-EDTA消化步骤(2)培养的细胞，收集于离心管后进行细胞计数；

③建立标准曲线：取出酶标板，按照标准品的次序(浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5.0、10ng/mL)分别加入100uL的标准品溶液于空白微孔中；

④加样：待测品孔每孔各加入步骤①制备的待测样品100μL，空白对照加入100uL的蒸馏水；

⑤在各孔中加入50uL的酶标记溶液(不含空白对照孔),将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应1h；

⑥充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；

⑦各孔分别加入显色剂A 50uL和显色剂B 50uL；

⑧37℃下避光反应15min；

⑨各孔加入50uL终止液，终止反应，在酶标仪450nm波长测定光密度和浓度。

结果分析：

(1)糖基化终末产物(AGEs)对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测结果提示：人原代皮肤成纤维细胞在正常对照和含AGEs培养基中分别培养72h，凋亡率分别为2.43±0.19％、6.83±0.36％(图4)，差异具有统计学意义(p<0.05)。

(2)糖基化终末产物(AGEs)对人皮肤成纤维细胞TIMP-1表达的影响

在正常对照的培养基，人皮肤成纤维细胞上清液中TIMP-1的浓度4.84±1.63ng/mL；而在AGEs(150ug/mL)作用72h后的人皮肤成纤维细胞上清液中TIMP-1的浓度是2.64±0.98ng/mL，较之正常对照组下降45.5％(图5)。实验结果表明AGEs抑制人皮肤成纤维细胞TIMP-1蛋白表达，与实施例1中糖尿病患者足部伤口皮肤TIMP-1的蛋白表达水平下降一致。

实施例3外源rhTIMP-1对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

(1)细胞来源：同实施例2；

(2)流式细胞术细胞凋亡检测：

人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按1×10⁴/孔的密度接种至6孔板；细胞长至对数生长期60％融合，更换体积分数为0.5％的胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为3组：正常对照组、AGEs组和AGEs+rhTIMP-1组，按实验分组更换上述不同处理的培养基，其中，正常对照组的培养基中含NG 5.6mmo/L；AGEs组的培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL；AGEs+rhTIMP-1组培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhTIMP-1(浓度分别为1、10、50、100ng/mL，CYTOLAB/PEPROTECH ASIA公司)；分别继续培养48h、72h、96h和120h，用不含EDTA的胰酶消化细胞并用PBS洗涤后，送流式细胞仪进行Annexion-FITC联合PI双染法检测细胞凋亡，具体方法参照实施例2；

(3)TUNEL细胞凋亡检测：

人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按1×10⁴/孔的密度接种至96孔板；细胞长至对数生长期60％融合，更换0.5％(体积分数)胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为3组：正常对照组、AGEs组和AGEs+rhTIMP-1组，按实验分组更换上述不同处理的培养基，继续培养72h，其中正常对照组的培养基中含NG 5.6mmo/L；AGEs组的培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL；AGEs+rhTIMP-1组培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhTIMP-110ng/mL(CYTOLAB/PEPROTECH ASIA公司)；TUNEL法检测细胞凋亡情况，细胞TUNEL方法步骤如下：

①去培养基，PBS洗1次；

②吸干，加入质量分数为4％的聚甲醛固定1h，PBS洗5min×2次；

③加入体积分数为0.1％的Triton，冰上破膜2min，PBS洗5min×2次；

④配置TUNEL反应液(Enzyme Solution：Label Solution＝1：9)，冰上操作，即用即配；

⑤加入TUNEL反应液50uL，避光，37℃孵育60min，PBS洗5min×3次；

⑥加入Hochast(10ug/mL)50uL，复染6min，PBS洗5min×3次；

⑦吸干，荧光显微镜下观察；高倍镜下随机选取10个视野，计算凋亡率。

细胞核呈红色者即为凋亡细胞。凋亡率＝凋亡细胞数/细胞总数×100％。

(4)Cleaved Caspase-3Western blot检测：

Western blot检测步骤(3)中3种不同处理的细胞中Cleaved Caspase-3的表达水平；

a)总蛋白提取(以下步骤均在冰上完成)：

①吸弃细胞培养液，冷PBS轻轻冲洗2次。

②加入0.1mL预冷的细胞裂解缓冲液(200mM Tris-HCl，600mM NaCl，质量分数为1％的NaN₃，质量分数为1％的SDS，5mg/mL PMSF，100μg/mLaprotinin，质量分数为4％的NP-40，质量分数为5％的脱氧胆酸，均为终浓度)加入细胞单层中，冰上放置30min；

