CN104411336A - 抗托法替尼抗体及其用于药物监测的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供选择性托法替尼抗体，可用作免疫原性分子以产生特异于托法替尼的抗体的免疫原性托法替尼缀合物，以及测量样品中托法替尼浓度的方法，产生所述抗体的方法和使用所述抗体的测定和试剂盒。

Description

抗托法替尼抗体及其用于药物监测的用途
发明领域
本发明涉及特异于托法替尼(tofacitinib)的抗体，其相对于两种已知代谢物选择性结合托法替尼。所述抗托法替尼抗体的选择性使其对于免疫测定特别有用。本发明进一步涉及包括特异于托法替尼的抗体的免疫测定或试剂盒。
发明背景
本发明涉及特异于托法替尼的抗体，其可用于例如监测血药水平的测定方法和测定试剂盒中。
托法替尼是一种开发中的强力免疫抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎(RA)、银屑病、炎性肠病及其它免疫学疾病，以及用于预防器官移植排斥。托法替尼特异性抑制Janus激活的激酶3(JAK3)，所述激酶在调控淋巴细胞存活、增殖、分化和凋亡的细胞因子信号转导中起关键作用。
在某些情况中，当在人体中移植器官如肾、心脏、肺、骨髓和肝脏时，机体有时将排斥移植的组织。器官移植物排斥的一种处理包括用免疫抑制药物如托法替尼以受控制的方式抑制免疫系统。免疫抑制药物要小心地给予移植接受体，以防止排斥外来(即非自身)组织。用免疫抑制药物的成功处理需要测量药物浓度，随后调整剂量使得效力最大化同时毒性最小化。因此，非常需要监测用托法替尼治疗的患者中托法替尼的血液水平以调节所述剂量。合适的剂量将维持足以达到药物学活性同时避免任何过分的副作用危险的最小药物活性水平。因此，作为开发托法替尼作为药物的部分，需要灵敏且可靠的测定以测量患者中托法替尼水平，所述测定在临床环境中可以快速及简便地进行。
为了支持托法替尼在临床环境中的使用，特别是用于防止器官移植排斥，在许多患者中需要长期监测托法替尼的血浆水平以保证维持治疗水平，以及指导根据需要适时调整剂量。这种活动通常称作治疗性药物监测(TDM)。TDM在帮助临床医生维持免疫抑制药物在其各自的治疗范围内的血液和血浆水平中起关键作用。在限定的治疗范围之外的浓度变化可导致不利的临床结果。TDM保证药物的浓度不会太高或太低，从而分别降低毒性或排斥的危险。免疫抑制药物的治疗性监测通常基于一些适于特定药物的测定和生物学液体(即全血、血浆)的选择。
基于可靠的液态层析-质谱分析(LC-MS/MS)的测定可用于监测托法替尼的治疗水平。遗憾的是，在全国和全世界的大多数临床场所均未进行设置以在室内常规地进行LC-MS/MS测定。临床场所通常更喜欢相对快速、廉价及方便地进行测定以使其TDM工作简单化。因此，将免疫测定设定为检测患者血液、血清、血浆和/或其它生物学液体或样品中的托法替尼是有利的。因此，将基于托法替尼的免疫原用于产生抗托法替尼抗体是有利的。
进一步，结合托法替尼，但是基本上不结合至少一种托法替尼的代谢物的特异性抗托法替尼抗体是有利的。除了别的之外，这种抗体可用于检测来自经历治疗的患者的样品中托法替尼的临床相关浓度，其中给所述患者施用托法替尼。
先前尚未报道识别托法替尼的单克隆抗体。在制备托法替尼的单克隆抗体中存在固有的困难，因为托法替尼不是免疫原性的并且是自身免疫抑制性的。此外，由于在文献中还未充分鉴定托法替尼的代谢物，因此难以鉴定能区分托法替尼与其代谢物的单克隆抗体。需要精确的测定以检测有活性的托法替尼而不是其失活的代谢物。本发明满足这个需要。
发明概述
本发明涉及新的免疫原性托法替尼缀合物，以及标记的托法替尼竞争物。本发明还涉及使用所述免疫原性托法替尼缀合物产生的多克隆和单克隆抗体。除了别的之外，这些抗体、缀合物和竞争物可用于检测样品中托法替尼的免疫测定中。
本发明包括免疫原性托法替尼缀合物，其包含与免疫原性载体结合的托法替尼，其中所述免疫原性载体是选自匙孔帽贝血蓝蛋白和牛血清白蛋白的蛋白质，进一步，其中：
(a)所述免疫原性托法替尼缀合物具有如下结构：
其中BSA是牛血清白蛋白；或者
(b)所述免疫原性托法替尼缀合物具有如下结构：
其中KLH是匙孔帽贝血蓝蛋白。
本发明包括一种评估样品中托法替尼浓度的方法。所述方法包括：
(a)提供疑似含有托法替尼的样品；
(b)将所述样品或样品提取物与特异于托法替尼的抗体在适于所述抗体与托法替尼结合的条件下接触以形成测定混合物；及
(c)检测所述抗体与托法替尼的结合。
本发明包括一种分离的抗体，其对于托法替尼的结合亲和性高于所述抗体对于式II的托法替尼代谢物1及式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
一方面，所述分离的抗体对于托法替尼的结合亲和性是所述抗体对于托法替尼代谢物1或代谢物2的结合亲和性的25、30、40或50倍。
另一方面，所述抗体是使用免疫原性托法替尼缀合化合物获得的，所述化合物包含与免疫原性载体结合的托法替尼。
本发明包括一种确定样品中托法替尼的量的方法。所述方法包括：
提供已知量的包含与可检测标记结合的托法替尼的标记的竞争物；
提供选择性抗托法替尼抗体；
组合所述样品、所述选择性抗托法替尼抗体及所述标记的竞争物，其中样品中的托法替尼与所述标记的竞争物竞争结合所述选择性抗托法替尼抗体；及
通过检测所述标记测量未与抗体结合的标记的竞争物的量而确定样品中托法替尼的量。
一方面，所述选择性抗托法替尼抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于式II的托法替尼代谢物1和/或式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
一方面，所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
本发明包括确定样品中托法替尼的量的试剂盒。
所述试剂盒包含：
标记的竞争物，其包含与可检测标记结合的托法替尼；及至少一种选择性抗托法替尼抗体；其中所述标记的竞争物与样品中的托法替尼竞争结合所述抗托法替尼抗体。
一方面，所述选择性抗托法替尼抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于选自式II的托法替尼代谢物1及式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物的结合亲和性
另一方面，所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
另一方面，所述试剂盒可用于检测样品中浓度范围为大约5ng/ml-约1215ng/ml的托法替尼，及包含：
(a)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(b)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1其包含包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
本发明包括一种确定样品中托法替尼浓度的竞争性免疫测定试剂盒。所述竞争性免疫测定包含：至少一种选择性抗托法替尼抗体；与可检测标记缀合的托法替尼化合物；其中所述缀合的托法替尼化合物与样品中托法替尼竞争结合所述抗体；及其中当样品中托法替尼以治疗性药物监测浓度存在时，所述标记提供表示样品中托法替尼浓度的信号。
一方面，所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
本发明包括分离的抗体，其结合托法替尼，但是基本上不结合选自式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物
一方面，所述分离的抗体基本上不结合式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2
另一方面，所述抗体可检测样品中的托法替尼，但是基本上不能检测样品中的托法替尼代谢物，并且其中托法替尼的量的范围为大约5ng/mL-1215ng/mL、大约5ng/mL-405ng/mL或者大约15ng/mL-1215ng/mL。
本发明包括分离的抗体，其对于托法替尼的结合亲和性高于其对于选自式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物的结合亲和性。所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含三个互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，选自：
(a)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(c)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
及其中所述轻链可变结构域包含三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，选自：
(d)LCDR1，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(e)LCDR2，其包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35的氨基酸序列；及
(f)LCDR3，其包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
一方面，所述抗体包含：
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(c)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
(d)HCDR1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(e)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(f)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(g)HCDR1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(h)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及进一步包含轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(j)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(k)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(l)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(m)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(n)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(o)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(p)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(q)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
