CN104419737B

CN104419737B - 低分子果胶的酶解制备方法

Info

Publication number: CN104419737B
Application number: CN201310380333.7A
Authority: CN
Inventors: 傅国明; 杨卫民; 李英华
Original assignee: ZHEJIANG GUOYUAN KANGPIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG GUOYUAN KANGPIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN104419737A

Abstract

本发明公开了一种低分子果胶的酶解制备方法。通过果胶酶、纤维素酶、半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的一种或几种对高分子高酯果胶进行酶解和脱酯，产物经过碱液中和、过滤干燥、研磨后得到目标分子量和酯化度的果胶产物。本发明采用多酶复合水解技术对高分子高酯果胶进行水解，从天然果胶中提取得到不同分子量和酯化度、高半乳糖醛酸含量、口感优质的果胶。通过该制备方法得到的低分子果胶粉符合美国USP30标准，避免了现有技术中各种偶然性成分的存在，提高了低分子果胶提取的纯度和成功率；同时该方法工艺流程短、产业化能力强，适合大范围的推广。

Description

低分子果胶的酶解制备方法

技术领域

本发明涉及高分子化合物水解领域，尤其涉及一种低分子果胶的酶解制备方法。

背景技术

天然果胶是植物中的一种酸性多糖物质，为稍带酸味的白色至淡黄色粉末，具有水溶性，分子量约5万～30万。现今市场上通常将高分子果胶用于食品加工行业，如胶凝剂、增稠剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂等。另外，天然果胶还可用于化妆品，对保护皮肤、防止紫外线辐射、冶疗创口、美容养颜都有一定作用。由于天然果胶是多聚糖长链碳水化合物，水溶性差，口感不好，且高分子果胶在生物学活性方面的应用受到限制，因此用于食品工业中居多。

近年来，随着诸多科研工作者发现低分子改性果胶在抑制肿瘤、降低放化疗毒副作用、降血糖血脂、提高免疫力、改善胃肠道功能、解除重金属、解酒醒酒和美容养颜等功能方面有良好的生物学活性后，市场对于低分子改性果胶的需求量逐渐增加。而天然提取的低甲氧基果胶来源单一，量比较少，因此关于低甲氧基果胶特别是低分子改性果胶的制备方法报道越来越多，目前已经得到报道的方法有碱液催化脱酯法、酸化乙醇脱酯法、酰胺化法和酶催化法等。

碱液催化脱酯法是将高甲氧基果胶在强碱性条件下使果胶中的甲酯脱去，使果胶的分子量大大下降，在适当的条件下经处理得到性能良好的低甲氧基果胶，此工艺方法较简便，但对pH值和温度的要求严格，操作规范可以将β-消去反应降到最低。被应用于柑橘类果胶、豌豆壳果胶、西番莲果胶等制备低甲氧基果胶。碱法制备的低甲氧基果胶酯化度低、分子量小，半乳糖醛酸含量低于酸化乙醇法，目前已经在丹麦、美国、英国、法国、以色列、日本中国等国家应用。碱法脱酯对于不同原料来源、地域等原料的生产最佳工艺条件有明显的差别，因此不同果胶生产厂家采取的碱法工艺条件也有所不同，生产的低甲氧基果胶质量也不尽相同。

酸化乙醇脱酯法是将预处理后的高甲氧基果胶加入酸化乙醇中处理得到低氧基果胶，此方法和碱液催化法一样需要的脱酯条件要求严格，稍有不当就会出现β-消去反应，工艺也较复杂。该法生产的果胶酯化度在25％-50％，半乳糖醛酸含量高，但脱酯速度慢。酰胺化法制取低甲氧基果胶是将高甲氧基果胶在碱性条件下用氨处理使部分甲酯转化为伯醇胺，从而降低了甲酯含量，这种方法制备的低甲氧基果胶称为酰胺化果胶，酰胺化果胶的甲酯化程度最低，易溶解易凝胶，但制备过程中会产生多种有害物质，影响了产品的运用范围和性能。尽管有学者对制备方案进行了一系列的改进，使酰胺化果胶生产时的有害副产物降到最低，但目的产品的成本也随之大幅上升。

酶法制备低甲氧基果胶是近几年新兴的一种制备技术，由于其产品安全性高，生产环境环保，反应条件温和，工艺条件易于控制，产品性能好等优点得到众多科研工作者和公司的青睐。关于酶法生产低分子改性果胶用于解酒抗醉酒产物的生产工艺有报道，如具有解酒和抗醉酒功能的果胶酶解产物的制备方法及应用，该酶解工艺局限性大，所生产产物为低酯高分子为主，且产物的活性局限于解酒抗醉酒功能。对于分子量小于2万，酯化度低于20％的生产工艺尚未涉及。

