CN104407064A - 一种贝母药材的鉴别与含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贝母药材的鉴别与含量测定方法，其采用乙醇提取后，过中性氧化铝柱，高效液相色谱法测定，结合药材的特征图谱可有效鉴别浙贝母、川贝母、平贝母，并测定贝母素甲、乙的含量。该方法既可有效鉴别三种贝母药材的真伪，又可准确测定贝母素甲和贝母素乙的含量，一测多评，安全环保，方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及中药材的品质鉴定技术领域，具体涉及一种贝母药材的鉴别及其含量测定的方法。
背景技术
浙贝母为百合科贝母属，浙贝母的干燥鳞茎，被列为著名的“浙八味”名贵中药材之一，其味苦、性寒，具有清热润肺、化痰止咳、散结消肿之功效。川贝母为百合科贝母属，川贝母的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳之功效，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳咳、咯痰带血等病症的治疗，也是一味治疗久咳痰喘的良药。平贝母为百合科贝母属，平贝母的干燥鳞茎，也有清热润肺、止咳化痰的作用。浙贝母、川贝母和平贝母，三者同属于贝母属，均具有止咳化痰功效，其有效成分均为生物碱类物质；但由于其内在生物碱类的成分与含量不同，导致浙贝母、川贝母和平贝母在药用上存在一定差别。
目前市场上的贝母品种较多，而且各品种的价格差异大；由于川贝母的自然资源稀缺、人工栽培困难，因此各贝母品种中川贝母的市场价格最高。受利益驱动，也存在一些不法商家用浙贝母、川贝母和平贝母互相代替、甚至以伪替真来混淆消费者的现象。因此需要一种合适的鉴别手段将浙贝母、川贝母和平贝母三者药材进行区分。
目前，关于上述药材的鉴别手段，主要包括如下几种途径：
途径一是型态、显微、理化检测这些常规手段：由于浙贝母、川贝母和平贝母同属不同种，这些常规的检测手段，不易将它们区别开来。
途径二是采用薄层色谱鉴别：该方法的缺点在于，实验操作时人为的影响因素大，导致检测结果的重现性差。图14为浙贝母、川贝母和平贝母三者药材进行薄层鉴别的预实验结果，如图14所示，编号1～6是第一天的实验，其中1号和2号为川贝母，3号和4号为浙贝母，5号为贝母素甲对照，6号为贝母素甲与贝母素乙的混合对照；编号7～9是第二天的实验，其中7号为川贝母，8号为浙贝母，9号为贝母素甲与贝母素乙的混合对照；编号10～13是第三天的实验，其中10号为川贝母，11号为贝母素甲与贝母素乙的混合对照，12号和13号为浙贝母；编号14～17是第四天的实验，其中14号为川贝母，15号和16号为浙贝母，17号为贝母素甲与贝母素乙的混合对照。从图14中可以明显看出，采用薄层鉴别法的重现性较差。
途径三是采用高效液相色谱鉴别：高效液相色谱法具有高效、快速、稳定的特点，重现性好、灵敏度高，是一种中药材质量有效控制的手段。然而，现有贝母类药材的高效液相研究分为两大类，①用于同类药材定量的含量测定，主要针对目标成分进行提取与分析测定，这类方法的目标成分专属性强，有时为达到目标成分的色谱峰分离，则会舍弃一些其它的特征峰。②用于同类药材单纯的色谱峰研究，主要以色谱峰的展现为目标，以相似度为评价指标，但对其色谱峰的特征性及分离度则不做要求。上述两类高效液相研究目的都是为了构建药材的质控标准，以进一步提高药材质量，并不是为了对不同种的贝母药材进行区分、鉴别。
再者，众所周知，浙贝母、川贝母和平贝母，每种药材由于其内在生物碱类的成分与含量不同，所以都会采用适应自身成分与含量检测的专属高效液相色谱法，这些方法不能套用于同属不同种的贝母药材的研究，更无法将不同种的贝母药材进行良好的定量与定性区分。
综上所述，如何建立一种鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法，既能同时将三种贝母药材的特征进行区分与判定，起到药材真伪鉴别目的，又能对药材成分准确定量，起到药材质量控制目的，实现真正的一测多评，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明提供了一种贝母药材的鉴别及含量测定方法，其首要目的在于能够有效区分与判定浙贝母、川贝母和平贝母药材，次要目的在于能够定量测定贝母药材中贝母素甲和贝母素乙的含量，起到真伪鉴别与质量控制的双重目的，解决了上述现有技术存在的缺陷。
