CN104414961A - 红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红菇提取物的制备方法，用该方法制备得到的红菇提取物具有美白功效。本发明也公开了红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用，以及含有红菇提取物的化妆品组合物。

Description

红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用，以及含有红菇提取物的化妆品组合物。

背景技术

皮肤生理上的表面状态、血流、水分、色素等各种各样的成分经过错综复杂的结合，决定了人体的肤色，在这一系列因素中最主要的是黑色素。黑色素的形成过程是：首先由氨基酸之一的酪氨酸作为底物在酪氨酸酶的作用下形成多巴，再转化为多巴醌，这一最初的反应被称为黑色素合成的速率控制阶段，其后多巴醌经过一系列的氧化异构及聚合反应最终形成黑色素。黑色素的合成处是黑色素小体，成熟的黑色素小体会沿着黑色素细胞伸出的树状突起的末梢向周围的角质细胞移行，被角质细胞摄取，黑色素从皮肤的基底层被转移到角质层，进而使肤色变黑。皮肤表层的角质细胞遵循一定的更新周期，一般为28天左右，此时黑色素随着皮肤的角质化，被推挤到皮肤表面，并伴随角质层的剥离从皮肤中排出，进而黑色素完成了从产生到代谢的整个过程。

在美白类化妆品的开发中，为增白肤色或改善皮肤色素异常沉着，常添加各种美白活性原料。常用的有：酪氨酸酶抑制剂：①包括单酚与多酚类（氢醌、熊果苷、壬二酸）；②铜离子螯合剂（曲酸及其酯化物）；③阻止酪氨酸酶向前黑素体转移的物质（葡萄糖胺类）；④改变前黑素体超微结构的物质（五癸酸）；⑤促进酪氨酸酶蛋白降解的物质（不饱和脂肪酸）；⑥竞争性酪氨酸酶抑制剂（氨甲环酸等）；⑦其他类（甘草黄酮等）。非酪氨酸酶抑制剂，包括：①抗坏血酸及其衍生物；②角质溶解剂（α-羟酸类、维A酸类、水杨酸等）；③抑制黑素细胞增殖的物质（内皮素受体阻断剂如母菊提取物）；④其他类（过氧化氢、山梨酸钾等）。

近年来随着消费者对自身健康和安全的日益关注，相对于许多生化合成的化妆品功效原料，来源于天然且功效卓著的原料则更受青睐。

红菇（Russula）又名美丽红菇、鳞盖红菇，是一类大型菌根真菌，属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、红菇科，在我国主要分布于辽宁、江苏、江西、福建、广西、四川、云南等地，其中以福建莆田、闽西一带的红菇最为出名。红菇作为野生稀有珍贵的菇品，具有很高的食用价值和药用价值。红菇中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素及人体必需的微量元素，具有极高的营养保健价值。现代药理研究发现红菇具有抗癌、降血糖、降血脂、提高机体免疫力、抑菌、清除自由基及修复甲醛所致的氧化损伤等功效。

本发明首次提出红菇提取物具有美肤功效，适用于具有美白功效的化妆品中。

发明内容

目前红菇大多应用于食品领域。经本发明人研究发现，红菇提取物同时具有卓越的美肤功效，尤其是在肌肤增白方面。红菇提取物具有美白功效背后的机制是：它能够抑制酪氨酸酶的活性，减少B16黑素细胞中黑素的生成从而达到增白肌肤的效果。而且，红菇是一个非常安全的美白剂，在其有效剂量下，并不会对黑色素细胞的正常生长产生任何影响。

因此，本发明的一个目的是提供红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用。

根据本发明，术语“红菇提取物”是指通过任何适当方式从红菇中提取出的含有有效成分的提取物。

根据本发明的另一个目的，本发明提供一种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有红菇提取物和化妆品领域可接受的辅料。

所述化妆品领域可接受的辅料可以选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述化妆品组合物可以为霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾形式，更具体地，所述组合物可以为洗面奶、沐浴露、柔肤水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、眼霜、面膜、气雾或喷雾形式。这些形式可通过本领域技术人员熟知的方法制备。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述红菇提取物占所述化妆品组合物总重量的0.001%-100%，优选0.01%-50%，更优选0.5%-20%。

本发明所述红菇提取物通过以下方法提取得到：取红菇适量，以适宜溶媒浸泡，以适宜的提取方法提取，过滤得到澄清液体，任选经过纯化步骤，制成优选含生药量1-2000mg/ml，更优选20-1000mg/ml的溶液，也可挥干溶媒制成干粉形式。