另一方面，所述抗体选自：
(a)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(b)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(c)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；
(d)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(e)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
一方面，所述抗体能检测样品中浓度范围为大约15ng/ml-1215ng/ml的托法替尼。
另一方面，所述抗体能检测样品中浓度范围为大约5ng/ml-405ng/ml的托法替尼。
再一方面，本发明包括编码抗体的核酸，所述抗体包含：
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(c)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
(d)HCDR1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(e)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(f)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(g)HCDR1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(h)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及进一步包含轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(j)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(k)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(l)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(m)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(n)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(o)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(p)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(q)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
一方面，本发明包括宿主细胞，所述细胞包含所述核酸。
另一方面，本发明包括一种产生抗体的方法。所述方法包括在产生抗体的条件下培养所述宿主细胞。在进一步的方面，所述方法包括分离所述抗体。
附图简述
公开的主题在此说明书完结处的权利要求书中特别指出和明确要求。公开的实施方案的前述及其它目的、特征和优势从如下结合附图的详细描述来看是明显的，其中：
图1示出通过固相ELISA确定的血清抗体与实施例2的托法替尼-BSA缀合物的结合。
图2示出通过ELISA确定的所选择的抗托法替尼抗体与生物素化的托法替尼的结合。
图3示出通过ELISA确定的所选择的抗托法替尼抗体与代谢物1的交叉反应性。
图4示出通过ELISA确定的本发明所选择的单克隆抗体的最佳稀释范围。
图5示出通过ELISA确定的本发明所选择的单克隆抗体的最佳稀释范围。
发明详述
本发明提供包含与免疫原性载体结合的托法替尼的新的免疫原性托法替尼缀合物，以及标记的托法替尼竞争物。本发明还涉及使用所述免疫原性托法替尼缀合物产生的多克隆和单克隆抗体。
本发明还提供特异于托法替尼的多克隆和单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是应答接种新的免疫原性托法替尼缀合物而产生的，所述缀合物包含与免疫原性载体连接的托法替尼。
这些抗体、缀合物和竞争物可用于检测生物学液体中托法替尼的免疫测定中。包含这些抗体、缀合物和竞争物的测定试剂盒很适合于在临床中使用，及提供比先前可能的结果更精确和可再现的结果。所述抗体也可用于托法替尼的纯化和分离中。
术语“抗体”在本文包括完整抗体及其任何抗原片段(即抗原结合部分)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或者其抗原结合部分。“抗体”也是指IgA、IgD、IgE、IgG、IgM抗体亚型。每个重链包含重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区(CH)。所述重链恒定区通常包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区可进一步再分为超变区，称作互补决定区(CDR)，由称作框架区(FR)的较保守的区域间隔。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
可变结构域的“CDR”是可变区内的氨基酸残基，其根据Kabat、Chothia的定义、Kabat和Chothia的积累、AbM、接触(contact)和/或构象定义或者本领域熟知的任何CDR确定方法而鉴定。抗体CDR可以鉴定为最初由Kabat等定义的超变区。见例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR的位置也可以鉴定为最初由Chothia和其他人描述的结构环(structuralloop)结构。见例如Chothia et al.,1989,Nature 342:877-883。CDR鉴定的其它方法包括“IMGT定义”(Lefranc,M.-P.et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212)，及“AbM定义”，其是在Kabat与Chothia之间的折中，使用Oxford Molecular's AbM抗体建模软件(现在的)得到，或者基于观测的抗原接触的CDR的“接触定义”，如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.262:732-745所述。在本文称作CDR“构象定义”的另一种方法中，CDR的位置可以鉴定为对抗原结合做出热焓(enthalpic)贡献的残基。见例如Makabe et al.,2008,J.Biol.Chem.283:1156-1166。其它的CDR边界定义可以不严格遵循上述方法之一，但是与Kabat CDR至少部分重叠，尽管其根据特定的残基或残基组或者甚至整个CDR不明显影响抗原结合的预测或实验发现而可以缩短或延长。如本文所用，CDR可以是指通过本领域已知的任何方法包括方法的组合所定义的CDR。本文使用的方法可利用根据任何这些方法定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定的实施方案，CDR可以根据任何Kabat、Chothia、扩展的、AbM、接触和/或构象定义而限定。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或者“抗原结合片段”(或者简单称作“抗体部分”)是指抗体的一或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如托法替尼)的能力。已经示出抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；及(v)dAb片段(Ward et al.,1989,Nature 341:544-546)，其由一个VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码，但是其可以使用重组方法通过合成的接头连接，使其作为单一蛋白质链而产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如Bird et al.,1988,Science 242:423-426及Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这种单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
如本文所用，“分离的抗体”是指基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合托法替尼的分离的抗体基本上没有特异性结合除了托法替尼之外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化学品。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或者“单克隆抗体组合物”是指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，如(a)自被转化以表达所述抗体的宿主细胞分离的抗体，(b)自重组的组合的抗体文库分离的抗体，及(c)通过任何其它方式包括将免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接而制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包含可变区，其中框架区和CDR区源自小鼠种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可以对这种重组小鼠抗体进行体外诱变(或者，当使用用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然是源自小鼠种系VH和VL序列并与小鼠种系VH和VL序列关联，但是在体内可以不天然存在于小鼠抗体种系库内。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG)。
短语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰的形式，例如抗体与另一药物或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”是指其中源自非人物种种系如小鼠的CDR序列已经被移植在人框架序列上的抗体。另外的框架区修饰可以在人框架序列内进行。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列源自一种物种、恒定区序列源自另一物种的抗体，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。嵌合抗体也可以包括V结构域和C结构域各来自两个不同来源的抗体，即使所述不同来源都来自相同物种。
