CN104429945B - 适用于多基因型的苦瓜高效再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适用于多基因型的苦瓜高效再生体系的建立方法，所述方法包括前处理、不定芽的诱导、继代培养、不定芽的伸长、生根培养、炼苗和移栽步骤。在前处理过程中，所用植物生长调节剂为浓度为1‑5mg/L的6‑BA；在不定芽的诱导过程中，所用植物生长调节剂为6‑BA和KT，6‑BA的浓度为1‑4mg/L，KT的浓度为0.1‑1.0mg/L；在不定芽的伸长过程中，所用植物生长调节剂为6‑BA和IBA，6‑BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.1‑0.3mg/L。本发明不仅适应于多基因型苦瓜的再生培养，而且具有诱导率高、不定芽诱导数目多、不定芽长以及实施条件不苛刻的优点，具有良好的推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及适用于多基因型的苦瓜高效再生体系的建立方法。
背景技术
苦瓜是我国南方地区一种重要的药食兼用蔬菜，有“君子菜”的别称。随着其降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗艾滋等功效的发现，苦瓜现已受到消费者的广泛青睐，种植面积也在逐年增加。由于对苦瓜需求的不断增加，苦瓜的育种目标也趋向于多元化的发展。但是传统的遗传育种存在种质资源匮乏，育种周期太长，后代表现出的遗传性状不稳定等不足，这些都严重的制约了苦瓜优良品种的选育；而植物基因工程技术则为优质、高产、高抗的苦瓜新品种的选育开辟了一条新的途径。
植物遗传转化即转基因技术是近四十年来发展起来的一项生物技术，利用该技术可以在保持植物原有较好遗传背景的前提下定向改变某些性状，且能大大缩短育种时间，目前转基因技术已成为植物遗传育种的主要研究领域。然而转基因技术极大的依赖于外植体能够高效稳定再生成完整植株的技术，建立高效稳定的遗传转化受体系统是转基因育种的基础。而目前对苦瓜离体培养的研究较少，多是通过茎尖或带芽茎段进行快速繁殖获得再生植株，也有学者利用苦瓜的子叶和胚轴等外植体进行离体培养并获得再生植株，但是总的看来苦瓜外植体在离体培养过程易于形成愈伤组织而不定芽再生困难，不定芽诱导率和不定芽长度都不理想；另外就是苦瓜再生能力存在基因型依赖性，不同基因型之间再生能力存在显著差异，至今还没有建立一个适合多个基因型的苦瓜再生体系。因此，系统深入研究离体培养诱导苦瓜植株再生的方法，建立针对多个基因型苦瓜的高效稳定的再生体系，具有重要意义，可为苦瓜转基因育种工作提供理论基础和实验依据，同时将有效推进苦瓜生物技术育种进程。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的苦瓜高效再生体系的建立方法。构建方法包括以下步骤：
1）前处理：将苦瓜种子剥去种皮后进行灭菌，然后放入含6-BA的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1-5mg/L；
2）不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入含6-BA 和KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为2-4mg/L，KT的浓度为0.1-1.0mg/L；
3）继代培养：将步骤2）所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于含6-BA和 KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16 h/天,6-BA的浓度为2-4mg/L，KT的浓度为0.1-1.0mg/L；
4）不定芽的伸长：将步骤3）所得物放入含6-BA和IBA的MS培养基进行培养，培养时间为14天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L；
5）生根培养：将步骤4）所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶中培养，培养时间为14天，培养温度为保持在23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，所述生根培养基为1/2 MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5.8；
6）炼苗：选取经步骤5）培养后的根长为4-5 cm的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2天，再半开2天，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分；
7）移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养2 d，1-2周后再移到室外进行培养。
所述的灭菌过程为：剥去苦瓜种子的种皮，先用75%的酒精浸泡消毒1min，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。
在切取带一个子叶的子叶节时，节点距上胚轴1 mm，距下胚轴5 mm。
所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
优选的，步骤1）中的MS培养基中6-BA的浓度为4mg/L。当步骤1）中的6-BA的浓度为4mg/L时，不定芽的诱导率为98.37%，不定芽数量、不定芽长度、主芽数量、主芽长度、丛芽数量和丛芽长度的情况均为最优。
优选的，步骤2）中的6-BA的浓度为3.0mg/L，KT的浓度为0.5mg/L，当6-BA浓度为3.0mg/L,KT浓度为0.5 mg/L时，不定芽数量和不定芽芽长的综合情况最优。
优选的，步骤4）中的MS培养基中，6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L。当6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L时，对不定芽长度和主芽长度诱导效果最好。
本发明具有如下有益效果：
1、适用于多个基因型，有较大推广前景；