③用细胞刮将贴壁细胞刮落，把细胞碎片连同裂解液一起转移到微量离心管，4℃14000rpm离心30min；

④将上清小心转移到干净无菌离心管中，-80℃保存；

b)MiniBCA法测定提取物中蛋白质浓度：

①用0.5mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)制备0～500μg/mL系列浓度的标准蛋白液；

②步骤①系列浓度的标准蛋白液(25μL)与蛋白染色液(A+B)200μL混匀后，测定其在562nm波长处的光密度值并绘制标准曲线；其中染色液A的组成成份(终浓度)：质量分数为1％的BCA二钠盐，质量分数为2％的无水碳酸钠，质量分数为0.16％的酒石酸钠，质量分数为0.4％的氢氧化钠，质量分数为0.95％的碳酸氢钠，pH值11.25；染色液B的组成成份(终浓度)：质量分数为4％的硫酸铜；染色液A与染色液B按照体积50：1混匀即得到染色液(A+B)；

③每个蛋白样品取5μL，用20μL的三蒸水稀释至25μL，再与蛋白染色液(A+B)200μL混匀，测定其在562nm波长处的光密度值，在标准曲线上得到对应的浓度值，该浓度值×5即为待测蛋白的浓度；

c)蛋白质印迹

①制胶：制备质量分数为5％的变性聚丙烯酰胺浓缩胶和8％的变性聚丙烯酰胺分离胶；

②上样：10μL样品或预染蛋白Marker与10μL 2×变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液混匀，煮沸5min后上样于浓缩胶；

③电泳：以200V电泳至溴芬兰迁移至凝胶底部，电泳槽中放置冰袋以保持凝胶温度不超过20℃，单面胶电泳开始时电流应小于60mA，结束时电流应小于30mA；

④转膜：取出分离胶，在转膜缓冲液中与PVDF膜装配成湿转体系，以100V电转120min，湿转槽中放置冰袋以保持转移体系温度不超过20℃，单面胶电转开始时电流应小于250mA，结束时电流应小于350mA；

⑤小心地取出PVDF膜，可见预染marker已从凝胶转移至膜上；以20mL洗膜缓冲液洗涤5min×3次，不断摇晃；

⑥封闭：封闭液15mL浸膜，常温摇晃2h；

⑦加入15mL兔抗人Cleaved Caspase-3单克隆抗体(1：1000，封闭液稀释，CST公司)，4℃摇晃过夜；

⑧20mL洗膜缓冲液洗涤15min×1次及5min×2次，不断摇晃；

⑨加入15mL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1：2000，封闭液稀释，武汉博士德生物工程有限公司)，室温摇晃1h；

⑩20mL洗膜缓冲液洗涤15min×1次及5min×4次，不断摇晃；

显色：取ECL溶液1和溶液2(Thermo公司)各50μL，与蒸馏水1mL混匀即配成发光工作液；将发光液滴于膜上显色1～10min；

曝光：在暗室中用镊子小心地取出膜，用塑料膜包裹，将膜的蛋白面对着X光片曝光5min，立即冲洗；

洗膜：曝光后，用洗膜缓冲液摇晃冲洗5min×4次；将膜置于50℃洗脱缓冲液中摇晃30min；再次置于洗膜缓冲液摇晃5min×6次；将一抗换成内参照小鼠抗人单克隆GAPDH，二抗换成辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。

用BandScan 4.3软件对条带进行灰度扫描，以总灰度代表蛋白的表达量，以目的蛋白与GAPDH的比值代表目的蛋白水平。

结果分析：

(1)rhTIMP-1对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测，结果发现：rhTIMP-1作用72h后，抗凋亡作用逐渐呈现，随着作用时间的延长，不同浓度rhTIMP-1对AGEs(150ug/mL)诱导的细胞凋亡的影响不同，低浓度1～10ng/mL对细胞凋亡有保护作用，中等浓度50ng/mL对凋亡无影响，而高浓度100ng/mL促进细胞凋亡(表1)。

表1不同浓度rhTIMP-1对AGEs诱导的细胞凋亡率比较(％)