生药浓度按照如下方法计算：提取前粉碎的干红菇重量为Wg，加入适宜溶剂提取，得到的最终提取液经重量定量为Kml，提取物的生药浓度为：W/K（g/ml）=1000W/K（mg/ml）。

根据本发明的一个优选的实施方式，适宜溶媒主要为水（包括蒸馏水、去离子水等）或有机溶剂（优选醇类和酯类溶剂，醇类溶剂包括乙醇和多元醇等，酯类溶剂包括乙酸乙酯等）；适宜的提取方法选自以下一种或几种：浸提、煎煮、回流和超临界；适宜的纯化方法选自以下一种或几种：醇沉、萃取、膜分离和柱层析。

附图说明

图1显示了红菇对黑素形成的影响。

图2显示了红菇对酪氨酸酶的影响。

图3显示了DOPA染色结果。

具体实施方式

本发明的发明人在经过了广泛而深入的研究之后发现：红菇提取物具有抑制酪氨酸酶活性的作用。而且，本发明还意外地发现，红菇是一个非常安全的美白剂，在其有效剂量下，并不会对黑色素细胞的正常生长产生任何影响。

因此，本发明涉及红菇的美白功效，红菇提取物可作为功效添加剂加入到化妆品组合物中。

文献中均未涉及红菇具有美白的作用，也未提及将其作为功能添加剂加入化妆品中。也就是说，本发明首次提出红菇具有美肤作用，可以作为功能添加剂加入化妆品中，用于实现美白功效。

在一个实施方式中，红菇提取物的使用浓度可以是0.1-10mg/ml。例如，红菇提取物的使用浓度可以是0.1-5mg/ml，例如0.1-2mg/ml，例如0.1-1mg/ml，例如0.1-0.8mg/ml，例如0.2-0.6mg/ml，例如0.5-0.6mg/ml。在一个实施方式中，红菇提取物的使用浓度为0.575mg/ml。

可以将红菇提取物按照0.001-100重量%的比例添加到化妆品组合物中。例如，化妆品组合物中红菇提取物的用量可以是0.01-50重量%，例如0.01-30重量%，例如0.01-20重量%，例如0.01-10重量%，例如0.01-5重量%，例如0.01-3重量%，例如0.01-1重量%。在其他实施方式中，化妆品组合物中红菇提取物的用量可以是0.5-20重量%，例如，0.5-10重量%，0.5-5重量%，0.5-3重量%，0.5-2重量%，0.5-1重量%。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。下面各实施例中使用的红菇购于上海华宇药业。

以下实施例1-4中所述红菇产自福建。

实施例1

取粉碎的红菇适量，倾入提取罐内，加入20倍量（W/V）80℃的热水，充分搅拌混匀，密闭、保温浸提2.5小时，间断性进行搅拌，过滤，弃去滤渣，滤液即为所得，生药浓度为57.5mg/ml。

实施例2

取粉碎的红菇适量，倾入提取罐内，加入20倍量（W/V）80℃的热水，充分搅拌混匀，密闭、保温浸提2.5小时，间断性进行搅拌，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并滤液，滤液加热浓缩至适量，放置冷却。边搅拌边缓慢加入95%乙醇，使乙醇终浓度为60～75%，静置过夜。过滤，取滤渣在减压条件下回收乙醇至无醇味，残渣加入适量水溶解，使生药浓度为1000mg/ml。

实施例3

取粉碎的红菇适量，倾入提取罐内，加入20倍量（W/V）水，充分搅拌混匀，冷浸1小时后加热至沸腾，保持微沸2.5小时，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并2次滤液，滤液加热浓缩至适量，冷却后离心弃去沉渣。上清液加入去离子水适量混匀，加入到已处理好的D101大孔树脂柱中（购自天津农药厂，预处理方法：用95%乙醇数次浸泡至乙醇溶液呈澄清透明，再用水冲柱至无乙醇味），先用蒸馏水洗脱至近无色，再用4倍量50%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩回收乙醇至无醇味，残液加入适量水溶解（也可加入丙二醇适量助溶），使生药浓度为500mg/ml。

实施例4

取粉碎的红菇适量，倾入提取罐内，加入20倍量（W/V）水，充分搅拌混匀，冷浸1小时后加热至沸腾，保持微沸2.5小时，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并2次滤液，经棉球粗滤后上膜分离装置（厦门福美科技有限公司，型号：RNF-0460），调节适当的压力和流量，分离出分子量在2000～200000之间的有效部位群，生药浓度为20.8mg/ml。