如本文所用，“特异性结合托法替尼”的抗体或者“选择性托法替尼抗体”是指结合托法替尼但是基本上不结合托法替尼代谢物的抗体。抗体特异性结合托法替尼，其中其不可检测地结合式II的托法替尼代谢物1和/或式III的托法替尼代谢物2，或者以更低程度结合这种代谢物。例如，如通过例如竞争性结合测定所测量的，所述代谢物基本上不与托法替尼竞争结合所述抗体。选择性托法替尼抗体对于托法替尼的结合亲和性是其对于式II的代谢物1或者式III的代谢物2的结合亲和性的5、10、15、25、30、40或50倍。
如本文所用，术语“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长目动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
在如下段落(subsection)中进一步详细描述本发明的各个方面。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或者抗体重链的可变区。正如本领域所已知，重链和轻链的可变区各由四个通过三个也称作超变区的互补决定区(CDR)连接的框架区(FR)组成，有助于抗体的抗原结合位点形成。如果需要对象可变区的变体，特别是具有CDR区域之外(即在框架区内)的氨基酸取代，可以通过对比对象可变区与其它抗体的可变区鉴定合适的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代，所述其它抗体可变区含有与对象可变区相同标准类别的CDR1和CDR2序列(Chothia and Lesk,J MolBiol 196(4):901-917,1987)。当选择FR位于对象CDR侧面时，例如当人源化或最佳化抗体时，优选来自含有相同标准类别的CDR1和CDR2的抗体的FR。
可变结构域的“CDR”是在可变区内的氨基酸残基，其根据Kabat、Chothia的定义、Kabat和Chothia二者的积累、AbM、接触、和/或构象定义或者本领域熟知的任何CDR确定方法鉴定。抗体CDR可以鉴定为最初由Kabat等定义的超变区，见例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR的位置也可以鉴定为最初由Chothia等描述的结构环结构。见例如Chothia et al.,1989,Nature 342:877-883。其他CDR鉴定方法包括“IMGT定义”(Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27,209-212(1999))及“AbM定义”，这是在Kabat与Chothia之间的折中，是使用Oxford Molecular's AbM抗体建模软件(现在的)获得的，或者基于观测的抗原接触的CDR“接触定义”，在MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745中阐述。在本文称作CDR的“构象定义”的另一方法中，CDR的位置可以鉴定为对抗原结合做出热焓贡献的残基。见例如Makabe et al.,2008,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166所述。其它的CDR边界定义可不严格遵循上述方法之一，但是与Kabat CDR的至少部分有重叠，尽管其根据预测或实验性发现特定的残基或残基组或者甚至完整的CDR不明显影响抗原结合而可以缩短或延长。如本文所用，CDR可以是指通过本领域已知的任何方法包括方法的组合定义的CDR。本发明使用的方法可利用根据任何这些方法定义的CDR。对于含有一个以上CDR的任何给定的实施方案，所述CDR可以根据任何Kabat、Chothia、扩展的、AbM、接触和/或构象定义而定义。
术语“单克隆抗体(Mab)”是指源自单一拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，不是通过产生所述抗体的方法。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同源或基本同源的群体中。
本发明的抗体可以使用本领域熟知的技术产生，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或者这些技术的组合，或者本领域已知的其它技术(见例如Jayasena,S.D.,1999,Clin.Chem.45:1628-1650和Fellouse et al.,2007,J.MoI.Biol.,373(4):924-940)。
如本文使用，术语“特异性结合(specific binding)”、“选择性结合(selective binding)”、“选择性结合(selectively binds)”或“特异性结合(specifically binds)”是指以高于与非靶化合物的结合亲和性结合靶化合物或表位的能力。在说明性的实例中，特异性结合托法替尼的抗体对于托法替尼的结合亲和性高于其对于托法替尼代谢物如式II的代谢物1和式III的代谢物2的结合亲和性。在一些实施方案中，“特异性结合”或者“选择性结合”是指对于与靶化合物的结合亲和性是对于非靶化合物的结合亲和性的至少5、10、15、20、25、30、50、100、500、1000或更多倍。
术语“表位”是指分子的在一或多个抗体的抗原结合区能由抗体识别和结合的那部分。表位通常由化学活性的表面分子组(surface grouping ofmolecules)如氨基酸或糖侧链组成，并具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。如本文所用，术语“抗原性表位”定义为多肽的部分，如通过本领域熟知的任何方法(例如通过常规的免疫测定)所确定的，所述部分可以与抗体特异性结合。“非线性表位”或者“构象表位”包含在特异于所述表位的抗体所结合的抗原性蛋白质内的不连续多肽(或者氨基酸)。
如本文所用，术语“免疫原”和“免疫原性”是指在生物体内能产生或形成免疫应答的物质。免疫原也可以是抗原。通常地，免疫原具有相当高的分子量(例如大于10,000)，因此，各种大分子如蛋白质、脂蛋白、多糖、一些核酸和某些磷壁酸可以是免疫原。
“半抗原”是部分或不完全的抗原。其通常是无蛋白质的物质，大多数是低分子量的，其通常不能刺激抗体形成，但是与抗体反应。半抗原的抗体可以通过将半抗原与高分子量抗原性载体(例如免疫原)结合然后将该结合的产物即免疫原性缀合物注射进人或动物对象中而产生。例如，托法替尼是半抗原。
如本文使用，术语“载体”或者“免疫原性载体”是指一种免疫原性物质，通常是蛋白质，其可以与半抗原连接，从而使得所述半抗原能够诱导免疫应答并引起与所述抗原(半抗原)特异性结合的抗体产生。载体物质包括蛋白质、糖蛋白、复合多糖、颗粒及核酸，其被识别为外来物，从而引起来自宿主的免疫应答。各种蛋白质均可以用作多肽免疫原性载体。这些蛋白质包括白蛋白和血清蛋白质，例如球蛋白、眼晶状体蛋白(ocular lensproteins)、脂蛋白等。举例的蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白、牛γ-球蛋白(BGG)等。或者，可以使用合成的多肽。所述免疫原性载体也可以是多糖，例如淀粉、糖原、纤维素、碳水化合物、树胶如阿拉伯树胶、琼脂等。所述多糖也可以含有多肽残基和/或脂质残基。所述免疫原性载体也可以是单独的或者与上述多肽或多糖之一缀合的多核苷酸。
如本文所用，术语“免疫原性”是指分子诱导免疫应答的能力，这可以通过所注射的分子的固有化学结构及宿主动物的免疫系统是否识别所述化合物而确定。抗原结构中的微小改变可极大地改变化合物的免疫原性，已经广泛用作增加抗体、特别是针对十分保守的抗原的抗体的产生机会的常用方法。例如，这些修饰技术可改变免疫原的区域以提供更好的T细胞结合位点或者暴露新的表位以供B细胞结合。
如本文使用，术语“标记”是指产生或者可以被诱导以产生可检测信号的任何分子。所述标记可以与待分析物、免疫原和/或抗体缀合。标记的非限制性实例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂、发光剂、增敏剂、非磁性或磁性颗粒、固体支持物、脂质体、配体、受体和半抗原放射性同位素。
关于特异性抗体或标记的竞争物，术语“标记的”包括通过将可检测物质与抗体或标记的竞争物结合(例如物理连接)的直接标记，以及通过将所述抗体或标记的竞争物与标记的另一试剂结合的间接标记，而所述另一试剂在此则是直接标记的。间接标记的实例包括使用荧光素标记的二抗检测一抗。检测本发明抗原的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。
本文描述的抗体、标记的竞争物及潜在的治疗性化合物也适合与许多任何其它同源和异源免疫测定和一系列检测系统一起使用。
如本文所用，术语“抗原性化合物”是指用于产生免疫应答的化合物。例如，所述抗原性化合物是与免疫原性载体连接的半抗原，例如托法替尼。所述抗原性化合物用于产生希望的抗体。
如本文使用，术语“标记的竞争物”是能特异性结合对托法替尼具有特异性的抗体的分子，其中所述分子与可检测标记或追踪剂连接。例如，所述分子是托法替尼或者其衍生物或分析物。
术语“生物学样品”包括但不限于任何数量的分离自或源自活的对象或者先前是活的对象的物质。该术语包括分离自对象的组织、细胞和生物学液体，以及在对象内存在的组织、细胞和生物学液体。对象包括但不限于鸡、人、小鼠、猴、大鼠、兔、马、骆驼及其它动物。这种物质包括但不限于血液、血浆、血清、精液、尿液、眼泪、唾液、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑液组织或液体、软骨细胞、滑液巨噬细胞、内皮细胞和皮肤。
一方面，本发明提供托法替尼的衍生物，其可用作免疫原性分子以产生用于测量托法替尼水平的特异于托法替尼的抗体。
另一方面，本发明提供选择性检测样品中托法替尼的方法和试剂盒。
托法替尼(式I)是开发中的可口服的、JAK3的强选择性抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎(RA)及其它自身免疫失调，如炎性肠病、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎，及防止移植排斥。
托法替尼具有至少两种已知的代谢物，“代谢物I(式II)和代谢物II(式III)”。
难于进行免疫测定以检测小分子如托法替尼。在一些情况中，小分子缺少抗原性，使得难以产生针对其的抗体。这个挑战对于托法替尼是复杂的(compounded)，因为其具有这种强力的免疫抑制性质。为了增加小分子的免疫原性，可以将较大的免疫原性化合物(包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、匙孔帽贝血蓝蛋白等)与药物结合。样品中所述药物的检测通常需要使用与抗体、托法替尼或托法替尼类似物缀合的可检测标记。
在本发明之前，预料不到通过与免疫原性载体缀合可以使托法替尼更具免疫原性。因此，令人惊奇地，一方面，本发明提供免疫原性托法替尼缀合物，其包含与免疫原性载体结合的托法替尼，其中所述免疫原性载体是蛋白质、糖蛋白、复合多糖或者核酸，其由被免疫的动物识别为外来的，导致免疫应答。在一个说明性的实例中，所述免疫原性载体是选自匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供式V的免疫原性托法替尼缀合物，其具有如下结构：