本发明所采用的技术方案具体如下：
一种贝母药材的鉴别与含量测定方法，包括如下步骤：
(1)药材的提取与纯化：取贝母药材，研磨成粉末置于烧瓶中，加50～100％乙醇，提取1～6小时，过滤，滤液回收溶剂，溶解残渣，上样于中性氧化铝柱，洗脱，收集洗脱液；
(2)供试品溶液的制备：将洗脱液蒸干后，残渣用甲醇或乙腈溶液溶解并定容至5ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)对照品溶液的制备：精密称取贝母素甲、贝母素乙的对照品适量，用甲醇溶解，即得；
(4)高效液相色谱分析：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件测定，得贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图和供试品的特征图谱；
色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.03％二乙胺水溶液；蒸发光散射检测器；柱温为30℃；进样量为40ul；流速为1.0ml/min；采用梯度洗脱：0～15min乙腈由47％上升到52％，15～25min乙腈由52％上升到70％，25～50min乙腈由70％上升到90％，50～60min乙腈保持90％；
(5)以贝母素乙为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RRT，并结合特征峰个数与面积，区分与判定贝母药材的种类；其中，构建的浙贝母特征图谱中有9个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、14.37(峰2)、1.52(峰3)、1.57(峰4)、0.83(峰5)、1.15(峰6)、1.23(峰7)、1.35(峰8)、1.43(峰9)，且峰5在样品中占比最高，不含峰10、峰11；平贝母特征图谱中有6个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、1.35(峰2)、1.54(峰3)、1.65(峰4)、0.77(峰5)、0.82(峰10)、1.42(峰11)，不含峰6、峰7、峰8、峰9；川贝母特征图谱中有7个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、1.33(峰2)、1.52(峰3)、1.61(峰4)、1.23(峰7)、1.45(峰9)、1.41(峰11)，不含峰5、峰6、峰8、峰10；前述的峰型中，峰5为贝母素甲，峰1为贝母素乙，其余皆为未知成分；
或，根据贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图，计算供试品中贝母素甲、贝母素乙的含量。
优选的，步骤(1)中，取研磨成粉末的贝母药材2g，置于烧瓶中，加入50～300ml的70％乙醇提取2～4小时，过滤，滤液回收溶剂得残渣，残渣用甲醇溶液溶解，上样于4～10g中性氧化铝柱，再用10～100ml甲醇洗脱，收集洗脱液。
更优选的，步骤(2)中，洗脱液蒸干后的残渣用70％乙腈溶解并定容至5ml。
优选的，取研磨成粉末的贝母药材2g，置于烧瓶中，加入200ml的70％乙醇溶液提取3小时，过滤，滤液回收溶剂得残渣，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g的100～200目中性氧化铝柱，再用50ml甲醇洗脱；洗脱液蒸干后的残渣用70％乙腈溶解，并转移定容至5ml量瓶中。
本发明提供的方法可以用于构建贝母药材的特征图谱，并利用特征图谱来鉴别同属不同种的贝母药材。具体而言，以贝母素乙为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，得到保留时间值(RRT)。其中，构建的浙贝母特征图谱中有9个特征峰，即峰1(RRT为1)、峰2(RRT为14.37)、峰3(RRT为1.52)、峰4(RRT为1.57)、峰5(RRT为0.83)、峰6(RRT为1.15)、峰7(RRT为1.23)、峰8(RRT为1.35)、峰9(RRT为1.43)，且峰5在样品中占比最高，不含峰10、峰11；平贝母特征图谱中有6个特征峰，即峰1(RRT为1)、峰2(RRT为1.35)、峰3(RRT为1.54)、峰4(RRT为1.65)、峰5(RRT为0.77)、峰10(RRT为0.82)、峰11(RRT为1.42)，不含峰6、峰7、峰8、峰9；川贝母特征图谱中有7个特征峰，即峰1(RRT为1)、峰2(RRT为1.33)、峰3(RRT为1.52)、峰4(RRT为1.61)、峰7(RRT为1.23)、峰9(RRT为1.45)、峰11(RRT为1.41)，不含峰5、峰6、峰8、峰10。前述的峰型中，峰5为贝母素甲，峰1为贝母素乙，其余皆为未知成分。