发明内容

本发明的目的是克服现有酶解技术酶解程度、脱酯化程度低，产品应用范围受限的问题，提供了控制分子量、酯化度、高半乳糖醛酸含量、低成本、纯度高、生产周期短、应用范围广的低分子果胶的酶解制备方法。

为解决上述问题，本实发明的技术方案是：

一种低分子果胶的酶解制备方法，其特征是：(1)将一定质量的高分子果胶粉过60目筛，加入质量为高分子果胶粉干重10-40倍的水，加热至25-65℃，配成一定浓度的高分子果胶溶液；(2)调节高分子果胶溶液的pH值至2.5-4，在搅拌条件下加入质量为高分子果胶粉干重0.8％-3％的果胶酯酶，在温度为25-45℃下进行脱酯反应60-300min，经酶灭活后冷却至室温，得到果胶酯化度为2％-50％的脱酯果胶溶液；(3)在脱酯果胶溶液中加入质量为果胶粉干重0.06％-0.3％的果胶酶、纤维素酶、半乳糖醛酸酶中的一种或几种，在25-45℃的温度下搅拌酶解反应30-240min，得到果胶分子量为0.2-2万的低分子果胶溶液；(4)将低分子果胶溶液经碱中和、过滤、干燥、研磨后得到目标酯化度和分子量的果胶粉。

本发明针对目前低分子改性果胶制备工艺上存在的问题，通过增加酶的种类、改变酶解工艺条件来控制更高的果胶水解程度和脱酯化程度来增加果胶的生物学功能应用范围，通过改进的酶解技术生产出的低分子改性果胶具有良好的抗肿瘤、降血脂、排铅以及吸湿保湿性能。该发明生产的果胶具有低分子量、低酯化度、高半乳糖醛酸含量、低成本、工艺流程短等特点。

优选地，所述高分子果胶粉为柑橘皮、柠檬皮、橙皮、桠柑皮、苹果皮、甘薯、南瓜、蚕沙、豆腐柴或柚子皮其中一种或几种的果胶提取物，酯化度高于50％，分子量大于6万道尔顿。该工艺所利用原料比之前解酒专利所需原料的要求低，原料的酯化度和分子量的范围比之前广，大大拓展了该工艺路线的原料选择生产适用性。

优选地，所述的加入水量为质量为高分子果胶粉干重的20-40倍水，在高分散搅拌容器中配制成质量百分含量2.5％-5％的高分子果胶溶液。在该浓度下水解效率和后续纯化过程最为佳，能够更好地节省能源，降低生产成本。

优选地，所述脱酯反应中反应温度为30-40℃，果胶酯酶加入量是果胶粉干重的1.5％-2.0％，机械搅拌的条件下脱酯反应60-240min。通过控制脱酯酶的加入量和脱酯反应时间，保证果胶脱酯更加完全，生产出生物活性更高的低酯果胶。

优选地，所述的酶解反应中反应温度为30-40℃，果胶酶、纤维素酶或半乳糖醛酸加入量是果胶粉干重0.15％-0.2％，机械搅拌的条件下酶解60-240min，得到果胶分子量为0.4-2.0万的低分子果胶溶液。通过控制加入酶的种类、酶加入量和酶水解时间，得到的果胶分子量分布范围更窄、分子量更低。

优选地，所述的低分子果胶溶液经碱中和为在低分子果胶溶液中加入一定量的氢氧化钠溶液使溶液接近或呈中性，所得溶液的pH为6.5-7.0，并过滤去除不溶性固体，得到透明的低分子果胶溶液。加入碱中和的目的是精准控制反应终止时间，并除去部分杂质，使产品的纯度更高。

优选地，所述过滤是在该接近或呈中性的溶液中加入质量百分浓度为85％-95％的酒精，慢速搅拌沉淀后过滤。酒精纯化控制分子量分布范围，通过真空干燥技术回收酒精，减少了环境污染并降低了生产成本，获得的产品水溶性好，分子量分布范围窄，酯化度适中。

本发明提供的低分子果胶的酶解制备方法，采用多酶解技术组合，从天然高分子高酯果胶产物中提取得到的一种分子量低、酯化度低、半乳糖醛酸含量高、纯度高、口感好的低分子改性果胶。该工艺适用范围广，生产的低分子改性果胶纯度高，生产周期短，酯化度和分子量低，通过该制备方法得到的低分子果胶粉符合美国USP30标准，具有良好的排铅、抗肿瘤、降血脂和吸湿保湿性能，可以作为食品、保健品、药品和化妆品的原料应用。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