以下实施例5-15中所使用的红菇提取物均为实施例1得到的红菇提取物，其生药浓度为57.5mg/ml；实施例5-15中各组分的单位均为重量百分比。

实施例5：面霜的制备

实施例6：乳液的制备

实施例7：啫喱的制备

实施例8：化妆水的制备

实施例9：精华液的制备

实施例10：面膜的制备

实施例11：眼霜的制备

实施例12：气雾（清洁泡）的制备

实施例13：喷雾的制备

实施例14：沐浴露的制备

实施例15：洗面奶的制备

以上5-15实施例中所述的红菇组合物均经过①稳定性测试，将料体分别在-20℃、4℃、室温、48℃、循环（连续变换四个温度条件）放置12周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用；③使用感觉测试，请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例9所述的精华液8周评估结果表明，使用含红菇提取物的精华液后，明显发现肌肤变得白皙、通透度提升，感觉肌肤水嫩饱满度提高，显得更为年轻。

以下实施例16-17中所使用的红菇提取物样品溶液为实施例1制备得到的红菇提取物；以下实施例中涉及的“mg/ml”浓度单位，均是由核算干品红菇的物料比获得，即：粉碎干红菇的重量为Wg，提取得到的总提取液为Kml，物料比核算为：W/K（g/ml）=1000W/K（mg/ml）。

实施例16：体外生化酪氨酸酶活性抑制实验

一、实验原理

在皮肤黑色素生物合成过程中，酪氨酸酶是关键限速酶，它作用于多巴，生成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。由于酪氨酸酶在黑色素合成过程中起关键作用，因此一大类美白剂都是通过抑制酪氨酸酶活性来减少黑色素生成而达到美白皮肤的效果。通过体外生化酪氨酸酶活性抑制实验可以快速筛选出具有抑制酪氨酸酶的活性物。其实验原理是酪氨酸酶在pH6.8的磷酸缓冲液中，可催化多巴生成多巴醌（呈肾上腺素红色），多巴醌在475nm处具有吸收峰，通过分光光度计可以间接反映多巴醌的生成量。具有抑制酪氨酸酶活性作用的物质可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估待测物质对酪氨酸酶的抑制作用。

二、实验方法

在样品管和样品对照管中各加入1.0ml对应浓度的红菇提取物样品溶液（PBS配制，pH6.8），阴性对照管和空白对照管则分别加入1.0ml PBS。在样品管和阴性对照管中各加入0.5ml（100U/ml）酪氨酸酶溶液（购自Sigma公司,批号：079K7000），样品对照与空白对照管以0.5ml PBS代替。振摇混匀，30℃水槽孵育10分钟。在各管中加入2.0ml的5×10^-4g/ml的多巴L-DOPA（购自Sigma公司，批号：095K1270），继续孵育5分钟，即刻测定在475nm处的吸光值（Abs）。

计算对酪氨酸酶活性的抑制率：抑制率

式中：T-样品管Abs；T₀-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C₀-空白对照管Abs。

三、实验结果

实验浓度（mg/ml）	9.2	2.3	0.575
				抑制率（%）	35.78	13.41	7.03

结论：红菇提取物具有抑制酪氨酸酶活性的作用，且这种抑制作用与红菇的浓度呈依赖关系。

实施例17：角质细胞&黑素细胞共培养体系黑素及酪氨酸酶活性评估

一、实验原理

为了进一步验证红菇提取物的美白功效，我们又利用角质细胞&黑素细胞共培养体系对其美白功效进行评估。在该培养体系中，角质细胞和黑色素细胞模拟正常皮肤中两种细胞的比例共同培养。如果待测物能够减少总黑色素的生成，可认为其具有皮肤美白（淡斑）的功效。该共培养体系的优势在于，它不仅可以通过测定黑色素生成的量直接判定待测物质的美白功效，而且还可以初步研究待测物质的美白机理。该评估方法由三个独立的实验组成。首先是黑色素生成总量检测，这是将黑色素颗粒溶解于高温碱性溶液，利用其在405nm处有较大光吸收，来间接反映黑色素颗粒生成量。其次是细胞酪氨酸酶实验，相比较体外生化酪氨酸酶活性抑制实验该测试方法更能反映出真实结果。另外结合生化酪氨酸酶活性抑制实验，该方法还可以初步判定待测物质是否具有调节酪氨酸酶合成的作用。最后一个实验是DOPA染色，通过DOPA染色可以观察到共培养体系中的黑色素细胞的形态、数量，通过衡量黑色素细胞染色深度也可以反映出待测物质的美白功效。