另外，本发明可以有效检测出同属不同种贝母药材中贝母素甲、贝母素乙的含量，如浙贝母中贝母素甲+贝母素乙的含量超过1％，而平贝母中贝母素甲+贝母素乙的含量为0.01～0.1％，川贝母中不含贝母素甲，贝母素乙的含量低于0.01％，该含量区别也可以作为贝母药材的质量控制方法。
本发明提供的一种贝母药材的鉴别及含量测定方法，具有如下优势：
1、本发明采用高效液相色谱法原创性地开发出了贝母药材的特征图谱，能够标识贝母药材中各组分群体特征峰，即可用于有效鉴别浙贝母、川贝母和平贝母药材的真伪，又可准确定量测定药材中贝母素甲和贝母素乙的含量，是一种综合的、可量化的鉴别手段，本发明解决了以往药材鉴别或含量测定方法专属性的问题，实现了一个方法可以同时应用于三种药材的鉴别和含量测定，本发明具有稳定、高效、准确的特点，一测多评，简便快捷。
2、本发明与现有方法相比，弃用氯仿/甲醇溶液作为提取溶剂，改用乙醇/水溶液提取贝母药材，有效提高了待测成分的提取率，且在不改变目标成分主要色谱峰个数和峰面积的同时，还避免了有毒试剂的使用，环保无污染，且降低了试剂成本。
3、本发明采用中性氧化铝对提取溶液进行纯化、用70％乙腈进行制样，充分去除了干扰特征峰色谱行为的杂质，尤其是可以去除对贝母药材中最主要的特征成分贝母素甲干扰杂峰，大大改善了特征色谱峰的色谱行为和分离效果。
附图说明
图1为对未知药材判定为浙贝母的特征图谱。
其中：5号峰为贝母素甲，1号峰为贝母素乙，2、3、4、6、7、8、9号峰为未知成分
图2为对未知药材判定为川贝母的特征图谱。
其中：1号峰为贝母素乙，2、3、4、7、9、11号峰为未知成分
图3为对未知药材判定为平贝母的特征图谱。
其中：5号峰为贝母素甲，1号峰为贝母素乙，2、3、4、10、11号峰为未知成分
图4为对未知药材中贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图。
其中：1号峰为贝母素甲，2号峰为贝母素乙
图5为按药典方法进行含量测定的对照品色谱图。
其中：1为贝母素甲色谱峰，2为贝母素乙色谱峰
图6为按药典方法进行含量测定的浙贝母样本的色谱图。
其中：1为贝母素甲色谱峰，2为贝母素乙色谱峰
图7为用氯仿-甲醇(4:1)提取的浙贝母的特征色谱图。
其中：1号峰为贝母素甲，2号峰为贝母素乙，3～9号峰为未知成分
图8为用70％乙醇提取的浙贝母的特征色谱图。
其中：1号峰为贝母素甲，2号峰为贝母素乙，3～9号峰为未知成分
图9为用70％乙醇提取、中性氧化铝纯化、甲醇制样的浙贝母的特征色谱图。
其中：1号峰为贝母素甲，2号峰为贝母素乙，3～9号峰为未知成分
图10为用70％乙醇提取、中性氧化铝纯化、70％乙腈制样的浙贝母的特征色谱图。
其中：1号峰为贝母素甲，2号峰为贝母素乙，3～9号峰为未知成分
图11为本发明提供的浙贝母特征图谱。
图12为本发明提供的川贝母特征图谱。
图13为本发明提供的平贝母特征图谱。
图14为浙贝母、川贝母和平贝母药材的薄层色谱图。
具体实施方式
实施例1：对未知不同贝母药材的鉴别与区分
于2014年3月6日从杭州市某中药房购得未知贝母药材三批，按本发明提供的鉴别方法对其进行区分与判定：
(1)对照品溶液的制备：精密称取贝母素甲、贝母素乙的对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：分别取上述三批未知贝母药材2g，研磨成粉末，放置烧瓶中，加200ml 70％乙醇，提取3h，过滤，滤液回收溶剂得残渣，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g中性氧化铝(100～200目)，再用50ml甲醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后，残渣中加入70％乙腈使溶解，并转移定容至5ml量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)高效液相色谱分析：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件测定，得未知贝母药材的特征图谱，三批未知贝母药材的高效液相色谱测定结果见图1～图3，对照品溶液(贝母素甲、贝母素乙对照品)的色谱图见图4。