将高分子果胶粉过60目筛，称取高分子果胶粉100g，加入2000ml水，加热至30℃，调节高分子果胶溶液的pH值到3.5，机械搅拌条件下加入1.5ml的果胶酯酶，在30℃温度下进行脱酯反应60min，85℃酶灭活20min；再加入0.15ml的果胶酶，机械搅拌下30℃温度下水解60min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度90％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤3次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得到粉状改性果胶提取物92g，得率为92％。产物的平均分子量为18800道尔顿，分子量在两万以上的含量占40％，甲氧基含量43％。经药理学实验验证，该产品的降血脂效果优于血康宁胶囊，在饲喂产品第四周后血液中的总胆固醇和甘油三酯明显低于模型组。在吸湿保湿方面有良好的效果，特别是在相对湿度较低的情况下吸湿保湿性能优于骨胶原蛋白。

实施例2

将高分子果胶粉过60目筛，称取果胶粉100g，加入4000ml水，加热至40℃，调节高分子果胶溶液的pH值到3.5，机械搅拌条件下加入2ml的果胶酯酶，40℃温度下进行脱酯反应240min，85℃酶灭活20min，再加入0.2ml的果胶酶，机械搅拌下40℃温度下水解240min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度88％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤3次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得粉状改性果胶提取物78g，得率为78％。产物的平均分子量为7600道尔顿，分子量在两万以上的含量小于5％，甲氧基含量8％。经药理学实验验证，其抑制肿瘤、降低放化疗毒副作用、提高免疫力方面和高分子高酯果胶、高分子低酯果胶以及低分子高酯果胶相比效果更好，表现出良好的抑制肉瘤生长，增强小鼠免疫力的活性。排铅效果具有良好的选择性，在起到有效驱铅的同时对体内的铜、锌、铁等必须元素水平并没有影响，比阳性对照药的副作用小。

实施例3

将过60目筛的高分子果胶，称取果胶粉100g，加入3000ml水，加热至35℃，调节高分子果胶溶液的pH值到4，机械搅拌条件下加入1.75ml的果胶酯酶，35℃温度下进行脱酯反应120min，85℃酶灭活20min，再加入0.175ml的果胶酶，机械搅拌下26℃温度下水解120min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度90％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤3次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得粉状改性果胶提取物86g，得率为86％。产物的分子量为14000道尔顿，分子量在2万以上的小于8％，甲氧基含量18.3％，经药理学实验验证，具有良好的驱铅和抗肿瘤活性。

实施例4

将过60目筛的高分子果胶，称取果胶粉100kg，加入2000L水，加热至30℃，调节高分子果胶溶液的pH值到3.5，机械搅拌条件下加入1500ml的果胶酯酶，30℃温度下进行脱酯反应60min，85℃酶灭活20min，再加入15ml的果胶酶，机械搅拌下30℃温度下水解60min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度95％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤2次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得粉状改性果胶提取物93kg，得率为93％。产物的分子量为19200道尔顿，分子量在两万以上的含量占41％，甲氧基含量43％。经药理学实验验证，该产品的降血脂效果优于血康宁胶囊，在饲喂产品第四周后血液中的总胆固醇和甘油三酯明显低于模型组。在吸湿保湿方面有良好的效果，特别是在相对湿度较低的情况下吸湿保湿性能优于骨胶原蛋白。无论是得率还是理化特性和生物学功效，放大过程所得产品和实验室产品完全一致。

实施例5

将过60目筛的高分子果胶，称取果胶粉100kg，加入4000L水，加热至40℃，调节高分子果胶溶液的pH值到3.5，机械搅拌条件下加入2000ml的果胶酯酶，40℃温度下进行脱酯反应240min，85℃酶灭活20min，再加入20ml的果胶酶，机械搅拌下40℃温度下水解240min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度90％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤2次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得粉状改性果胶提取物79.5kg，得率为79.5％。产物的分子量为7800道尔顿，分子量在两万以上的含量小于6％，甲氧基含量8.2％。经药理学实验验证，其抑制肿瘤、降低放化疗毒副作用、提高免疫力方面和高分子高酯果胶、高分子低酯果胶以及低分子高酯果胶相比效果更好，表现出良好的抑制肉瘤生长，增强小鼠免疫力的活性。排铅效果具有良好的选择性，在起到有效驱铅的同时对体内的铜、锌、铁等必须元素水平并没有影响，比阳性对照药的副作用小。无论是得率还是理化特性和生物学功效，放大过程所得产品和实验室产品完全一致。