注：*:与NG对比，p<0.05；#:与NG+AGEs对比，p<0.05。

(2)TUNEL法检测凋亡的结果

对照组、AGEs组和AGEs+rhTIMP-1组凋亡率分别为3.2±1.01％、14.5±2.99％和6.8±1.76％，组间差异具有统计学意义(p<0.05)，提示rhTIMP-1(10ng/ml)作用72h对AGEs诱导的原代皮肤成纤维细胞凋亡有保护作用(图6)。

(3)Western Blot法检测rhTIMP-1(10ng/mL)作用72h对AGEs诱导的Cleaved Caspase-3表达水平的影响。激活的Caspase-3在引起凋亡中起关键作用，表达增高时提示细胞凋亡增加。结果：与正常对照组相比，AGEs(150ug/mL)作用使Cleaved Caspase-3表达明显增加82.7±7.3％，rhTIMP-1(10ng/mL)使AGEs诱导增加的Cleaved Caspase-3表达下降71±4.5％(图7)。结果提示rhTIMP-1(10ng/mL)作用72h对AGEs诱导的原代皮肤成纤维细胞凋亡有保护作用。

实施例4腺病毒介导内源性TIMP-1过表达对AGEs诱导的皮肤成纤维细胞凋亡的影响

(1)重组质粒pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1的构建

①cDNA模板的获得和引物设计：

TIMP-1基因CDS序列如下所示：

ATGGCCCCCTTTGAGCCCCTGGCTTCTGGCATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAGCCCCCAGCAGGGCCTGCACCTGTGTCCCACCCCACCCACAGACGGCCTTCTGCAATTCCGACCTCGTCATCAGGGCCAAGTTCGTGGGGACACCAGAAGTCAACCAGACCACCTTATACCAGCGTTATGAGATCAAGATGACCAAGATGTATAAAGGGTTCCAAGCCTTAGGGGATGCCGCTGACATCCGGTTCGTCTACACCCCCGCCATGGAGAGTGTCTGCGGATACTTCCACAGGTCCCACAACCGCAGCGAGGAGTTTCTCATTGCTGGAAAACTGCAGGATGGACTCTTGCACATCACTACCTGCAGTTTTGTGGCTCCCTGGAACAGCCTGAGCTTAGCTCAGCGCCGGGGCTTCACCAAGACCTACACTGTTGGCTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCCCTGCAAACTGCAGAGTGGCACTCATTGCTTGTGGACGGACCAGCTCCTCCAAGGCTCTGAAAAGGGCTTCCAGTCCCGTCACCTTGCCTGCCTGCCTCGGGAGCCAGGGCTGTGCACCTGGCAGTCCCTGCGGTCCCAGATAGCCTGA

模板获得和引物设计：离心收集人体细胞，用Trizol方法提取总RNA，用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)反转录获得cDNA模板，-20℃保存备用；根据根据NCBI数据库中TIMP-1基因的序列信息，设计带有Not I、EcoRV酶切位点的扩增引物，引物序列如下(划线部分分别为相应的酶切位点)：

TIMP1NotIF：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3'；

TIMP1EcoRVIR：

5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG-3'；

②TIMP-1基因CDS序列的获得和重组载体pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1的构建：

PCR扩增反应体系(模板量为cDNA原液稀释20倍后取0.5μL)如下：2mMdNTP mixture 2.5μL；10×KOD buffer 2.5μL；25mM MgSO₄1.5μL；模板0.5μL；引物TIMP1NotIF 0.3μL；引物TIMP1EcoRVR 0.3μL；KOD plus neo 0.3μL；ddH₂O补至25μL；PCR反应程序：94℃5min；98℃30sec，62℃30sec，68℃50sec，30个循环；68℃5min；16℃保存；

酶切：PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(DONGSHENG BIOTECH)回收；分别取PCR回收产物15μL和pDC316-mCMV-EGFP载体(广州莱德尔生物科技有限公司)各15μL，用Not I与EcoR V双酶切：37℃反应3h，酶切体系：模板15μL；Not I 1.5μL；EcoR V 1.5μL；10×buffer 5μL；ddH₂O补至50μL；