色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.03％二乙胺水溶液；蒸发光散射检测器；柱温为30℃；进样量为40ul；流速为1.0ml/min；采用梯度洗脱：0～15min乙腈由47％上升到52％，15～25min乙腈由52％上升到70％，25～50min乙腈由70％上升到90％，50～60min乙腈保持90％。
观察、分析图1～图3，可知：
图1为第一批药材的特征图谱：图中出现9个特征峰，即峰1～9，对应为浙贝母的特征峰；其中峰5占比最高，且无峰10和11。上述均为浙贝母图谱的特征，因此可判定第一批药材为浙贝母。
图2为第二批药材的特征图谱：图中出现7个特征峰，即峰1～4、峰7、峰9、峰11，对应为川贝母的特征峰；川贝母的另一个特征是无峰6、峰8、峰10，与图2吻合，因此可判定第二批药材为川贝母。
图2为第三批药材的特征图谱：图中出现7个特征峰，即峰1～5、峰10、峰11，对应为平贝母的特征峰；平贝母的另一个特征是无峰6～9，与图3吻合，因此可判定第三批药材为平贝母。
实施例2：不同贝母药材中贝母素甲和贝母素乙的含量测定
(1)按照药典的方法进行含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按贝母素甲峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备：取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml中含贝母素甲0.2mg、贝母素乙0.15mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：分别称取浙贝母、平贝母、川贝母样本的粉末(过四号筛，65目)约2g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4ml浸润1h，精密加入三氯甲烷-甲醇(4:1)的混合溶液40ml，称定重量，混匀，置80℃水浴中加热回流2h，放冷，再称定重量，加上述混合溶液补足减失的重量，并滤过。精密量取续滤液10ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液10ul、20ul，供试品溶液5～15ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量，即得。
按药典方法进行含量测定的对照品色图谱见图5，浙贝母样本色图谱见图6，计算结果见表1。
(2)按照本发明提供的方法进行含量测定：
按本发明实施例1的方法进行，根据贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图(见图4)，计算浙贝母、川贝母、平贝母这三种药材(见图1～图3)中贝母素甲、贝母素乙的含量，计算结果见表1。
表1浙贝母、川贝母、平贝母样本的含量测定结果
由表1结果可知：利用本发明方构建的特征图谱，不但能区分和判定不同种的贝母药材，同时还能够定量测定贝母素甲、贝母素乙的含量，所得含量与采用现行药典方法测得的含量一致；证明了本发明方法具有评价贝母药材质量的价值。
实施例3：提取溶剂的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，加入(或不加入)浓氨水4.0mL浸润1h，分别用200ml的氯仿-甲醇(4:1)、氯仿、甲醇、90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇这几种提取溶剂，回流提取5h，过滤，测定滤液中贝母素甲、贝母素乙的含量，并比较各特征图谱。
结果：含量测定的结果见表2，用氯仿-甲醇(4:1)作提取溶剂测得的色谱图见图7，用70％乙醇作提取溶剂测得的色谱图见图8。