2、不定芽诱导率高，不定芽诱导数多，生长良好的不定芽有利于之后遗传转化体系的建立；
3、实施步骤简单，实施条件不苛刻。
附图说明
图1：带一个子叶的子叶节；
图2：不定芽诱导情况；
图3：不定芽生根情况；
图4：再生植株生长情况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
选取大小均匀、饱满的苦瓜种子，在超净工作台上剥去苦瓜种皮，先用75%的酒精浸泡消毒1min，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次，然后置于培养皿内的无菌滤纸上，用消毒后的镊子将种子接种在培养基上，每瓶接种10粒种子。
将苦瓜种子放入含6-BA的MS培养基进行培养，设不含6-BA的MS培养基为空白组，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1-5mg/L。再于含6-BA和KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，设三组实验组，第一组中6-BA的浓度为2.0mg/，KT的浓度为0.1mg/L；第二组中6-BA的浓度为4.0mg/L，KT的浓度为1.0mg/L；第三组中6-BA的浓度为3.0mg/L，KT的浓度为0.5mg/L；实验结果取三组实验结果平均值。
6-BA前处理对不定芽诱导的影响见表1。
表1
| 6-BA mg.L-1 | 不定芽数量(个) | 不定芽长度(cm) | 主芽数量(个) | 主芽长度(cm) | 丛芽数量(个) | 丛芽长度(cm) | 不定芽诱导率(%) |
| 0/0 | 6.53d | 0.631d | 2.78c | 0.917d | 3.75d | 0.347d | 50.71e |
| 1.0/0 | 7.49c | 0.734c | 3.31b | 1.251c | 4.18c | 0.541c | 58.49de |
| 2.0/0 | 7.76c | 0.757c | 3.39b | 1.375bc | 4.37c | 0.578c | 63.67d |
| 3.0/0 | 9.09ab | 0.986b | 4.17a | 1.436b | 4.92b | 0.609b | 85.42c |
| 4.0/0 | 9.63a | 1.113a | 4.38a | 1.736a | 5.25a | 0.874a | 98.37a |
| 5.0/0 | 8.65b | 1.078ab | 3.63b | 1.391b | 5.02ab | 0.763ab | 90.08b |
由表1可以看出，不用6-BA进行前处理时，不定芽诱导率仅为50.71%。随着前处理激素6-BA浓度的升高，不定芽诱导率显著提高，当6-BA浓度为4.0 mg/L时，诱导率达最大值，为98.37%。另外，用6-BA进行前处理还可以明显促进不定芽诱导数量及不定芽长度，当6-BA浓度小于4.0 mg/L时，不定芽诱导数和长度都随6-BA的浓度升高而增加，当6-BA浓度为4.0 mg/L时，获得最理想的不定芽诱导数和长度。
实施例2
当前处理中6-BA的浓度为4mg/L时，经前处理后，从前处理后的无菌苗上切取带一个子叶的子叶节，节点距上胚轴1 mm，距下胚轴5 mm，然后接种到不定芽诱导培养基上，每瓶接种5-6个外植体，然后放入含6-BA和KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为2-4mg/L，KT的浓度为0.1-1.0mg/L。当前处理中6-BA的浓度为4mg/L时，6-BA 和 KT组合对不定芽诱导的影响见表2。
表2
| 6-BA/ KT mg.L-1 | 不定芽数量(个) | 不定芽长度(cm) | 主芽数量(个) | 主芽长度(cm) | 丛芽数量(个) | 丛芽长度(cm) | 不定芽诱导率(%) |
| 2.0/0.1 | 7.59c | 0.830c | 3.74bc | 1.456c | 3.85c | 0.615c | 100.0a |
| 2.0/0.5 | 7.15d | 0.809c | 3.37c | 1.295d | 3.78c | 0.674bc | 100.0a |
| 2.0/1.0 | 6.07e | 0.720d | 2.83d | 1.347d | 3.24d | 0.537d | 100.0a |
| 3.0/0.1 | 8.26b | 0.952b | 3.95b | 1.673b | 4.31b | 0.693b | 100.0a |
| 3.0/0.5 | 9.45a | 1.125a | 4.32a | 1.816a | 5.13a | 0.832a | 100.0a |
| 3.0/1.0 | 8.53b | 0.937b | 4.17ab | 1.798a | 4.36b | 0.711b | 100.0a |
| 4.0/0.1 | 7.96bc | 0.871bc | 3.89b | 1.631b | 4.07bc | 0.704b | 100.0a |
| 4.0/0.5 | 7.61c | 0.876bc | 3.58c | 1.587bc | 4.03bc | 0.659bc | 100.0a |
| 4.0/1.0 | 7.13d | 0.814c | 3.31c | 1.423c | 3.82c | 0.611c | 100.0a |
由表2可以看出，随着6-BA浓度从2.0 mg/L增加到3.0 mg/L，不定芽诱导数量和长度都显著增加，当6-BA浓度增加到4.0 mg/L时，不定芽诱导数量和长度又小幅度降低。当6-BA浓度为3.0mg/L,KT浓度为0.5 mg/L时，不定芽数量和不定芽芽长的综合情况最优。
实施例3
将经过前处理、不定芽诱导和继代培养的不定芽放入含6-BA和IBA的MS培养基进行培养，培养时间为14天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L；前处理中的MS培养基中6-BA的浓度为4mg/L；不定芽诱导中的MS培养基含有6-BA和KT，6-BA的浓度为3.0mg/L,KT的浓度为0.5mg/L。继代培养前，将不定芽诱导出的不定芽的腋芽切下，弃掉，继代培养条件与不定芽培养条件一致。
不同浓度6-BA和IBA对不定芽伸长诱导的影响见表3。