其中BSA是牛血清白蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供式VI的免疫原性托法替尼缀合物，其具有如下结构：
其中KLH是匙孔帽贝血蓝蛋白。
本发明的免疫原性托法替尼缀合物可用于使用已知的抗体产生和筛选方法激发抗体。可以将所述免疫原性缀合物注射进合适的动物宿主中以刺激抗体的产生。可以收获如此产生的抗体，直接用于设置来检测托法替尼的免疫测定中。在一些情况中，需要有特异于托法替尼的单克隆抗体，相比于托法替尼代谢物，所述抗体选择性结合托法替尼。在一些实施方案中，所述抗体对于托法替尼的结合亲和性是所述抗体对于代谢物1或代谢物2的结合亲和性的大约25、30、40或50倍。在一些实施方案中，所述抗体结合代谢物1或代谢物2的亲和性与结合托法替尼的亲和性相比低大约5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。
选择性抗托法替尼抗体
本发明的抗体特征在于其特异性结合托法替尼(式I)，但是基本上不结合已知的托法替尼代谢物(即“式II的代谢物1和式III的代谢物2”)的一或两者，以及产生及使用这些抗托法替尼抗体的方法。选择性托法替尼抗体结合托法替尼的亲和性是与式II的代谢物1或者式III的代谢物2的结合亲和性的5、10、15、25、30、40或50倍。
评估所述抗体与托法替尼及其代谢物的结合亲和性的标准测定为本领域已知，包括例如ELISA、Western印迹、放射性免疫测定和流式细胞分析。合适的测定在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和性)可以通过本领域已知的标准测定评估，如通过Biacore SPR分析和Octet分析。
本发明的抗体包括小鼠单克隆抗体5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VH氨基酸序列在表2中示出，分别以SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10和12表示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VL氨基酸序列在表2中示出，分别以SEQ ID NO:2、4、6、4、9、11和4表示。
所述VH和VL序列可以“混合和匹配”以产生本发明的其它选择性托法替尼结合分子。托法替尼与这种混合和匹配的抗体的结合以及所述抗体与代谢物1和2的一或两者的结合可以使用上述及实施例中描述的结合测定检测。任选地，当混合与匹配VH和VL链时，将来自特定VH/VL配对的VH序列用结构相似的VH序列置换。同样任选地，将来自特定VH/VL配对的VL序列用结构相似的VL序列置换。
因此，一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或者其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及进一步包含轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(b)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(c)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(d)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(e)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(f)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(g)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(h)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(i)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(j)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供包含5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6或者其组合的重链和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VH CDR1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、19、19、30、19、19和37所示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VH CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14、20、25、31、20、20和38所示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15、21、26、32、21、21和39所示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VL CDR1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16、22、27、22、33、34和22所示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VL CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17、23、28、23、17、35和23所示。5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18、24、29、24、18、36和24所示。所述CDR区使用Kabat系统描述(Kabat,E.A.,et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(1991))。
抗体5A3.E5的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18。抗体10A6.C5的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24。抗体10F10.H5的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:19、25、26、27、28和29。抗体6D9.A5的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:30、31、32、22、23和24。抗体12H4.G2的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:19、20、21、33、17和18。抗体16F10.E6的重链和轻链CDR包含SEQ ID NO:19、20、21、34、35和36。抗体12D4.G6的重链和轻链CDR包含SEQ IDNO:37、38、39、22、23和24。
在再一个实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区和/或重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，包含与先前描述的抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中所述抗体保留本发明的选择性抗托法替尼抗体的希望的功能性质。
在各种实施方案中，所述抗体可以是，例如，小鼠抗体、人源化抗体或者衍生自小鼠抗托法替尼抗体的嵌合抗体。在其它实施方案中，所述VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。如本文所用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等价于两个序列之间的百分比相同性。两个序列之间的百分比相同性是所述序列共有的相同位置数的函数，考虑缺口数和每个缺口的长度，需要引入所述缺口数和每个缺口的长度以进行两个序列最佳比对。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区和/或重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中一或多个这些序列包含基于本文所述抗体的指定氨基酸序列或者其保守性修饰，及其中所述抗体保留本发明抗托法替尼抗体的希望的功能性质。
在另外的实施方案中，所述抗体可以是，例如，小鼠抗体、人源化抗体或者嵌合抗体。
如本文所用，术语“保守性序列修饰”是指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守性修饰包括氨基酸取代、添加和删除。可以通过本领域已知的标准技术在本发明的抗体中导入修饰，如定点诱变和PCR介导的诱变等技术。保守性氨基酸取代是其中用具有相似侧链的氨基酸残基置换氨基酸残基的取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区内的一或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换，可以使用本发明所述功能测定测试改变的抗体的保留功能。
在另一实施方案中，本发明提供结合托法替尼上与本发明抗托法替尼抗体相同表位的抗体(即具有与本发明抗体竞争结合托法替尼的能力的抗体)。在另外的实施方案中，进行竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6。这种竞争抗体可以基于其在标准结合测定中与5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6或12D4.G6竞争结合托法替尼的能力而鉴定。例如，Biacore分析、Octect分析、ELISA测定或者流式细胞计量术可用于证明与本发明抗体的交叉竞争。测试抗体抑制例如5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6或12D4.G6与托法替尼结合的能力表明所述测试抗体可与5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6竞争结合托法替尼，并因此可以结合托法替尼上与5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6、和12D4.G6结合的相同的表位，其中所述测试抗体基本上不结合代谢物1和/或代谢物2。在进一步的实施方案中，与5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6结合托法替尼上的相同表位的抗体是小鼠单克隆抗体。这种单克隆抗体可以如实施例所述或者通过本领域各种熟知的方法制备和分离。在其它实施方案中，与所述抗体竞争的抗体是人、人源化或小鼠抗体。