表2提取溶剂对贝母素甲、贝母素乙的影响
可知：
①当“不用浓氨水浸润，仅用70％乙醇提取”时，贝母素甲和贝母素乙的提取效率最高，并且所测得的特征图谱与药典规定的“加浓氨水，并用氯仿-甲醇(4：1)作提取溶剂”方法测得的图谱基本一致，相似度达0.997。
②由于氯仿属于易制毒产品，生产使用中难免会危及人身健康，污染环境，因此用70％乙醇替代氯仿，不仅提取效果好，而且安全、环保。
③图7中，贝母素甲有明显的杂峰干扰，6号峰和8号峰的峰型很差；图8中，贝母素甲也有明显的杂峰干扰，6号峰的峰型也很差，但8号峰的峰型明显改观，说明选用70％乙醇作为提取溶剂有了显著的进步。
实施例4：提取溶剂用量的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，分别用50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml的70％乙醇作为提取溶剂，提取3h，过滤，测定滤液中贝母素甲和贝母素乙的含量。
结果：含量测定的结果见表3，可知：当70％乙醇的用量达到200ml(即100倍)时，贝母素甲和贝母素乙含量基本达到最高点，与70％乙醇的用量达到250ml(即125倍)和300ml(即150倍)时的提取效果基本一致；综合成本考虑，优选70％乙醇的用量为200ml。
表3提取溶剂用量对贝母素甲和贝母素乙的影响
| 提取溶剂用量 | 贝母素甲含量(％) | 贝母素乙含量(％) |
| 50ml | 0.086 | 0.062 |
| 100ml | 0.107 | 0.078 |
| 150ml | 0.119 | 0.084 |
| 200ml | 0.123 | 0.088 |
| 250ml | 0.123 | 0.087 |
| 300ml | 0.124 | 0.088 |
实施例5：提取时间的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，用200ml 70％乙醇分别提取1、2、3、4、5、6小时，过滤，测定滤液中贝母素甲和贝母素乙的含量。
结果：含量测定的结果见表4，可知：当提取时间达到3h时，贝母素甲和贝母素乙含量基本达到最高点，与提取4、5、6小时的效果基本一致；综合时间成本考虑，优选的提取时间为3h。
表4提取时间对贝母素甲和贝母素乙的影响
| 提取时间(h) | 贝母素甲含量(％) | 贝母素乙含量(％) |
| 1 | 0.079 | 0.060 |
| 2 | 0.109 | 0.080 |
| 3 | 0.124 | 0.088 |
| 4 | 0.123 | 0.088 |
| 5 | 0.123 | 0.087 |
| 6 | 0.124 | 0.088 |
实施例6：纯化用材料的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，用200ml 70％乙醇分别提取3h，过滤，滤液回收溶剂，残渣用5ml甲醇溶解，分别用非极性大孔树脂、弱极性大孔树脂、中极性大孔树脂、极性大孔树脂、聚酰胺、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、中性氧化铝、酸性氧化铝、硅藻土这几种材料纯化，纯化后对所得洗脱液测定贝母素甲和贝母素乙的含量，并比较中性氧化铝纯化前后特征谱图的变化。
结果：含量测定的结果见表5、用70％乙醇作提取溶剂(纯化前)测得的色谱图见图8、用70％乙醇作提取溶剂(中性氧化铝纯化后)测得的色谱图见图9。
表5纯化用材料对贝母素甲和贝母素乙的影响
| 纯化用材料 | 贝母素甲含量(％) | 贝母素乙含量(％) |
| 非极性大孔树脂 | 0.078 | 0.061 |
| 弱极性大孔树脂 | 0.105 | 0.078 |
| 中极性大孔树脂 | 0.082 | 0.062 |
| 极性大孔树脂 | 0.103 | 0.078 |
| 聚酰胺 | 0.042 | 0.025 |
| 阳离子交换树脂 | 0.108 | 0.079 |
| 阴离子交换树脂 | 0.053 | 0.038 |
| 中性氧化铝 | 0.123 | 0.088 |
| 酸性氧化铝 | 0.101 | 0.067 |
| 硅藻土 | 0.062 | 0.043 |
可知：
①用中性氧化铝纯化提取液，与用其他材料纯化相比，贝母素甲和贝母素乙基本不损失，影响最小；
