CN104666146B - 金钗石斛复方提取物在具有美白功效化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金钗石斛复方提取物的制备方法，用该方法制备得到的金钗石斛复方提取物具有美白功效。本发明也公开了金钗石斛复方提取物在具有美白功效的化妆品中的应用，以及含有金钗石斛复方提取物的化妆品组合物。

Description

金钗石斛复方提取物在具有美白功效化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域。具体涉及一种具有美白作用的中草药组合物（金钗石斛复方提取物），该组合物由天门冬、生地黄、石斛和山药按比例组成。本发明所述金钗石斛复方提取物具有美白功效，可作为功效添加剂加入化妆品中使用。

背景技术

皮肤生理上的表面状态、血流、水分、色素等各种因素经过错综复杂的结合，决定了人体的肤色，在这一系列因素中最主要的是黑色素。黑色素代谢的整个过程是：首先酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴，再转化为多巴醌，其后多巴醌经过一系列的氧化异构及聚合反应最终形成黑色素。装载着黑色素的黑色素小体沿着黑色素细胞伸出的树状突起的末梢向周围的角质细胞移行，被角质细胞摄取。皮肤表层的角质细胞遵循一定的更新周期，一般为28天左右，此时黑色素随着皮肤的角质化，被推挤到皮肤表面，并伴随角质层的剥离从皮肤中排出，进而黑色素完成了从产生到代谢的整个过程。在这个过程中如果出现任何异常，就可能导致黑色素异常沉着，皮肤出现暗沉，色斑。

自古以来亚洲女性尤其是东方女性就有“一白遮三丑”的美容概念，时至今日，拥有美白素肌已经是东方女性的美肌目标。美白相关的护肤品产品销售与日俱增，已经成为护肤化妆品的主流品种之一。近年来随着消费者对自身健康和安全的日益关注，相对于工业合成的化妆品功效原料，来源于天然且功效卓著的原料更受青睐，特别是从天然植物或中草药中提取有效成分作为化妆品原料更易为消费者所接受。中国古代的日常美容用药，较之皮肤疾患治疗的处方更加倾向于整体肤质的改善所带来的美容功效，因而不仅较为安全，而且能够通过调节皮肤内外的阴阳气血平衡，恢复健康有序的自身良好状态而达成综合的美容护养功效。正如古代常见的美容护肤面脂、面膏等对功效的记载：“令面光悦”、“令光润”、“令人好颜色”、“令人面白净悦泽”等等，都间接体现了美白、保湿、滋润、抗衰老等作用。因此这也为我们拓展美容用药的思路提供了一定的指导。

《黄帝内经灵枢邪客第七十一》指出：“营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血，以荣四末，内注五脏六腑。”由此可知，人体津液、阴血起着营养脏腑肌肉组织的作用，与皮肤的营养来源也密不可分。中医理论也认为，肝肾阴虚、肺脾失于濡润、运化功能失职，会导致精微营养物质化生不足，津液亏损及输布产生障碍，使肌肤缺乏润养，久而久之，造成皮肤干涩粗糙无光、代谢减缓等一系列皮肤美容问题。因此，从这一内在机理出发，探索传统滋养肝肾阴虚、濡养肺脾的药物组方所带来的一系列美容功效，特别是美白功效，成为我们组方的理论逻辑背景。

金钗石斛复方由天门冬、生地黄、石斛、山药组成，四者皆属“润药”的范畴，性偏凉润，甘寒养阴，生津润燥之力较强。同时各药又具有一定的特征性功用：天门冬味甘苦性偏寒，归肺、肾经，功能养阴润燥、清火生津。生地黄味甘苦性寒，归心肝肾经，为清热凉血要药，亦能能养阴生津润燥。石斛味甘性微寒，归胃、肾经，善养阴清热，益胃生津，为补益阴液的佳品。山药味甘性平，归脾肺肾经，益气养阴，为平补气阴之良药，《本草纲目》载其具有“润皮毛”之功。生地与天门冬相合，甘寒益阴，生津凉血，滋养肺肾二经，共为君药；石斛增强补益阴液之功，为臣药；山药以平和之性，平补益气，促进营养精微的升发与输布，为佐使药。全方以滋养内在阴血为根本，行濡养肺脾经气之效，完善皮肤内在的营养津液供给，将有效提升整体肤质、肤色的良好状态。