连接：上述酶切产物用DNA凝胶回收试剂盒(DONGSHENG BIOTECH)回收；将酶切后的PCR产物和载体16℃连接2h，连接体系如下：目的片段3μL；载体2μL；10×Ligase Buffer 1μL；T4DNA Ligase 1μL；ddH₂O补至10μL；

连接产物的转化：冰浴中将5μL连接产物加入至50μL DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min；42℃水浴热休克90s；快速将管转移至冰浴中，冰浴2min；分别加入200μL LB培养基，混匀，37℃、200rpm振荡培养1h；于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/mL)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收；倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养；

质粒酶切鉴定阳性克隆：从平板上挑取3个单克隆于3mL LB管中摇床过夜培养；用高纯质粒小量提取试剂盒(G-SHUN)提取质粒，用Not I与EcoR V双酶切鉴定，同时送样测序(华大基因公司)；

(2)AD-TIMP-1腺病毒包装、扩增和滴度测定

实验原理：本实验采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统(广州莱德尔生物科技有限公司)，AdMaxTM重组腺病毒系统的基本原理是通过Cre-loxp重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组腺病毒是E1/E3缺失的复制型腺病毒。

1)细胞的复苏与传代

于液氮罐中取出冻存的HEK293细胞(广州莱德尔生物科技有限公司)，37℃水浴快速融化，然后将其接种于25cm²培养瓶中，加入DMEM培养基(含10％胎牛血清)，置于培养箱37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90％以上聚集度时传代，将培养基吸出加入500μL质量分数为0.25％的胰蛋白酶室温下短暂消化，于显微镜下观察当细胞皱缩变圆时立即加入DMEM培养基，反复吹打成细胞悬液，血球计数板计数，以含10％胎牛血清的DMEM调整细胞密度后重新接种于6孔板中，密度为8×10⁵cell/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜。

2)脂质体法转染HEK293细胞

①传代，次日上午进行转染实验(转染前将细胞培养基换成无双抗培养基)。

②转染试剂的准备：

A溶液：240uL无血清培养基+10uL lipofectamine 2000(总体积为250uL)；B溶液：1uL腺病毒载体穿梭质粒(广州莱德尔生物科技有限公司)+4uL骨架质粒(重组质粒pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1)+245uL无血清培养基(总体积为250uL)；A溶液与B溶液均温育5min；

③将B液与A液混合均匀(注意动作要轻柔)，室温静置30min；将500uL混合液逐滴加入含有293细胞的培养板中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5％的CO₂中培养4～6h换完全培养基培养；

④待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm²细胞培养皿中，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，观察出毒迹象。(细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落。待细胞大部分病变并从培养瓶壁脱落后，进行收毒，为第一代毒种P1。)

3)重组腺病毒AD-TIMP-1的扩增

培养扩增HEK293细胞，当细胞汇合度达到80％～90％时加入第一代病毒P1，感染48h后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10000g离心10min收集病毒上清；病毒扩增至P3代；用腺病毒纯化试剂盒纯化P3代病毒；

4)病毒生物学滴度测定

在滴度测定前一天取48孔板，加入3×10⁴cell/孔HEK 293细胞。用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。具体做法如下：取96孔板，每孔含有90uL培养基，第一横排孔每孔加入10uL待测病毒原液，混匀后吸取10uL混合液至第二横排孔(混匀时尽量不要产生气泡)，如此稀释至第八横排孔。吸10uL病毒混合液加入到相对应的48孔板中。经48小时感染，借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察)，在最高稀梯度m的孔数出N(N<10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10^m/mL(m为稀释梯度)，若N>10，则需继续稀释。

同样方法，将空载体pDC316-mCMV-EGFP与腺病毒载体穿梭质粒共转染HEK293细胞，获得腺病毒AD-EGFP；

(3)人皮肤成纤维细胞的病毒转染率和细胞存活率测定

皮肤成纤维细胞等量转种于6孔板中，按不同MOI进行AD-TIMP-1转染(MOI值分别为0、50、100、500、1000)。转染48h后，收集细胞。流式细胞仪检测转染率。以转染AD-EGFP作为对照。

皮肤成纤维细胞等量转种于6孔板中，按不同MOI进行AD-TIMP-1转染(MOI值分别为0、10、50、100、200和500)，分别于转染后3d、4d、5d收集细胞。流式细胞仪检测存活细胞数。以转染AD-EGFP作为对照。