②用中性氧化铝纯化前后，测得特征图谱色谱行为有了明显的改善：图9中1号峰贝母素甲虽有杂峰干扰，但相对于图8的杂峰干扰已有明显改观；而且6号峰的峰型相对于图8也有明显改观，说明选用中性氧化铝作纯化材料有了显著的进步。
实施例7：中性氧化铝用量的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，用200ml 70％乙醇分别提取3h，过滤，滤液回收溶剂，残渣用5ml甲醇溶解，分别上样于4g、6g、8g、10g中性氧化铝(100～200目)，再用100ml甲醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中贝母素甲和贝母素乙的含量。
结果：含量测定结果见表6，可知：当中性氧化铝用量达到6g时，贝母素甲和贝母素乙不会损失。
表6中性氧化铝用量对贝母素甲和贝母素乙的影响
| 中性氧化铝用量(g) | 贝母素甲含量(％) | 贝母素乙含量(％) |
| 4 | 0.119 | 0.085 |
| 6 | 0.123 | 0.088 |
| 8 | 0.124 | 0.088 |
| 10 | 0.123 | 0.088 |
实施例8：洗脱溶剂用量的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，用200ml 70％乙醇分别提取3h，过滤，滤液回收溶剂，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g中性氧化铝(100～200目)，再分别用30ml、50ml、70ml、90ml甲醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中贝母素甲和贝母素乙的含量。
结果：含量测定结果见表7，可知：当洗脱溶剂甲醇的用量达到50ml时，贝母素甲和贝母素乙不会损失。
表7洗脱溶剂用量对贝母素甲和贝母素乙的影响
| 洗脱溶剂用量(ml) | 贝母素甲含量(％) | 贝母素乙含量(％) |
| 30 | 0.117 | 0.082 |
| 50 | 0.123 | 0.088 |
| 70 | 0.123 | 0.088 |
| 90 | 0.123 | 0.088 |
实施例9：制样溶剂的考察
方法：取贝母药材粉末2g置烧瓶中，用200ml 70％乙醇分别提取3h，过滤，滤液回收溶剂，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g中性氧化铝(100～200目)，再用50ml甲醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后，分别用甲醇、70％甲醇、50％乙腈、70％乙腈、90％乙腈这几种制样溶剂溶解残渣，比较各特征图谱。
结果：用70％乙醇作提取溶剂、中性氧化铝纯化、甲醇制样测得的色谱图见图9，用70％乙醇提取、中性氧化铝纯化、70％乙腈制样测得的色谱图见图10。此外，发明人经实验发现：
①当制样溶剂为甲醇或70％甲醇或90％乙腈时，三者测得的特征图谱非常相似，即图9；缺点在于：1号峰贝母素甲有一小杂峰干扰，5号峰和6号峰未完全分离。
当制样溶剂为70％乙腈时，图10的特征图谱的色谱行为进一步改善，主峰的分离效果更好；与图9比较，优点在于：1号峰贝母素甲无干扰，5号峰和6号峰完全分离，峰型好。
②当制样溶剂为50％乙腈时，贝母素甲峰的峰面积明显降低，经含量计算得，贝母素甲的含量为0.102％；而当制样溶剂为70％乙腈时，贝母素甲的含量为0.123％。
综上说明，最佳的制样溶剂为70％乙腈。
实施例10：不同贝母药材的含量测定方法学验证
(1)对照品溶液的制备：精密称定贝母素甲、贝母素乙对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：分别称取浙贝母、川贝母、平贝母三种药材粉末2g，置烧瓶中，用200ml 70％乙醇提取3h，过滤，滤液回收溶剂，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g中性氧化铝(100～200目)，再用50ml甲醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后，残渣中加入70％乙腈使溶解，并转移定容至2ml量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。