本发明首次提出由天门冬、生地黄、石斛、山药组成的金钗石斛复方提取物具有美肤功效，适用于具有美白功效的化妆品中。

发明内容

经本发明人研究发现，金钗石斛复方提取物具有卓越的美白肌肤功效。它可以通过抑制酪氨酸酶活性的方式，减少B16黑素细胞中黑素的生成以达到亮白肌肤的效果。

因此，本发明的一个目的是提供金钗石斛复方提取物在具有美白功效的化妆品中的应用。

根据本发明的另一个目的，本发明提供一种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有金钗石斛复方提取物和化妆品领域可接受的辅料。

所述化妆品领域可接受的辅料可以选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述化妆品组合物可以为霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾形式，更具体地，所述组合物可以为洗面奶、沐浴露、柔肤水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、眼霜、面膜、气雾或喷雾形式。这些形式可通过本领域技术人员熟知的方法制备。

本发明还提供金钗石斛复方提取物的优选的制备方法，该方法包括：

将以下重量份：天门冬：20～50，生地黄：20～50，石斛：10～40，山药：10～40的中草药充分混合；以水或溶剂浸泡0.5～1小时并提取，所述的溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸乙酯或其组合。

优选地，还包括：

过滤，并重复提取滤渣，合并滤液；

将滤液浓缩至中草药的2倍量（V/W），倍量是指溶剂体积与药材总重量的比值，其中溶剂体积的单位是ml，药材总重量的单位是g；

再进行醇沉；

醇沉上清液回收溶剂。

醇沉物可配制成需要的剂型，如所述剂型可以是溶液剂、粉剂、软膏剂、膜剂或膏霜。

优选地，在上述制备方法中，采用煎煮、回流提取、浸渍或渗漉的方法对浸泡后的中草药进行提取。

优选地，醇沉采用选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇或其组合的醇。

附图说明

图1显示了金钗石斛复方对黑素形成的影响。

图2显示了金钗石斛复方对酪氨酸酶的影响。

图3显示了DOPA染色结果。

图4显示了本发明的金钗石斛复方以及各个单方对黑素形成的影响。

具体实施方式

本发明的发明人在经过了广泛而深入的研究之后发现：由天门冬、生地黄、石斛、山药组成的金钗石斛复方提取物具有抑制酪氨酸酶活性的作用。因此，本发明涉及金钗石斛复方的美白功效，金钗石斛复方提取物可作为功效添加剂加入到化妆品组合物中。

文献中均未涉及金钗石斛复方具有美白的作用，也未提及将其作为功能添加剂加入化妆品中。也就是说，本发明首次提出金钗石斛复方具有美肤作用，可以作为功能添加剂加入化妆品中，用于实现美白功效。

在一个实施方式中，金钗石斛复方提取物的使用浓度可以是0.1-50mg/ml。例如，金钗石斛复方提取物的使用浓度可以是0.1-20mg/ml，例如0.1-10mg/ml，例如0.1-5mg/ml，例如1-5mg/ml，例如1-3mg/ml。在一个实施方式中，金钗石斛复方提取物的使用浓度为2.5mg/ml。

可以将金钗石斛复方提取物按照0.001-100重量%的比例添加到化妆品组合物中。例如，化妆品组合物中金钗石斛复方提取物的用量可以是0.01-50重量%，例如0.01-30重量%，例如0.01-20重量%，例如0.01-10重量%，例如0.01-5重量%，例如0.01-3重量%，例如0.01-1重量%。在其他实施方式中，化妆品组合物中金钗石斛复方提取物的用量可以是0.5-20重量%，例如，0.5-10重量%，0.5-5重量%，0.5-3重量%，0.5-2重量%，0.5-1重量%。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

实施例1

取纯正中药材天门冬30g、生地黄30g、石斛30g、山药10g总共100g，充分混合，加10倍量(倍量：指溶剂体积与药材总重量的比值，其中溶剂体积的单位是ml，药材总重量的单位是g，下同)75%乙醇(v/v)冷浸48小时，滤过，滤液回收乙醇，所得提取物用水溶解，制成含生药量为500mg/ml的溶液。