实施例6

将过60目筛的高分子果胶，称取果胶粉100kg，加入3000L水，加热至35℃，调节高分子果胶溶液的pH值到4，机械搅拌条件下加入1750ml的果胶酯酶，35℃温度下进行脱酯反应120min，85℃酶灭活20min，再加入17.5ml的果胶酶，机械搅拌下35℃温度下水解120min；冷却至室温，加氢氧化钠溶液调pH至6.5，过滤去不溶性固体得透明果胶溶液；再加入质量百分浓度90％酒精进行沉淀并过滤；滤渣用95％的酒精进行反复洗涤2次后离心脱水，粉碎，真空干燥并回收酒精；干燥后果胶研磨，得粉状改性果胶提取物87.5kg，得率为87.5％。产物的分子量为14500道尔顿，分子量在2万以上的小于10％，甲氧基含量18.5％，经药理学实验验证，具有良好的驱铅和抗肿瘤活性。无论是得率还是理化特性和生物学功效，放大过程所得产品和实验室产品完全一致。

本发明中要求得到的低分子果胶符合美国USP30标准，USP30的主要内容是：半乳糖醛酸(％)：>74％；色泽呈现米白色至淡黄色；粒度为80--100目；水份含量<10％；酸不溶性灰份<1％；二氧化硫<50mg／kg；砷(PPm)<0.5；铅(ppm)<1；细菌符合食品卫生标准。

本发明测定分子量的具体分析条件为：TSKgelG2000SWXL色谱柱，分子量分级范围100～25000，流动相：50mmol／L的醋酸铵缓冲液，示差折光检测器，流速0.5ml／min，进样量10ul，柱温30℃。

本发明的排铅效果评价采用醋酸铅致SD大鼠的高铅模型，实验结束后尾静脉取血测定血中铅、铁、铜、钙和锌离子浓度、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶活力和血红蛋白的浓度和模型对照组、阳性药对照组(EDTA组)进行对比。

本发明的降脂效果评价采用高脂饲料致SD大鼠的高血脂模型，实验过程中采2、4、6、8周的血测定总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白四个指标来反应降脂效果，阳性药对照组采用血脂康胶囊。

本发明的抗肿瘤效果评价采用S-180肉瘤致ICR小鼠实体瘤模型，实验结束后处死小鼠测定肉瘤重来评价肿瘤抑制效果情况。

吸湿保湿效果评价采用饱和CH₃COOK溶液控制的相对湿度为20％、饱和Mg(NO₃)₂溶液控制相对湿度为50％、饱和NaNO₂溶液控制相对湿度为65％的三个湿度环境下的吸湿保湿情况。对照组采用德国产骨胶原蛋白。

Claims

1.一种低分子果胶的酶解制备方法，其特征是：

(1)将一定质量的高分子果胶粉过60目筛，加入质量为高分子果胶粉干重10-40倍的水，加热至25-65℃，配成一定浓度的高分子果胶溶液；

(2)调节高分子果胶溶液的pH值至2.5-4，在搅拌条件下加入质量为高分子果胶粉干重1.5％-2.0％的果胶酯酶，在温度为30-40℃和机械搅拌条件下进行脱酯反应60-240min，经酶灭活后冷却至室温，得到果胶酯化度为2％-50％的脱酯果胶溶液；

(3)在脱酯果胶溶液中加入质量为果胶粉干重0.15％-0.2％的果胶酶、纤维素酶、半乳糖醛酸酶中的一种或几种，在30-40℃的温度下搅拌酶解反应60-240min，得到果胶分子量为0.4-1.88万的低分子果胶溶液；

(4)将低分子果胶溶液经碱中和、过滤、干燥、研磨后得到目标酯化度和分子量的果胶粉。

2.根据权利要求1所述的低分子果胶的酶解制备方法，其特征是：所述高分子果胶粉为柑橘皮、柠檬皮、橙皮、桠柑皮、苹果皮、甘薯、南瓜、蚕沙、豆腐柴或柚子皮其中一种或几种的果胶提取物，酯化度高于50％，分子量大于6万道尔顿。

3.根据权利要求1所述的低分子果胶的酶解制备方法，其特征是：所述的加入水量为质量为高分子果胶粉干重的20-40倍水，在高分散搅拌容器中配制成质量百分含量2.5％-5％的高分子果胶溶液。

4.根据权利要求1所述的低分子果胶的酶解制备方法，其特征是：所述的低分子果胶溶液经碱中和为在低分子果胶溶液中加入一定量的氢氧化钠溶液使溶液接近或呈中性，所得溶液的pH为6.5-7.0，并过滤去除不溶性固体，得到透明的低分子果胶溶液；所述过滤是在该接近或呈中性的溶液中加入质量百分浓度为85％-95％的酒精，慢速搅拌沉淀后过滤。