(3)高效液相色谱分析：色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.03％二乙胺水溶液；蒸发光散射检测器；柱温为30℃；进样量为40ul；流速为1.0ml/min；采用梯度洗脱：0～15min乙腈由47％上升到52％，15～25min乙腈由52％上升到70％，25～50min乙腈由70％上升到90％，50～60min乙腈保持90％。
(4)方法学验证
精密度试验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，以贝母素乙的色谱峰为参照峰，计算其各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。
重复性试验：取同一样品6份，按照前述“(2)供试品溶液的制备”项的方法制备供试品溶液，在前述“(3)高效液相色谱分析”项的色谱条件下记录色谱图，计算其各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，记录0、4、8、12、24h的色谱图，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
(5)样品测定
分别取四批浙贝母、三批川贝母、三批平贝母药材，前述“(2)供试品溶液的制备”项的方法制备供试品溶液，在前述“(3)高效液相色谱分析”项的色谱条件下记录色谱图。
(6)结果
表8特征图谱方法学验证结果
由表8可知：利用本发明方法构建的特征图谱，经浙贝母、川贝母、平贝母三种贝母药材的方法学验证后，发现其结果无论是仪器精密度、方法重复性，还是样本的稳定性均符合方法学验证要求，说明利用本发明提供的方法，可同时测定上述三种贝母药材的特征图谱。
浙贝母的特征图谱见图11，川贝母的特征图谱见图12，平贝母的特征图谱见图13。
从三种贝母药材的特征图谱中，我们可以总结、归纳出如下特点，用于鉴别药材真伪：
(1)共同点
①浙贝母、川贝母和平贝母三者的共有峰：峰1、峰2、峰3、峰4；
②浙贝母与平贝母的共有峰：峰1、峰2、峰3、峰4、峰5；
③浙贝母与川贝母的共有峰：峰1、峰2、峰3、峰4、峰7、峰9、峰11；
④川贝母与平贝母的共有峰：峰1、峰2、峰3、峰4、峰11。
(2)区别点
①浙贝母共有9个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9，且峰5在样品中占比最高，不含峰10、峰11；
②平贝母共有7个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰10、峰11，不含峰6、峰7、峰8、峰9；
③川贝母共有7个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰4、峰7、峰9、峰11，不含峰5、峰6、峰8、峰10。
实施例11：三种贝母药材中贝母素甲和贝母素乙含量测定的方法学验证
(1)对照品溶液的制备：制备方法同实施例10。
(2)供试品溶液的制备：制备方法同实施例10。
(3)高效液相色谱分析：色谱条件同实施例10。
(4)方法学验证
精密度试验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。测得贝母素甲和贝母素乙的峰面积的RSD分别为0.96％和1.23％，表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一样品6份，按照“(2)供试品溶液的制备”项的方法制备供试品溶液，在“(3)高效液相色谱分析”项的色谱条件下记录色谱图，测得贝母素甲和贝母素乙含量的RSD分别为0.78％和2.13％，表明方法重复性良好。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，记录0、4、8、12、24h的色谱图。测得贝母素甲和贝母素乙含量的RSD分别为1.57％和2.61％，表明样品在24h内稳定。
加样回收实验：贝母素甲和贝母素乙的加样回收率分别为98.58％和99.61％，RSD分别为1.27％和3.86％，说明方法准确度较好。
(5)结果