本发明的抗体可以使用包含至少一个本发明公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料工程化修饰的抗体而制备，所述修饰的抗体可具有与起始抗体不同的性质，但是其可与起始抗体结合相同或者基本相同的表位。抗体可以通过修饰一或两个可变区(即VH和/或VL)内的一或多个残基而被工程化，例如在一或多个CDR区内和/或一或多个框架区内。另外或二者选一，抗体可以通过修饰恒定区内的残基而被工程化，例如改变抗体的效应子功能。
本发明提供编码本发明的托法替尼特异性抗体的核酸。编码本发明的抗体的核酸可以通过本领域已知的方法产生。正如本领域技术人员所理解的，由于核酸编码的简并性，许多核酸序列也可以编码本发明抗体的氨基酸序列。
一种可以进行的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各个抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。由于CDR序列与大多数抗体-抗原相互作用相关，因此可以通过构建表达载体表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包含移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列(见例如Riechmann et al.,1998,Nature 332:323-327；Jones et al.,1986,Nature321:522-525；Queen et al.,1989,Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；美国专利No.5,225,539、5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体或者其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其分别包含选自SEQ ID NO:13、19、30和37，SEQ ID NO:14、20、25、31和38及SEQ ID NO:15、21、26、32和39的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其分别包含选自SEQ IDNO:16、22、27、33和34，SEQ ID NO:17、23、28和35及SEQ ID NO:18、24、29和36的氨基酸序列。这种抗体含有单克隆抗体5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6的VH和VL CDR序列，其可以含有与所述抗体不同的框架序列。这种框架序列可以得自公开的DNA数据库或者公开的参考文献，其包含种系抗体基因序列。
另一种可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改良感兴趣抗体的一或多种结合性质(例如亲和性)。可以进行定点诱变或者PCR介导的诱变以导入突变，对于感兴趣的抗体结合或者其它功能性质的影响可以在如本文所述及实施例中提供的体外或体内测定中评估。任选地，导入保守性修饰(如上文论述)。所述突变可以是氨基酸取代、添加或删除。此外，通常改变不超过1、2、3、4或5个CDR区内的残基。
在再一个实施方案中，本发明提供包含重链可变区的分离的抗-磷酸化τ蛋白(anti-phospho-tau)单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区包含：
(a)VH CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:13、19、30和37的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:13、19、30和37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自SEQID NO:14、20、25、31和38的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:14、20、25、31和38相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:15、21、26、32和39的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:15、21、26、32和39相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:16、22、27、33和34的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:16、22、27、33和34相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:17、23、28和35的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:17、23、28和35相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列；及(f)VL CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:18、24、29和36的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:18、24、29和36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、删除或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括其中对VH和/或VL内框架残基进行修饰，例如，以改良抗体的性质的那些抗体。典型地，进行这种框架修饰以降低所述抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列(也称作“种系化”)。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与种系序列不同的框架残基，所述抗体源自所述种系序列。这种残基可以通过比较所述抗体框架序列与抗体自其中衍生的种系序列而鉴定，所述抗体源自所述种系序列。
另一种框架修饰包括突变框架区内或者甚至一或多个CDR区内的一或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低所述抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫化”，在美国专利公开No.2003/0153043中进一步详细描述。除了在框架区或CDR区内进行修饰之外或者可选地，还可以对本发明的抗体进行工程化以在Fc区内包括修饰，通常所述工程化改变所述抗体的一或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以化学修饰(例如可以将一或多个化学部分附着于所述抗体)或者被修饰以改变其糖基化。
本发明考虑的本文所述抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如，以增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常将所述抗体或其片段与聚合物反应，所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物，所述反应在使得一或多个PEG基团与所述抗体或抗体片段附着的条件下进行。或者，所述聚乙二醇化是通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化或烷化反应而进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意在涵盖已经用于衍生其它蛋白质的PEG的任何形式，其，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要聚乙二醇化的抗体是去糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域已知，可用于本发明的抗体。
工程化抗体的方法
如上文所述，具有本文揭示的VH和VL序列的选择性抗托法替尼抗体可用于通过修饰VH和/或VL序列或者与其附着的恒定区而产生新的抗托法替尼抗体。因此，如上文所述，在本发明的另一方面中，本发明的抗托法替尼抗体的结构特征用于产生结构相关的抗托法替尼抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能性质，如与托法替尼结合但是与代谢物1和/或代谢物2基本不结合。例如，5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5、12H4.G2、16F10.E6和/或12D4.G6或其突变的一或多个CDR区可以与已知的框架区和/或前体CDR重组组合，以产生另外的重组工程化的抗托法替尼抗体。其它类型的修饰包括在前面章节中所述那些修饰。用于所述工程化方法的起始材料是本发明提供的一或多个VH和/或VL序列，或者其一或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不必实际上制备(例如表达为蛋白质)具有本发明提供的一或多个VH和/或VL序列或者其一或多个CDR区的抗体。而是，使用所述序列中包含的信息作为起始材料产生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制备所述“第二代”序列并表达为蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。
任选地，由改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述抗托法替尼抗体的一种、一些或所有功能性质的抗体，所述功能性质包括但不限于：
(i)基本上不结合式II的托法替尼代谢物1；和/或
(ii)基本上不结合式III的托法替尼代谢物2。
改变的抗体的功能性质可以使用在本领域可获得的和/或本文所述的标准测定以及本领域已知的或者未来发现的那些测定进行评估。
在工程化本发明抗体的方法的某些实施方案中，可以沿着全部或部分抗托法替尼抗体编码序列随机或选择性导入突变，可以对所得修饰的抗托法替尼抗体根据如本文所述的结合活性和/或其它功能性质进行筛选。突变方法为本领域熟知。
本发明单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过各种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法。也可以制备本发明的小鼠、大鼠、兔、骆驼和人单克隆抗体，所述制备使用噬菌体展示方法筛选来自这些或许多其它物种的免疫球蛋白基因的文库。这种用于分离抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经确立，涵盖从免疫的动物或人制备的噬菌体展示文库或者其中原始起始材料不是衍生自免疫动物的未免疫噬菌体展示文库。噬菌体展示为本领域熟知，且在例如美国专利No.5,223,409、WO 91/17271、WO92/20791和WO 92/15679中描述。