(4)EGFP和TIMP-1在人皮肤成纤维细胞的表达

皮肤成纤维细胞等量转种于多孔板中，按MOI值100进行AD-TIMP-1转染，转染后1d、2d、3d、5d、7d、10d在荧光显微镜下490nm激发光下观察EGFP在皮肤成纤维细胞中表达情况。以转染AD-EGFP作为对照。

皮肤成纤维细胞等量转种于多孔板中，按MOI值100进行AD-TIMP-1转染，分别于转染后1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d收集细胞上清液，ELISA检测TIMP-1浓度。以无感染组和AD-EGFP组作为对照，具体实验方法与步骤参照实施例2。

(5)AD-TIMP-1转染对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

皮肤成纤维细胞等量转种于96孔板中，细胞长至对数生长期60％融合，更换0.5％(体积分数)胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为4组：正常对照组、AGEs组、AGEs+AD-EGFP组和AGEs+AD-TIMP-1组，按上述实验分组处理细胞，继续培养72h，其中，正常对照组的培养基不含AGEs且细胞不做转染；AGEs组的培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL，细胞不做转染；AGEs+AD-EGFP组的培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL，并按MOI值100进行AD-EGFP转染；AGEs+AD-TIMP-1组培养基含NG 5.6mmo/L+AGEs 150ug/mL，并按MOI值100进行AD-TIMP-1转染；TUNEL法检测细胞凋亡情况，具体试验方法和操作同实施例3；

结果分析：

(1)pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1质粒的构建和鉴定结果

以人TIMP-1基因cDNA作为模板进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在大约624bp的位置上出现TIMP-1基因的条带(图8A)，大小与预测一致，证明TIMP-1目的基因已扩增出来。筛选的质粒pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，在624bp相应的位置切出一条目的条带(图8B)，说明筛到的克隆为阳性克隆；核酸序列测序后经Blast比对，克隆的基因序列与GenBank中登记的已知序列99％一致，其中一个碱基突变不改变氨基酸序列，TTT第三个T变成C，氨基酸都是一样(phe)，对后面实验不影响，所以可用于后续实验。

(2)AD-TIMP-1腺病毒的扩增、滴度测定结果

重组质粒pDC316-mCMV-EGFP-TIMP-1转染HEK293细胞，获得含目的基因的腺病毒，标记为AD-TIMP-1；同时用质粒pDC316-mCMV-EGFP做空白对照，标记为AD-EGFP。转染后24h在荧光显微镜下观察到EGFP表达，随着转染细胞的传代，荧光细胞越来越少，但是转染后8天，细胞出现了扩增现象，荧光细胞呈现片状，第10天出现大片荧光细胞(图9)。此时反复冻融裂解细胞，收集上清，获得第一代病毒。第一代病毒AD-TIMP-1感染扩增HEK293细胞(图10)，得到第二代病毒。如此反复感染细胞得到高滴度病毒。经荧光计数法测得AD-TIMP-1的滴度是1.0×10¹⁰Tu/mL，AD-EGFP的滴度为1.0×10¹⁰Tu/mL。

(3)AD-TIMP-1对人皮肤成纤维细胞的转染率

AD-EGFP和AD-TIMP-1感染人皮肤成纤维细胞48h，随着感染复数(MOI)增加，转染率增高。组间差异无统计学意义(p>0.05)。MOI≥100时，转染率高达90～99％(表2，图11)。

表2AD-TIMP-1和对照病毒AD-EGFP对人皮肤成纤维细胞的转染率比较(％)

注：组间比较，p>0.05。

(4)人皮肤成纤维细胞感染AD-TIMP-1的存活率

当MOI≤100，感染AD-TIMP-1的人皮肤成纤维细胞持续培养72～120h，细胞存活率与无感染组(MOI＝0)相当；MOI为200时，细胞培养至120h，存活率下降；MOI为500时，细胞培养至96h，存活率下降(表3、图12)。结合前面转染率实验结果，提示MOI为100时细胞转染率高，而且不影响细胞存活，是较为理想的实验条件。

表3人皮肤成纤维细胞感染AD-TIMP-1后不同时间存活率比较(％)