二、实验方法

1、细胞培养及药物处理

将制备好的Hacat细胞及B16细胞悬液以22：1的比例接种于6孔板内（设置空白孔，空白孔中仅加入相应浓度的Hacat细胞）。24小时后，阴性对照组每孔加入2ml新鲜的培养液，样品组每孔加入2ml相应浓度的红菇提取物样品溶液（培养液配制），0.2mg/ml的曲酸作为阳性对照，每组设3个复孔，置CO₂培养箱(37℃，5%CO₂)中孵育。48小时后进行第二次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。再次孵育48小时后进行第三次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。第三次加样24小时后，消化收集各组细胞，离心，弃去上清液。

2、黑素检测

收集到的细胞中加入200ul的黑色素提取液（1mol/L NaOH+10%DMSO），吹打均匀，95℃水浴1小时。待冷却，适度离心下管壁液滴，吹打均匀，吸取各离心管中的150ul溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔Abs405值。

计算对黑色素生成的抑制率：抑制率

式中：T-样品孔Abs；T₀-空白孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C₀-空白孔Abs。

3、细胞酪氨酸酶活性检测

收集到的细胞中加入400μl1%Triton溶液，震荡仪震摇充分，4℃反应1小时。4000rpm离心5分钟。在1.5ml eppendorf管中各加入100μl3mg/ml多巴溶液，吸出每个离心管中200μl上清液，37℃孵育2小时。吸取各离心管中的150ul溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔Abs405值。

计算对黑色素生成的抑制率：抑制率

式中：T-样品孔Abs；T₀-空白孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C₀-空白孔Abs。

4、DOPA染色

吸去细胞培养液，用PBS洗两遍。加入10%甲醛固定液，常温固定15分钟。PBS洗净后，加入1mg/ml的多巴溶液，37℃孵育1小时，观察细胞内酪氨酸酶与多巴的反应。染色结束后，吸去多巴溶液，加入PBS，在显微镜下观察黑素细胞的多巴染色结果。

5、结果判定

根据405nm处测得的吸光值来判定样品是否具有美白效果。

在黑素检测实验中，样品组OD值小于阴性对照组，且相对于阴性对照组有显著性差异则表明样品有抑制黑素生成的效果。

在细胞酪氨酸酶活性检测实验中，样品组OD值小于阴性对照组，且相对于阴性对照组有显著性差异则表明样品有抑制酪氨酸酶的效果。

在DOPA染色实验中，在没有观测到黑色素细胞的明显减少，形态发生变化的同时，如果样品组黑色素细胞染色结果比对照组浅，说明样品具有美白功效。

三、实验结果

1、红菇对黑素形成的影响

实验浓度（mg/ml）	0.575
		抑制率（%）	42.4%

如图1所示，0.575mg/ml浓度下红菇对黑素形成具有抑制作用。

实验结果显示，红菇可以抑制黑色素的产生，而且相比对照，其结果具有显著差异。

2、红菇对酪氨酸酶的影响

实验浓度（mg/ml）	0.575
		抑制率（%）	20.7%

如图2所示，0.575mg/ml浓度下红菇对酪氨酸酶具有抑制作用。

实验结果显示，红菇可以抑制细胞内酪氨酸酶的效果，而且其抑制效果好于同浓度下生化酪氨酸酶活性抑制实验结果。这提示，红菇除了可以抑制直接抑制酪氨酸酶活，而且可能还参与抑制酪氨酸酶的合成。

3、DOPA染色结果

如图3所示，DOPA染色后黑色素细胞呈黄褐色。与阴性对照相比，经过红菇处理(浓度0.575mg/ml)后，黑色素细胞克隆没有减少，显微镜下也没有观测到形态的改变，但是黑色素克隆的颜色明显变淡。这个结果揭示红菇是一个非常安全的美白剂，它并不是通过影响黑色素细胞生长来达到美白效果。

结论：红菇提取物具有显著美白的功效，其美白的作用主要是通过抑制酪氨酸酶活性来得以实现。而且红菇是一个非常安全的美白剂，在其有效剂量下，并不会对黑色素细胞的正常生长产生任何影响。

Claims (10)

1.一种红菇的提取方法，所述方法选自：浸提、煎煮、回流和超临界。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取方法中采用的溶媒选自：水、醇类、酯类。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括纯化步骤，所述纯化步骤选自：醇沉、萃取、膜分离和柱层析。

4.按照权利要求1-3中任一项所述方法制备得到的红菇提取物。

5.红菇提取物在具有美白功效的化妆品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述红菇提取物是按照权利要求1-3中任一项所述方法制备的提取物。

7.一种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有红菇提取物和化妆品领域可接受的辅料。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述辅料选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。

9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述化妆品组合物是选自以下的形式：霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾剂。

10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述红菇提取物占所述化妆品组合物总重量的更优选0.001%-100%。