本发明的单克隆抗体也可以通过在合适条件下培养包含编码单克隆抗体的核酸的宿主细胞及回收所述抗体或其抗原结合片段而制备。这种宿主细胞培养方法为本领域熟知。
使用方法
本发明进一步提供评估样品中托法替尼的存在或浓度的方法，所述方法包括提供疑似含有托法替尼的样品；将所述样品或样品提取物与特异于托法替尼的抗体在适于所述抗体与托法替尼结合的条件下接触以形成测定混合物；及检测所述抗体与托法替尼的结合。
在另一实施方案中，本发明提供确定样品中托法替尼浓度的方法。所述方法包括提供包含与可检测标记结合的托法替尼的标记的竞争物；提供结合托法替尼但是不结合代谢物1和/或2的选择性抗托法替尼抗体；将所述样品、选择性抗托法替尼抗体及标记的竞争物组合，其中样品中的托法替尼与标记的竞争物竞争结合选择性抗托法替尼抗体；通过检测所述标记测量与所述抗体未结合的标记的竞争物的量确定样品中托法替尼的浓度。在举例的实施方案中，检测不含有托法替尼的样品中标记的竞争物(托法替尼)的量，并将样品中所检测到的标记的量与在可能存在托法替尼的样品中存在的标记的量相比较。测量在不存在托法替尼条件下检测的标记的量与疑似含有托法替尼的样品中标记的量之间的差异。
在另一实施方案中，本发明提供用于确定样品中是否存在托法替尼的竞争性免疫测定试剂盒。举例的竞争性免疫测定试剂盒如酶联免疫测定(ELISA)包含能特异性结合托法替尼的抗体，及与可检测的标记缀合的托法替尼化合物，其中缀合的托法替尼化合物被设定为与样品中的托法替尼竞争结合所述抗体，及其中当样品中的托法替尼以治疗性药物监测浓度存在时所述标记提供表示样品中托法替尼浓度的信号。
在一个实施方案中，本发明提供用于确定样品中托法替尼以托法替尼的治疗性范围内的药物浓度存在的竞争性免疫测定。然而，应理解提供跨越更广泛范围的信息是有用的，并且所述免疫测定范围通常宽于治疗性范围。因此，监测治疗性药物浓度的免疫测定可提供跨越更宽范围托法替尼浓度的敏感性。一方面，所述竞争性免疫测定适于监测样品中以大约0-大约1500ng/ml范围浓度存在的托法替尼。另一方面，所述竞争性免疫测定适于监测样品中以大约5-大约1215ng/ml范围浓度存在的托法替尼。另一方面，所述竞争性免疫测定适于监测样品中以大约5-大约500ng/ml范围浓度存在的托法替尼。另一方面，所述竞争性免疫测定适于监测样品中以大约5-大约405ng/ml范围浓度存在的托法替尼。另一方面，所述竞争性免疫测定适于监测样品中以大约15-大约1215ng/ml范围浓度存在的托法替尼。
在一个竞争性免疫测定中，标记的竞争物可以衍生自托法替尼，使用与免疫原性托法替尼缀合物相同或相似的连接。在一些竞争性免疫测定中，考虑到使所述标记的竞争物在存在托法替尼的条件下更易于被置换，可取的是，使用以比托法替尼与所述抗托法替尼抗体低的特异性与抗托法替尼抗体的结合的标记的竞争物。
本文描述的抗体、免疫原性托法替尼缀合物、标记的竞争物和/或其它缀合物也适于与许多任何其它同源和异源免疫测定和一系列检测系统一起使用。本发明的实施例不是限制性的。
因此，本发明提供了托法替尼缀合物，其可用于制备免疫原和缀合物以用于检测托法替尼的免疫测定中。根据本发明，通过将托法替尼类似物与免疫原性载体物质结合，可以产生和分离多克隆或单克隆抗体，其是检测托法替尼的免疫测定的有用试剂。结合可以通过结合标记或载体的任何化学反应实现。
举例的托法替尼免疫测定采用抗托法替尼抗体，其可以是多克隆或单克隆的。在举例的竞争性免疫测定中，所使用的抗体制备物是通过本文所述免疫原诱导的，是在水溶液如缓冲液等中配制的，或者在佐剂或相似组合物中提供。可以测试诱导的抗体以确定对于托法替尼特异性。
本文所述的抗体和标记的竞争物也适于与许多任何其它同源和异源免疫测定和一系列检测系统一起使用。
试剂盒
本发明提供确定样品中托法替尼浓度的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种选择性抗托法替尼抗体。一方面，所述试剂盒进一步包含标记的竞争物，所述竞争物包含与可检测标记结合的托法替尼。在另一实施方案中，所述标记的竞争物与样品中的托法替尼竞争结合抗托法替尼抗体。另一方面，选择性抗托法替尼抗体是使用免疫原性托法替尼缀合物产生的，所述缀合物包含与免疫原性载体结合的托法替尼。所述试剂盒也可以包含使用所述试剂盒的施药器(applicator)和/或指导材料。
在另一实施方案中，本发明包括确定样品中托法替尼浓度的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种选择性托法替尼抗体，其结合托法替尼但是基本上不结合选自式II的托法替尼代谢物1和式III的代谢物2的至少一种代谢物。一方面，所述试剂盒包含至少一种选择性托法替尼抗体，其结合托法替尼但是基本上不结合式II的托法替尼代谢物1及基本上不结合式III的托法替尼代谢物2。一方面，所述试剂盒进一步包含施药器。另一方面，所述试剂盒包含使用该试剂盒的指导材料。
一方面，所述试剂盒可检测5ng/ml-1215ng/ml范围的托法替尼浓度。另一方面，所述试剂盒可检测5ng/ml-405ng/ml范围的托法替尼浓度。再一方面，所述试剂盒可检测15ng/ml-1215ng/ml范围的托法替尼浓度。
本发明通过如下实施例进一步例证，所述实施例不应被理解是进一步限制的。所有图和本申请全文所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请均明确并入本文作参考
实施例
实施例1：托法替尼与琥珀酸的缀合
将40mg琥珀酸酐和0.2ml TEA(50mM三乙醇胺，50mM KCl，20mMMgCl2，pH 7.5)加入到47mg的托法替尼溶于0.8ml乙腈中的溶液。将此反应混合物在60℃温度摇动1小时。在一小时，将另外的50mg琥珀酸酐加入反应混合物，随后在60℃摇动温育。在HPLC纯化之后获得纯化材料，提供25.2mg式IV的托法替尼半琥珀酰中间物，所述HPLC纯化以0-30％乙腈(ACNN)的流动相梯度进行。
实施例2：合成包含与BSA结合的托法替尼的免疫原性托法替尼缀合 物
将1.5mg式IV所示化合物溶解于2ml 1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)缀合缓冲液(0.1M MES，0.9M NaCl，0.02％NaN3，pH 4.7)中。将8mg BSA(Imject BSA，得自Pierce#77601)溶解于0.8ml水中，然后与式IV溶液混合。接着，将10mg EDC溶解于0.1ml H2O中，然后立即加入BSA、式IV混合物中。将此混合物在室温轻轻摇动2小时。将混合物离心(spun down)，通过脱盐纯化含有托法替尼-BSA缀合物(式V)的上清，所述脱盐根据本领域技术人员已知的标准脱盐方法进行。通过基质辅助激光解吸附电离(MALDI)证实托法替尼与BSA的缀合。
实施例3：合成包含与BSA结合的托法替尼的免疫原性托法替尼缀合 物
将1.5mg式IV的化合物溶解于1.5ml EDC缀合缓冲液中。将10mgEDC溶解于0.2ml水中，并立即加入式IV溶液中。将式IV/EDC混合物加入0.6ml海洋生物(Mariculture)匙孔帽贝血蓝蛋白(mcKLH，得自Pierce#77601)溶液(10mg/ml水溶液)。将该反应混合物在室温轻轻摇动2小时。将混合物离心并通过脱盐纯化含有托法替尼-KLH缀合物(式VI)的上清，所述脱盐根据本领域技术人员已知的标准脱盐方法。
实施例4：合成标记的托法替尼竞争物
标记的托法替尼竞争物的一个实例是式VII的生物素化的托法替尼衍生物。式VII的生物素化的托法替尼衍生物如下所述产生。
将18mg式IV的化合物和20mg EDC溶解于1ml EDC缀合缓冲液中。加入0.1ml乙腈以帮助溶解所述化合物。通过加入10μl 5M NaOH将溶液的pH调节为5.5。然后，加入23mg胺-PEG3-生物素。将该混合物在室温摇动过夜。在温育过夜后，通过HPLC纯化生物素化的托法替尼(式VII)，提供14mg纯化的化合物，所述HPLC以0-30％CAN流动相梯度进行。
实施例5：产生抗托法替尼抗体
多克隆和单克隆抗体通过使用常规技术产生，尤其是如Kohler andMilstein,Nature 256:495-497(1975)所述进行。将三只雌性Balb/C小鼠用在完全弗氏佐剂中的实施例3的100μg免疫原性托法替尼-KLH缀合物进行免疫，通过腹膜内注射(ip)施用。在初次注射后10、20和30天，通过腹膜内注射施用三剂随后的注射剂，所述注射剂包含50μg/小鼠的不完全弗氏佐剂中的免疫原性托法替尼-KLH缀合物。在第37天收集血清，并如下文所述，通过针对实施例2的免疫原性托法替尼-BSA缀合物的固相ELISA确定与所述抗原反应的抗体的存在。
固相ELISA：将实施例2的免疫原性托法替尼-BSA缀合物固定在微滴定平板的孔中。特别地，将微滴定平板用在包被缓冲液(0.2M碳酸盐缓冲液(BuPH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲对(buffer pack)，Pierce item#28382)中的2-10μg/ml托法替尼-BSA缀合物在室温包被1-2小时或者在4℃包被过夜，然后用封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA的PBS)在室温饱和1小时或者在4℃饱和过夜，然后用洗涤缓冲液(含有0.5％(v/v)Tween 20的PBS)洗涤3次。将待筛选的抗体样品(即小鼠血清或者杂交瘤上清)在稀释剂(在PBS中0.1％BSA溶液)中稀释。将稀释的抗体样品加入微滴定平板中，并将平板在室温温育1-2小时。在用洗涤缓冲液洗去任何未结合的物质之后，确定结合的抗托法替尼抗体的水平，使用兔或山羊抗小鼠过氧化物酶缀合的二抗(IgG特异性的)在推荐或经实验获得的在稀释剂中的稀释度(通常为1/1000-1/10,000)进行。在室温温育30分钟及用洗涤缓冲液洗涤3次之后，加入生色底物OPD(o-苯二胺)，然后生色20分钟，通过加入50μl 2 N硫酸终止。测量在490nm的吸光度。图1示出通过固相ELISA确定的血清抗体与实施例2的托法替尼-BSA缀合物的结合。如图1所示，与抗原反应的抗体存在于小鼠1、2和3中。由于小鼠3具有最高的效价(根据在50％最大信号的血清稀释度定义)，选择这个小鼠进行杂交瘤产生。
杂交瘤产生：展示最高血清抗体效价(根据在50％最大信号的血清稀释度定义)的小鼠，小鼠3，接受包含25μg抗原的加强注射。三天后，牺牲小鼠，分离其脾细胞并根据标准融合方案与NS1骨髓瘤细胞融合。在融合后10天通过针对免疫原性托法替尼-BSA的固相ELISA(上述)筛选这些称作亲代克隆的克隆混合物，以鉴定分泌能结合托法替尼的抗体的亲代克隆。选择阳性亲代克隆进行进一步分析。
将源自所述融合体的这些阳性亲代克隆从96孔平板扩张至24孔平板，3天后再次筛选以保证所述克隆仍产生抗体。从再次筛选，将所选择的具有阳性杂交瘤(即分泌能结合免疫原性托法替尼-BSA缀合物但是不结合代谢物-1-BSA、代谢物-2-BSA的抗体的杂交瘤)的孔冷冻用与将来的使用及亚克隆以分离阳性细胞系。
通过限制稀释对所选择的分泌能结合免疫原性托法替尼–BSA缀合物的抗体的阳性亲代克隆进行亚克隆，以获得单克隆杂交瘤细胞系。在亚克隆后大约10天，从孔中除去小体积的培养基，通过固相ELISA筛选以鉴定产生抗体的克隆。扩增所选择的阳性克隆并再次筛选，以保证所述克隆仍产生抗体及证实特异性。将每个亲代系的最多两个阳性克隆，包括6D9.A5和12D4.G6，进行扩张，每个克隆冷冻2个小瓶。还收集1ml上清进行检测。