由表3可以看出，不同浓度6-BA 和IBA 对主芽伸长诱导有显著性影响，但对丛芽伸长诱导无显著影响。当不定芽伸长诱导培养基浓度为6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L时，对不定芽长度和主芽长度诱导效果最好，选择6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L作为最佳不定芽伸长诱导剂。
实施例4
分别取长白、月华、翠妃和秋月4个基因型苦瓜种子进行再生培养。再生培养时，前处理6-BA的浓度为 4.0mg/L，不定芽诱导和继代培养的培养基添加的6-BA的浓度为3.0mg，KT的浓度为0.5 mg/L，研究不同基因型对不定芽诱导的影响，继代培养结束时记录数据。前处理、不定芽诱导和继代培养时，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，前处理的培养时间为7天，不定芽诱导的培养时间为7天，继代培养的培养时间为7天。不同基因型对不定芽诱导的影响见表4。
表4
| 基因型 | 不定芽数(个) | 不定芽长(cm) | 主芽数量(个) | 主芽长度(cm) | 丛芽数量(个) | 丛芽长度(cm) | 不定芽诱导率(%) |
| 长白 | 8.13b | 0.917bc | 3.34b | 1.357b | 4.79b | 0.406b | 92.57b |
| 月华 | 7.98b | 0.982b | 3.57b | 1.603a | 4.41b | 0.481b | 100.0a |
| 翠妃 | 9.62a | 1.183a | 4.25a | 1.625a | 5.37a | 0.693a | 100.0a |
| 秋月 | 6.44c | 0.851c | 2.79c | 1.346b | 3.65c | 0.447b | 89.73b |
由表4可以看出，此次实验建立的苦瓜再生体系对不同基因型都能诱导出不定芽，且不定芽诱导率在89.73 %以上，不定芽个数、主芽个数和丛芽个数均较可观，不定芽数量在6.44-9.62之间。表4中各种基因型利用本苦瓜再生体系都可以作为农杆菌介导的再生受体系统。
Claims (5)
1.适用于多基因型的苦瓜高效再生体系的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)前处理：将苦瓜种子剥去种皮后进行灭菌，然后放入仅含6-BA的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/天，6-BA的浓度为1-5mg/L；
2)不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入仅含6-BA和KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/天，6-BA的浓度为2-4mg/L，KT的浓度为0.1-1.0mg/L；
3)继代培养：将步骤2)所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于仅含6-BA和KT的MS培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/天,6-BA的浓度为2-4mg/L，KT的浓度为0.1-1.0mg/L；
4)不定芽的伸长：将步骤3)所得物放入仅含6-BA和IBA的MS培养基进行培养，培养时间为14天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/天，6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L；
5)生根培养：将步骤4)所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶中培养，培养时间为14天，培养温度为保持在23-27℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/天，所述生根培养基为1/2MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH＝5.8；
6)炼苗：选取经步骤5)培养后的根长为4-5cm的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2天，再半开2天，然后再全开2d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分；
7)移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养2d，1-2周后再移到室外进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的灭菌过程为：剥去苦瓜种子的种皮，先用75％的酒精浸泡消毒1min，再用0.1％升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，在切取带一个子叶的子叶节时，节点距上胚轴1mm，距下胚轴5mm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7)所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的MS培养基中6-BA的浓度为4mg/L；步骤2)中的MS培养基中6-BA的浓度为3.0mg/L，KT的浓度为0.5mg/L；步骤4)中的MS培养基中，6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L。
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| "苦瓜子叶节丛生芽的诱导";林义章等;《热带作物学报》;20060630;第27卷(第2期);第60-63页 * |
| "苦瓜快繁技术研究";郭辉等;《广西热带农业》;20101231(第2期);第13-16页 * |
| "苦瓜离体再生体系建立的研究";武鹏等;《北方园艺》;20121231(第2期);第124-126页 * |
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