实施例2：面霜的制备

实施例3：乳液的制备

实施例4：啫喱的制备

实施例5：化妆水的制备

实施例6：精华液的制备

实施例7：面膜的制备

实施例8：眼霜的制备

实施例9：气雾（清洁泡）的制备

实施例10：喷雾的制备

实施例11：沐浴露的制备

实施例12：洗面奶的制备

以上2-12实施例中所述的金钗石斛复方组合物均经过①稳定性测试，将料体分别在-20℃、4℃、室温、48℃、循环（连续变换四个温度条件）放置12周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用；③使用感觉测试，请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例9所述的精华液8周评估结果表明，使用含金钗石斛复方提取物的精华液后，明显发现肌肤变得白皙、通透度提升，感觉肌肤水嫩饱满度提高，显得更为年轻。

以下实施例13-14中所使用的金钗石斛复方提取物样品溶液为实施例1制备得到的金钗石斛复方提取物；以下试验例中涉及的“mg/ml”浓度单位，为生药浓度。

实施例13：金钗石斛复方美白功效评估

一、实验原理

为了验证金钗石斛复方提取物的美白功效，我们利用角质细胞与黑素细胞共培养体系对其美白功效进行评估。在该培养体系中，角质细胞和黑色素细胞模拟正常皮肤中两种细胞的比例共同培养。如果待测物能够减少黑色素总量的生成，可认为其具有皮肤美白的功效。该共培养体系的优势在于，它不仅可以通过测定黑色素生成的量直接判定待测物质的美白功效，而且还可以初步研究待测物质的美白机理。该评估方法由三个独立的实验组成。首先是黑色素生成总量检测，将黑色素颗粒溶解于高温碱性溶液，利用其在405nm处有较大光吸收，来间接反映黑色素颗粒生成量。其次是细胞酪氨酸酶实验，相比较体外生化酪氨酸酶活性抑制实验该测试方法更能反映出真实结果。最后一个实验是DOPA染色，通过DOPA染色可以观察到共培养体系中的黑色素细胞的形态、数量，通过衡量黑色素细胞染色深度也可以反映出待测物质的美白功效。

二、实验方法

1、细胞培养及药物处理

将制备好的角质细胞（Hacat细胞）及黑素细胞（B16细胞）以22:1的比例接种于6孔细胞板内（设置空白孔，空白孔中仅加入相应浓度的Hacat细胞）。24小时后，阴性对照组每孔加入2ml新鲜的培养液，样品组每孔加入2ml相应浓度的金钗石斛复方提取物样品溶液（培养液配制），0.2mg/ml的曲酸作为阳性对照，每组设3个复孔，置CO₂培养箱(37℃，5%CO₂)中孵育。48小时后进行第二次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。再次孵育48小时后进行第三次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。第三次加样24小时后，消化收集各组细胞，离心，弃去上清液。

2、黑色素含量检测

收集到的细胞中加入200μl的黑色素提取液（1mol/L NaOH+10%DMSO），吹打均匀，95℃水浴1小时。待冷却，适度离心下管壁液滴，吹打均匀，吸取各离心管中的150μl溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔Abs405值。

计算对黑色素生成的抑制率：

式中：T-样品孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C₀-空白孔Abs。

3、细胞酪氨酸酶活性检测

收集到的细胞中加入400μl1%Triton溶液，充分震荡后，4℃反应1小时。4000rpm离心5分钟。在1.5ml eppendorf管中各加入100μl3mg/ml多巴溶液，吸出每个离心管中200μl上清液，37℃孵育2小时。吸取各离心管中的150μl溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔Abs405值。

计算对黑色素生成的抑制率：

式中：T-样品孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C₀-空白孔Abs。

4、DOPA染色

吸去细胞培养液，用PBS洗两遍。加入10%甲醛，室温固定15分钟。PBS洗净后，加入1mg/ml的多巴溶液，37℃孵育1小时，观察细胞内酪氨酸酶与多巴的反应。染色结束后，吸去多巴溶液，加入PBS，在显微镜下观察黑素细胞的多巴染色结果，拍照。

5、结果判定

根据405nm处测得的吸光值来判定样品是否具有美白效果。

在黑素检测实验中，样品组OD值小于阴性对照组，且相对于阴性对照组有显著性差异则表明样品有抑制黑素生成的效果。

在细胞酪氨酸酶活性检测实验中，样品组OD值小于阴性对照组，且相对于阴性对照组有显著性差异则表明样品有抑制酪氨酸酶的效果。

在DOPA染色实验中，在没有观测到黑色素细胞数量减少，形态发生明显变化的同时，如果样品组黑色素细胞染色结果比对照组浅，说明样品具有较高的安全性，样品的美白功效并不是通过杀死黑色素细胞或抑制黑色素细胞生长来达成的。