注：*与MOI＝0对比，p<0.05。

(5)EGFP、TIMP-1在人皮肤成纤维细胞的表达

以感染复数为100的AD-EGFP、AD-TIMP-1感染人皮肤成纤维细胞24h后，就可以在荧光显微镜下观察到EGFP的表达(发绿色荧光)，随着感染时间延长，细胞传代扩增，表达量逐渐增多，第5～7天达高峰，随后细胞逐渐衰老、死亡，表达减少(图13)。ELISA方法检测上清液中TIMP-1浓度，三组不同时间点浓度见表4。随着时间延长，TIMP-1浓度逐渐增高，5天达高峰后逐渐下降，与荧光镜下观察到的EGFP的变化趋势一致。与无感染对照组和AD-EGFP组对比，AD-TIMP-1组TIMP-1表达量显著增高，第2～10天表达量差异有统计学意义(p<0.05)；无感染对照组和AD-EGFP组组间差异无统计学意义(p>0.05)(表4、图14)。

表4不同处理组人皮肤成纤维细胞上清液TIMP-1浓度比较(ng/ml)

注：*与无感染组(CON)对比，p<0.05；#与AD-EGFP组对比，p<0.05。

(6)AD-TIMP-1转染对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

腺病毒介导TIMP-1过表达72h，使AGEs诱导的细胞凋亡降低。AGEs组、转染对照病毒组和转染TIMP-1病毒组细胞凋亡率分别为14.5±3.08％、18.3±3.2％和8.5±1.5％(图15)，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例5TIMP-1的抗凋亡作用对糖尿病大鼠伤口愈合的影响

(1)糖尿病大鼠创面模型制作

①取40只250～300克清洁级SD大鼠(购自广州中山大学实验动物中心)，适应性饲养1周后，腹腔内注射50mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病，注射1周后尾静脉采血检测随机血糖水平，注射后随机血糖水平≥16.7mmol/L，视为糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠实验期间自由进食、饮水，每周监测体重和血糖，根据血糖水平皮下注射低精蛋白胰岛素(NPH)1-2U/d，血糖维持在16.7mmol/L～27mmol/L。

②糖尿病大鼠成模4周后，质量分数为10％的水合氯醛0.3mL/kg腹腔注射麻醉，背部剪毛，体积分数为75％的酒精消毒，以边长为1.5cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后1.5cm处形成一个1.5cm×1.5cm的正方形伤口，切除范围深达筋膜，伤口形成后每只大鼠单笼饲养。整个伤口(包括伤口周围5mm内的正常皮肤)直至筋膜被切除分析，部分标本液氮保存用于Western blot，部分标本固定于质量分数为4％的多聚甲醛溶液中，用于组织学和免疫组化检查。

(2)实验分组与创面处理

表5成模雄性SD糖尿病大鼠40只分组

实验动物按创面处理因素的不同分4大组，每组按不同处理时间再分为7天组和14天组(见表5)。致伤后4h内进行创面处理(图16)。PBS对照组：创面边缘点状注射PBS 100uL；rh-TIMP-1水溶液组：创面边缘点状注射rh-TIMP-1水溶液(10ug/100uL)；AD-EGFP组：创面边缘点状注射AD-EGFP(0.5×10⁹TU/100uL)；AD-TIMP-1组：创面边缘点状注射AD-TIMP-1(0.5×10⁹TU/100uL)。

(3)标本取材

伤口形成后7d、14d切取整个伤口(含伤口周围5mm内皮肤，深达筋膜),同时留取心脏、肝脏、肾脏组织，部分标本液氮保存用于Western blot，部分标本固定于质量分数为4％的多聚甲醛溶液中，进行石蜡包埋切片，用于TUNEL检测和组织学检查。

(4)指标检测

1)安全性观察：伤口局部情况观察和心脏、肝脏、肾脏组织HE染色：

①切片脱蜡至水：切片经二甲苯脱蜡，然后进行浓度下行的梯度酒精直至蒸馏水；②苏木素染色5min，自来水冲洗；③盐酸乙醇分化10sec(提插数下)；④自来水浸泡15min；⑤置伊红溶液中1min；⑥常规脱水，二甲苯透明，中性树脂封固；