对浙贝母4批、川贝母3批、平贝母3批药材中贝母素甲和贝母素乙的含量进行测定，结果见表9，发现与用现行药典方法所测得的结果基本一致。浙贝母中贝母素甲+贝母素乙的含量和超过0.198％；而平贝母中贝母素甲+贝母素乙的含量和明显低于浙贝母，其范围0.020～0.025％；川贝母中不含贝母素甲，贝母素乙的含量低于0.005％。
表9三种贝母药材中贝母素甲和贝母素乙的含量
Claims (5)
1.一种贝母药材的鉴别与含量测定方法，包括如下步骤：
(1)药材的提取与纯化：取贝母药材，研磨成粉末置于烧瓶中，加50～100％乙醇，提取1～6小时，过滤，滤液回收溶剂得残渣，溶解残渣，上样于中性氧化铝柱，洗脱，收集洗脱液；
(2)供试品溶液的制备：将洗脱液蒸干后，残渣用甲醇或乙腈溶液溶解并定容至5ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)对照品溶液的制备：精密称取贝母素甲、贝母素乙的对照品适量，用甲醇溶解，即得；
(4)高效液相色谱分析：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件测定，得贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图和供试品的特征图谱；
色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.03％二乙胺水溶液；蒸发光散射检测器；柱温为30℃；进样量为40ul；流速为1.0ml/min；采用梯度洗脱：0～15min乙腈由47％上升到52％，15～25min乙腈由52％上升到70％，25～50min乙腈由70％上升到90％，50～60min乙腈保持90％；
(5)以贝母素乙为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RRT，并结合特征峰个数与面积，区分与判定贝母药材的种类；其中，构建的浙贝母特征图谱中有9个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、14.37(峰2)、1.52(峰3)、1.57(峰4)、0.83(峰5)、1.15(峰6)、1.23(峰7)、1.35(峰8)、1.43(峰9)，且峰5在样品中占比最高，不含峰10、峰11；平贝母特征图谱中有6个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、1.35(峰2)、1.54(峰3)、1.65(峰4)、0.77(峰5)、0.82(峰10)、1.42(峰11)，不含峰6、峰7、峰8、峰9；川贝母特征图谱中有7个特征峰，其RRT值分别为1(峰1)、1.33(峰2)、1.52(峰3)、1.61(峰4)、1.23(峰7)、1.45(峰9)、1.41(峰11)，不含峰5、峰6、峰8、峰10；前述的峰型中，峰5为贝母素甲，峰1为贝母素乙，其余皆为未知成分；
或，根据贝母素甲、贝母素乙的对照品色谱图，计算供试品中贝母素甲、贝母素乙的含量。
2.根据权利要求1所述的贝母药材的鉴别与含量测定方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，取研磨成粉末的贝母药材适量，置于烧瓶中，加入50～300ml的70％乙醇提取2～4小时，过滤，滤液回收溶剂得残渣，残渣用甲醇溶液溶解，上样于4～10g中性氧化铝柱，再用10～100ml甲醇洗脱，收集洗脱液。
3.根据权利要求1所述的贝母药材的鉴别与含量测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，洗脱液蒸干后的残渣用70％乙腈溶解并定容至5ml。
4.根据权利要求1～3任一项所述的贝母药材的鉴别与含量测定方法，其特征在于，取研磨成粉末的贝母药材2g，置于烧瓶中，加入200ml的70％乙醇溶液提取3小时，过滤，滤液回收溶剂得残渣，残渣用5ml甲醇溶解，上样于6g的100～200目中性氧化铝柱，再用50ml甲醇洗脱；洗脱液蒸干后的残渣用70％乙腈溶解，并转移定容至5ml量瓶中。
5.一种如权利要求1～3任一项所述的贝母药材的鉴别与含量测定方法在构建浙贝母、川贝母或平贝母特征图谱中的应用。
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