除了实施例5所述直接固相ELISA之外，开发另一种免疫测定形式，包括竞争性免疫测定形式以检测实验样品中的托法替尼。举例的竞争性免疫测定方案在下文提供。
鉴于托法替尼是一种有力的免疫抑制剂，因此托法替尼的抗体的产生是令人惊奇的。甚至更惊奇的是，这些抗体的精确(exquisite)选择性，如下文示出，其可以区分托法替尼与其两个代谢物，选择性结合托法替尼但是基本上不结合任一或者两个代谢物。
竞争性抗托法替尼免疫测定-1
将实施例5所述直接固相ELISA转变为竞争性ELISA，其中指定量的单克隆抗体代替免疫血清样品或杂交瘤上清，然后将竞争物(即托法替尼，托法替尼代谢物)加入单克隆抗体溶液中，测量在存在和不存在所述竞争物的条件下所述单克隆抗体与托法替尼–BSA缀合物的结合。
竞争性抗托法替尼免疫测定-2
将微滴定平板用100μl/孔的包被缓冲液中的1μg/ml纯化的抗托法替尼抗体在室温包被3小时，然后更换为300μl/孔封闭缓冲液(含有1％脱脂奶粉的PBS)在室温封闭30分钟，并用洗涤缓冲液(含有0.5％Tween 20的PBS)洗涤3次。加入100μl/孔生物素化的托法替尼(0.03μg/ml)与未标记的竞争物如托法替尼(1.0-0.001μg/ml)、代谢物1或代谢物2及链霉亲和素-HRP(1:16,000稀释，可随着批次(lot)变化)的混合物，在室温温育2小时。在3次洗涤后，加入100μl OPD底物，然后生色20分钟，通过加入50μl 2N硫酸终止反应。测量在450nm的吸光度。
竞争性抗托法替尼免疫测定-3
将200μl/孔的含有抗托法替尼MAb(1/100至1/1638400稀释度)、生物素化的托法替尼(1ng/ml)及非标记的竞争物如托法替尼(1000-0.001ng/ml)、代谢物1(400–0.097ng/ml)或者代谢物2的混合物加入山羊抗小鼠IgG预包被的平板中，在室温温育1-2小时。在洗涤该平板之后，加入200μl链霉亲和素-HRP(50ng/ml)，然后将平板在室温温育0.5-1小时。在再次洗涤平板之后，加入200μl的TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物，然后生色30分钟，通过加入50μl 2 N硫酸终止反应。测量在450nm的吸光度。
实施例6：抗托法替尼单克隆抗体与生物素化的托法替尼的结合
通过标准ELISA进一步测试所选择的抗体与托法替尼的结合。简而言之，共筛选34个克隆用于与生物素化的托法替尼结合。ELISA的形式如下。将生物素化的托法替尼(1ng/mL)与1:100至1:1,638,400稀释范围的抗体稀释液在预包被的山羊抗小鼠IgG平板上温育1小时。在洗去任何未结合的物质之后，根据已知方法在加入链霉亲和素-HRP和相关的生色底物TMB之后测量生物素化的托法替尼与抗体的结合。
图2示出通过ELISA确定的选择的抗托法替尼抗体与生物素化的托法替尼的结合。发现11个抗体以浓度依赖性方式结合生物素化的托法替尼。这些抗体中的10个抗体的数据在图2中示出，抗体8B5.F2的数据未示出。
选择这11个克隆进行进一步分析。特别地，评估这11个克隆与托法替尼代谢物1的交叉反应性。
实施例7:抗托法替尼单克隆抗体与代谢物1的结合
通过测量交叉反应性进一步鉴定抗体与托法替尼或托法替尼代谢物的结合，使用上述竞争性免疫测定-3进行，其中托法替尼代谢物作为竞争物。
对于这个实施例，使用竞争性免疫测定筛选11个抗托法替尼单克隆抗体用于与代谢物1的交叉反应性。将200μl/孔的含有抗托法替尼MAb(1/100至1/1638400稀释度)、生物素化的托法替尼(1ng/ml)及代谢物1(400-0.097ng/ml)加入山羊抗小鼠IgG预包被的平板中，在室温温育1-2小时。在洗涤平板之后，加入200μl链霉亲和素-HRP(50ng/ml)，然后在室温温育0.5-1小时。再次洗涤平板之后，加入200μl的TMB底物，然后生色30分钟，通过加入50μl 2 N硫酸终止反应。测量在450nm的吸光度。
图3示出使用竞争性免疫测定确定的所选择的抗托法替尼抗体与代谢物1的交叉反应性。如图3所证明，4个抗体证明以剂量依赖性方式与代谢物1的交叉反应性(例如克隆7C10.C11、1B2.B9、11G10.F12和8B5.F2)。7个克隆是选择性的，其结合托法替尼但检测不到与代谢物1结合，例如5A3.E5、10A6.C5、10F10.H5、6D9.A5(或6D9.A8)、12H4.G2、16F10.E6和12D4.G6。这7个克隆的图在与图3中示出的曲线图的顶部近似垂直的线示出。更特别地，用于制备图3中示出的曲线图的数据在如下：
表1
进一步测试未示出与代谢物1具有交叉反应性的7个克隆的亲代药物抑制。
未示出与代谢物1具有交叉反应性的7个单克隆抗体克隆的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列在下表2中提供。
表2
a互补决定区(CDRs)以粗体字和下划线示出，通过IMGT编号系统确定(Lefranc,M.-P.et al.,1999,Nucleic Acids Research 27:209-212)。
b抗体克隆6D9.A8和16F10.E2在建档过程(archival process)中未能存活。为此，对亚克隆自相同亲代系的克隆6D9.A5和16F10.E6进行测序。
实施例8：抗原竞争
对于这个实施例，使用竞争性免疫测定形式确定托法替尼是否抑制所选择的与代谢物1不交叉反应的抗体克隆结合生物素化的托法替尼的能力。所选择的与代谢物1不交叉反应的抗体克隆在从初始抗体滴定中确定的其EC50稀释度测定(见图2)。将200μl/孔的含有抗托法替尼MAb(1/100至1/1638400稀释度)、生物素化的托法替尼(1ng/ml)及未标记的托法替尼(1000-0.001ng/ml)的混合物加入山羊抗小鼠IgG预包被的平板中，在室温温育1-2小时。在洗涤平板之后，加入200μl链霉亲和素-HRP(50ng/ml)，然后在室温温育0.5-1小时。在再次洗涤平板之后，加入200μl of TMB底物，然后生色30分钟，通过加入50μl 2N硫酸终止反应。测量在450nm的吸光度。
如下表3所示，在克隆6D9.A8和12D4.G6看到竞争。特别地，未标记的托法替尼对生物素化的托法替尼的结合抑制在克隆6D9.A8和12D4.G6观测到，ED50分别为202ng/mL和104ng/mL，表3示出这个实验的ED20、ED50和ED80。
表3：抗原竞争测定结果
实施例9：抗托法替尼单克隆抗体与代谢物1和代谢物2的结合
测试两个克隆6D9.A8和12D4.G6与代谢物1和2的交叉反应性。在这个实验中，代谢物制备为浓度为200,000-200ng/ml，抗体克隆在表1示出的其EC50稀释度制备。将代谢物与生物素化的托法替尼(1ng/mL)和抗体在预包被的抗小鼠IgG平板上一起温育1小时。在洗去任何未结合的物质之后，在加入链霉亲和素-HRP和相关生色底物TMB之后根据已知方法测量生物素化的托法替尼与抗体的结合。
下表4概括克隆6D9.A8和12D4.G6与代谢物1和代谢物2的交叉反应性。
表4：克隆与代谢物1和代谢物2的交叉反应性
克隆 抗原ED50 代谢物-1交叉反应性 代谢物-2交叉反应性
6D9.A8 234ng/mL 3.68％ 0.38％
12D4.G6 152ng/mL 4.17％ 0.15％
如表4所示，克隆6D9.A8示出与代谢物1和2分别为3.68％和0.38％的交叉反应性；克隆12D4.G6示出与代谢物1和2分别为4.17％和0.15％的交叉反应性。这些数据证明这些抗体基本上不结合代谢物1和2。
实施例10:托法替尼的标准曲线
对于这个实施例，使用含有已知浓度的标记的托法替尼(例如0.001-1000ng/ml)的溶液确定所选择的抗体对托法替尼的相对亲和性。图4示出通过ELISA确定的本发明的所选择的单克隆抗体例如6D9.A8(空心圆)和12D4.G6(空心方框)的最佳稀释范围。表5概括所述ELISA的测定条件和结果。表6示出用于产生图5中所示曲线图的数据值。
表5
表6
符号 4-P Fit:y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D: A B C D R^2
○ 克隆6D9.A8(6D9.A8_1ng/ml_1:3785:浓度 101 1.32 195 5.55 0.987
□ 克隆12D4.G6(12D4.G6_1ng/ml_1:21796:浓度 97.5 1.39 109 3.85 0.997
曲线拟合选项-固定加权值。亚克隆6D9.A8和12D4.G6表明与亲代药物的相似的剂量应答，6D9.A8稍微更有力。
如图4和表5所示，克隆12D4.G6示出标准范围为5-405ng/ml(图4)，表明这个单克隆抗体能检测水平低如5ng/ml的托法替尼。图4还示出6D9.A8的标准范围为15-1215ng/ml。因此，组合使用这两种抗体提供检测样品中托法替尼的剂量范围是大约5ng/ml-1215ng/ml。
实施例11：在肝素化人血浆中的掺入(spike)和复原(recovery)
对于这个实施例，将托法替尼掺入(spiked)可商购的肝素人血浆中，以确定稀释度对人血浆样品中托法替尼的线性和复原的作用。将托法替尼以浓度为4864ng/ml掺入肝素-血浆(人)中，以2倍系列稀释以测试血浆的测定耐受性。稀释度线性百分比和复原百分比通过实施例5所述ELISA测定计算。
表7：稀释度对人血浆样品中托法替尼的线性和复原的作用
稀释倍数 观测值Ng/ml 标称值Ng/ml ％稀释度线性 ％复原
2 >LODa 2432 --- ---
4 >LOD 1216 --- ---
8 745 604 106 123
16 390 304 111 128
32 183 152 104 120
64 84 76 95 111
128 46 38 105 121
256 22 19 100 116
平均值 103 120
aLOD＝检测水平
如表7所示，在测定缓冲液中至少1:8稀释的得自商业来源的血浆样品具有可接受的稀释度线性和复原。稀释2和4倍的样品返回低于预期的吸光度值，表示这些较低稀释度的样品的基质干扰。这些数据表明本发明的抗体甚至在复杂的生物学样品例如但不限于血浆中可精确地检测托法替尼的存在和浓度。
实施例12：克隆6D9.A5表征
对于这个实施例，使用抗体克隆6D9.A5、6D9.A8或12D4.G6在这个测定中产生(run)托法替尼剂量应答曲线(0.001-1000ng/ml)。结果在表8和图5中示出。进一步地，用于产生图5中所示曲线图的数据在下表9中示出。本发明的数据表明6D9.A5具有与6D9.A8相同的标准范围(15–1215ng/ml)，及能检测样品中浓度低如大约15ng/ml及高如大约1215ng/ml的托法替尼。
表8
表9
曲线拟合选项-固定加权值。
因此，替代亚克隆抗体6D9.A5(代替6D9.A8)表明与亚克隆抗体6D9.A8相似的对亲代药物的剂量应答活性。此外，本发明揭示的数据表明6D9.A5和6D9.A8抗体与抗体12D4.G6相比是相似的更有力的亲代药物结合剂。
通过测量与代谢物的交叉反应性进一步表征6D9.A5抗体，所述测量使用竞争性免疫测定-3，其中托法替尼代谢物用作竞争物，或者使用实施例5所述直接ELISA测定，其中微滴定平板用托法替尼-BSA缀合物包被。在表10中示出的数据表明克隆6D9.A5具有与克隆6D9.A8和克隆12D4.G6观测到的相似的交叉反应性。即与12D4.G6一样，6D9.A5基本上不结合代谢物1或2。