2)伤口愈合率：分别在伤口形成后0d、7d、14d用数码相机进行伤口拍摄(A610，Canon)，同时放置一个有刻度直尺并标明大鼠的号码。伤口面积用Image J(1.36b版本)进行计算。愈合率＝(伤口面积(0d)-伤口面积(n d))/伤口面积(0d)×100％(1.Peppa M,Brem H,Ehrlich P,et al.Adverse effects ofdietary glycotoxins on wound healing in genetically diabetic mice.Diabetes,2003,52:2805–2813.2.Jacobi J,Jang JJ,Sundram U,et al.Nicotine accelerates angiogenesisand wound healing in genetically diabetic mice.Am J Pathol,2002,161:97–104.)。每次测量重复2次，取其平均数。

3)糖尿病大鼠伤口皮肤TIMP-1蛋白水平检测：提取皮肤组织总蛋白后，采用蛋白质印迹法测定：

①皮肤组织总蛋白提取(以下步骤均在冰上完成)：从-80℃低温冰箱迅速取出标本，立即转移至有液氮的研钵中，持续研磨，一边研磨一边加液氮，研磨成颗粒状。将颗粒物倒入已经加入1mL RIPA和10μL PMSF的玻璃匀浆器中匀浆，间或匀浆，避免起泡沫和发热，冰上放置30min。将样品转移倒1.5mL离心管，4℃高速离心30min。将上清小心转移到干净无菌离心管中，-20℃保存。

②MiniBCA法测定提取物中蛋白质浓度：参照实施例3；

③蛋白质印迹：参照实施例3，其中一抗为兔抗大鼠TIMP-1抗体，二抗为山羊抗兔IgG。

(5)细胞凋亡：TUNEL法，具体实验方法与步骤参照实施例3；

结果分析：

(1)糖尿病大鼠伤口模型的建立

SD大鼠腹腔注射STZ 7d后，各个时间点随机血糖均高于16.7mmol/L，范围波动为17～27mmol/L。成模后体重均明显下降。从血糖和体重随时间变化的趋势看，PBS对照组(A)、rh-TIMP-1组(B)、AD-EGFP组(C)和AD-TIMP-1组(D)4组组间血糖值、体重值差异无统计学意义(p>0.05)。实验期间血糖和体重对伤口愈合的影响在各组间取得均衡(见表6、7)。

表6不同时间4组血糖值的比较(mmol/L)

注：各组间比较，p>0.05；A：PBS对照组；B：rhTIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组；

表7不同时间4组体重值的比较(g)

注：各组间比较，p>0.05；A：PBS对照组；B：rhTIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组。

(2)腺病毒在糖尿病大鼠伤口局部点状注射的安全性观察

4个不同处理组的糖尿病大鼠伤口均无发生明显红肿、渗液等感染和炎症征象，心、肝、肾组织HE染色，结构未见明显异常(图17)，提示含或不含TIMP-1的腺病毒局部点状注射治疗具有良好的安全性。

(3)糖尿病大鼠伤口皮肤TIMP-1蛋白水平

TIMP-1蛋白在各组伤口形成前皮肤中呈低表达，伤口形成后表达水平增高，达高峰后逐渐下降。0d时PBS对照组、rh-TIMP-1组、AD-EGFP组和AD-TIMP-1组组间差异无统计学意义(p>0.05)。伤口形成后的第7d和14天，腺病毒AD-TIMP-1可以介导大鼠皮肤伤口TIMP-1过表达，TIMP-1水平显著高于其他三组，差异具有统计学意义(p<0.05)；第7d和14d表达水平分别是AD-EGFP组的1.70倍和1.67倍；其余三组组间差异无统计学意义(p>0.05)(表8、图18)。

表8不同时间4组TIMP-1蛋白表达水平的比较

注：*与PBS组对比，p<0.05；#与rhTIMP-1组对比，p<0.05；△与AD-EGFP组对比，p<0.05。A：PBS对照组；B：rhTIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组

(4)糖尿病大鼠伤口愈合率比较

见表9和图19，腺病毒介导TIMP-1过表达促进糖尿病大鼠伤口愈合。从伤口愈合率随时间变化的趋势看，4组愈合率的差别具有统计学意义(p<0.05)。AD-TIMP-1组在各个时间点愈合率均最高。伤口形成后的第7天，AD-TIMP-1组愈合率高于AD-EGFP组(p<0.05)，其余组间差异无统计学意义。伤口形成后的第14天，AD-TIMP-1组与PBS组、AD-EGFP组对比，差异均有统计学意义(p<0.05)；rhTIMP-1水溶液组与其他组间差异无统计学意义(p>0.05)。