三、实验结果

1、金钗石斛复方抑制黑色素细胞生成黑色素

实验浓度（mg/ml）	2.5
		抑制率（%）	54.6%

如图1所示，2.5mg/ml浓度下金钗石斛复方可以抑制黑色素的产生。

实验结果显示，金钗石斛复方可以抑制黑色素的产生（与对照相比，其结果具有显著差异，*P<0.05。），具有美白的功效。

2、金钗石斛复方抑制黑色素细胞酪氨酸酶

实验浓度（mg/ml）	2.5
		抑制率（%）	13.8%

如图2所示，2.5mg/ml浓度下金钗石斛复方可以抑制细胞酪氨酸酶。

实验结果显示，金钗石斛复方可以抑制细胞酪氨酸酶（与对照相比，其结果具有显著差异，*P<0.05。）这说明金钗石斛复方的美白功效源自其对细胞酪氨酸酶的抑制作用。

3、DOPA染色结果

如图3所示，DOPA染色后黑色素细胞呈黄褐色。经过金钗石斛复方处理后，黑色素细胞克隆没有减少，显微镜下也没有观测到形态的改变，但是黑色素克隆的颜色明显变淡。这个结果揭示金钗石斛复方是一个比较安全的美白剂，它并不是通过影响黑色素细胞生长来达到美白效果。

实施例14：金钗石斛复方中各单方美白功效评估

金钗石斛复方是由天门冬、生地黄、石斛和山药妥善配伍而成的一组药物。在实施例13中，我们已经证实了该复方具有美白的功效。为了确其美白功效来自于这4味中药复配后产生的协同效果，而不是某个单方的效果。我们接下来对这4味单方的美白功效进行评估。

一、实验方法：

4味中药分别制备，提取工艺参见实施案例1，萃取溶液按用药比例缩小，美白评估方法参见实施例13。为了使实验结果具有可比性，4味中药的检测浓度都取2.5mg/ml的浓度（该浓度下的金钗石斛复方已经在实施例13中被证明具有美白功效）。

二、实验结果

如图4所示，在相同检测浓度下，只有金钗石斛复方具有抑制黑色素细胞生成黑色素的能力。4个单方都不能抑制黑色素细胞生成黑色素。该结果说明，金钗石斛复方的美白功效可能源自4味单方在配伍过程中产生的化学成分的变化，或各单方的化学成分在适宜的浓度范围及相互比例下协同发挥作用的结果。这使得复方中的有效成分无论在质的方面，还是在量的方面都与单味药有所改变，从而具有单方所没有的美白功效。

结论：金钗石斛复方具有显著美白的功效，其美白的作用主要是通过抑制酪氨酸酶活性来得以实现。另外金钗石斛复方是一个非常安全的美白剂，在其有效剂量下，不会对黑色素细胞的正常生长产生任何不利影响。最后，金钗石斛复方的美白功效来自于其单方的协同作用。

Claims (6)

1.一种金钗石斛复方提取物在美白肌肤方面的应用，其中，所述提取物通过以下方法制备得到：

将以下重量份：天门冬：20～50，生地黄：20～50，石斛：10～40，山药：10～40的中草药充分混合；

以水或溶剂浸泡0.5～1小时并提取，

其中，所述溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸乙酯或其组合。

2.一种金钗石斛复方提取物在具有美白功效的化妆品中的应用，其中，所述提取物通过以下方法制备得到：

将以下重量份：天门冬：20～50，生地黄：20～50，石斛：10～40，山药：10～40的中草药充分混合；

以水或溶剂浸泡0.5～1小时并提取，

其中，所述溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸乙酯或其组合。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述提取采用煎煮、回流提取、浸渍或渗漉的方法对浸泡后的中草药进行提取。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述方法还包括：

过滤，并重复提取滤渣，合并滤液；

将滤液浓缩至中草药的2倍量(V/W)，倍量是指溶剂体积与药材总重量的比值，其中溶剂体积的单位是ml，药材总重量的单位是g；

再进行醇沉；

醇沉上清液回收溶剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，醇沉采用选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇或其组合的醇。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括将醇沉物配制成需要的剂型，所述剂型选自：溶液剂、粉剂、软膏剂、膜剂或膏霜。