表10
克隆 抗原ED50 代谢物1交叉反应性 代谢物2交叉反应性
6D9.A5 244ng/ml 4.47％ <0.01％
6D9.A8 230ng/mL 3.68％ 0.38％
12D4.G6 118ng/mL 4.17％ 0.15％
尽管已经参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述了本发明，但是应意识到在不偏离本文教导和下文权利要求书的精神，可以对本发明进行各种改变和修饰。提供前述实施例只是为了更好地例证本发明，无限制本发明范围之意。本发明的教导已经利用这些举例的实施方案加以描述，本领域技术人员将易于理解在不进行过度实验可以对这些举例的实施方案进行各种改变和修饰。所有这些改变和修饰均在本发明范围内。
本文引用的所有参考文献包括专利、专利申请、论文、教科书等均以其全部内容并入作参考。在一或多个提及的文献和相似材料与本申请不同或矛盾时，包括但不限于定义的术语、术语的用途、描述的技术等方面，以本申请为准。
前文的描述和实施例详细描述了本发明的某些具体的实施方案，及描述了本发明人考虑的最佳模式。然而，应意识到无论前文中怎样详细描述，本发明可以许多方式进行，本发明应只根据所附权利要求书及其任何等价物阐述。

Claims (26)

1.一种免疫原性托法替尼缀合物，其包含与免疫原性载体结合的托法替尼，其中所述免疫原性载体是选自匙孔帽贝血蓝蛋白和牛血清白蛋白的蛋白质，进一步，其中
(a)所述免疫原性托法替尼缀合物具有如下结构
其中BSA是牛血清白蛋白；或者
(b)所述免疫原性托法替尼缀合物具有如下结构：
其中KLH是匙孔帽贝血蓝蛋白。
2.评估样品中托法替尼浓度的方法，所述方法包括：
(a)提供疑似含有托法替尼的样品；
(b)将所述样品或样品提取物与特异于托法替尼的抗体在适于抗体与托法替尼结合的条件下接触以形成测定混合物；及
(c)检测所述抗体与托法替尼的结合。
3.分离的抗体，其对于托法替尼的结合亲和性高于其对于式II的托法替尼代谢物1及式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
4.权利要求3的分离的抗体，其中所述抗体对于托法替尼的结合亲和性是所述抗体对于代谢物1或代谢物2的结合亲和性的25、30、40或50倍。
5.权利要求4的分离的抗体，其中所述抗体是使用免疫原性托法替尼缀合化合物获得的，所述化合物包含与免疫原性载体结合的托法替尼。
6.确定样品中托法替尼的量的方法，所述方法包括：
(a)提供已知量的标记的竞争物，其包含与可检测标记结合的托法替尼；
(b)提供选择性抗托法替尼抗体；
(c)组合所述样品、所述选择性抗托法替尼抗体及所述标记的竞争物，其中所述样品中的托法替尼与所述标记的竞争物竞争结合选择性抗托法替尼抗体；及
(d)通过检测所述标记测量未与抗体结合的标记的竞争物的量而确定样品中托法替尼的量。
7.权利要求6的方法，其中所述选择性抗托法替尼抗体对于托法替尼的结合亲和性高于所述抗体对于式II的托法替尼代谢物1和/或式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
8.权利要求7的方法，其中所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于所述抗体对于式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
9.确定样品中托法替尼的量的试剂盒，所述试剂盒包含：
标记的竞争物，其包含与可检测标记结合的托法替尼；及至少一种选择性抗托法替尼抗体；
其中所述标记的竞争物与样品中的托法替尼竞争结合所述抗托法替尼抗体。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述选择性抗托法替尼抗体对于托法替尼的结合亲和性高于所述抗体对于选自式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物的结合亲和性
11.权利要求10的试剂盒，其中所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于与所述抗体对于式II的托法替尼代谢物1及对于式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
12.用于确定样品中托法替尼浓度的竞争性免疫测定试剂盒，所述竞争性免疫测定包含：
(a)至少一种选择性抗托法替尼抗体；
(b)与可检测标记缀合的托法替尼化合物，
其中所述缀合的托法替尼化合物与样品中托法替尼竞争结合所述抗体；及
其中当样品中托法替尼以治疗性药物监测浓度存在时，所述标记提供表示样品中托法替尼浓度的信号。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述抗体对于托法替尼的结合亲和性高于所述抗体对于式II的托法替尼代谢物1及式III的托法替尼代谢物2的结合亲和性
14.分离的抗体，其结合托法替尼但是基本上不结合选自式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物
15.权利要求14的分离的抗体，其中所述抗体基本上不结合式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2
16.权利要求3的抗体，其中所述抗体可检测样品中的托法替尼，但是基本上不能检测样品中的托法替尼代谢物，其中托法替尼的量范围为大约5ng/mL-1215ng/mL、大约5ng/mL-405ng/mL或者大约15ng/mL-1215ng/mL。
17.一种分离的抗体，其对于托法替尼的结合亲和性高于其对于选自式II的托法替尼代谢物1和式III的托法替尼代谢物2的至少一种托法替尼代谢物的结合亲和性，所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中重链可变结构域包含三个互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，选自：
(a)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(c)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且其中所述轻链可变结构域包含三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，选自：
(d)LCDR1，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(e)LCDR2，其包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35的氨基酸序列；及
(f)LCDR3，其包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
18.权利要求17的抗体，其中所述抗体包含：
(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(c)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
(d)HCDR1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(e)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(f)HCDR1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(g)HCDR1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；及进一步包含LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(h)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列，及进一步包含轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(j)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(k)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(l)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(m)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(n)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(o)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(p)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(q)重链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列；及轻链可变结构域，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
19.权利要求15的抗体，其中所述抗体选自：
(a)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(b)包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，且进一步包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的抗体，所述HCDR1其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(c)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(d)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；及
(e)包含重链可变结构域，且进一步包含轻链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
20.权利要求19(a)的抗体，其中所述抗体能检测样品中浓度范围为大约15ng/ml-1215ng/ml的托法替尼。
21.权利要求19(b)的抗体，其中所述抗体能检测样品中浓度范围为大约5ng/ml-405ng/ml的托法替尼。
22.权利要求11的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求19(a)的抗体和权利要求19(b)的抗体，其中所述试剂盒可用于检测样品中浓度范围为大约5ng/ml-1215ng/ml的托法替尼。
23.编码权利要求18的抗体的核酸。
24.包含权利要求23的核酸的宿主细胞。
25.产生权利要求18的抗体的方法，包括在产生所述抗体的条件下培养权利要求24的宿主细胞。
26.权利要求25的方法，进一步包括分离所述抗体。
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