表9不同时间4组伤口愈合率比较(％)

注：*与PBS对比p<0.05,△与AD-EGFP对比，p<0.05。A：PBS对照组；B：rhTIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组。

(5)糖尿病大鼠伤口细胞凋亡率比较

见表10、图20，与PBS组和AD-EGFP组对比，伤口形成后的第7天和14天，AD-TIMP-1组细胞凋亡减少(p<0.05)，其余组间差异无统计学意义。

表10不同时间4组伤口凋亡率比较(％)

注：*与PBS对比，p<0.05；△与AD-EGFP对比，p<0.05。

A：PBS对照组；B：rhTIMP-1组；C：AD-EGFP组；D：AD-TIMP-1组

上述实施例从整体、组织、细胞水平同步观察了细胞凋亡、TIMP-1表达在糖尿病皮肤病变中的作用和意义。并深入探讨两者之间的关系，发现：①皮肤组织细胞凋亡增加和TIMP-1水平下降是糖尿病皮肤伤口难愈的重要原因之一。②低浓度TIMP-1有抗AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的作用；腺病毒介导糖尿病大鼠伤口过表达TIMP-1，有抗皮肤组织细胞凋亡、促进伤口愈合的作用。研究结果为阐明糖尿病创面难愈的发病机制提供了新的依据，为糖尿病皮肤创面的基因治疗确立新的靶点提供了实验依据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：所述的TIMP-1基因作为糖尿病足治疗的生物因子之一，抑制由于高糖导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合。

2.根据权利要求1所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于所述的治疗糖尿病皮肤创面产品包括：用TIMP-1基因和腺病毒载体或慢病毒载体构建携带TIMP-1基因的重组表达载体；将携带TIMP-1基因的重组表达载体和腺病毒载体穿梭质粒共转染HEK293细胞，获得携带TIMP-1基因的重组腺病毒；将携带TIMP-1基因的重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞。

3.根据权利要求2所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

所述的携带TIMP-1基因的重组表达载体，是将TIMP-1基因序列与腺病毒载体或慢病毒载体连接得到的。

4.根据权利要求3所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

所述的腺病毒载体为pDC316-mCMV-EGFP。

5.根据权利要求4所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

所述的携带TIMP-1基因的重组表达载体的制备方法，包含如下步骤：

(1)引物设计：

根据NCBI数据库中TIMP-1基因的CDS序列信息，设计带有Not I、EcoRV酶切位点的扩增引物，引物序列如下：

TIMP-1NotIF：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3'；

TIMP-1EcoRVIR：

5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG-3'；

(2)TIMP-1基因CDS片段的获得：

以人cDNA为模板，使用步骤(1)设计的引物TIMP-1NotIF和TIMP1EcoRVIR扩增回收TIMP-1基因CDS片段；

(3)携带TIMP-1基因的重组表达载体的构建

将步骤(2)中回收后的TIMP-1基因CDS片段与载体pDC316-mCMV-EGFP分别用Not I、EcoR酶切并连接，得到携带TIMP-1基因的重组表达载体。

6.根据权利要求2所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

所述的携带TIMP-1基因的重组腺病毒的制备方法，包含如下步骤：

1)重组腺病毒AD-TIMP-1的包装

采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统，腺病毒载体穿梭质粒和携带TIMP-1基因的重组表达载体共转染HEK293细胞，在Cre-loxp重组酶作用下包装形成E1/E3缺失的复制型腺病毒；当大部分细胞收缩变圆、脱落时，离心收集细胞，反复冻融裂解细胞后收集上清，得到第一代重组腺病毒；

2)重组腺病毒AD-TIMP-1的扩增

培养扩增HEK293细胞，当细胞汇合度达到80～90％时加入第一代重组腺病毒；感染48h后收集细胞，反复冻融裂解细胞，离心、收集病毒上清，得到第二代重组腺病毒；

3)高滴度重组腺病毒的获得

重复步骤2)，反复感染HEK293细胞，获得高滴度重组腺病毒。

7.根据权利要求6所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

步骤1)中所述的共转染采用脂质体法进行共转染。

8.根据权利要求6所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：

所述的反复冻融裂解细胞的具体操作为-80℃/37℃反复冻融3次。