CN104398669A - 无咖啡因茶多酚分离纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，该方法将茶叶用体积分数为0～80％的乙醇水溶液提取后，用盐酸调节pH值至3～5，上LX-8型大孔吸附树脂柱，先用体积分数为0～5％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数为50％～70％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为50％～70％的乙醇水溶液洗脱液，干燥得到无咖啡因茶多酚产品。该方法仅需要一次树脂柱分离，即可得茶多酚含量大于96％，EGCG含量大于60％，咖啡因含量低至检测不出的高纯度茶多酚产品。本发明操作简单，成本低廉，生产效率高，绿色安全且实用性强，适合茶多酚食品、药品和日用品等领域原料的工业化生产，易推广使用。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的分离纯化技术领域，具体涉及一种工业化生产无咖啡因茶多酚产品的方法。
背景技术
茶多酚药理活性广泛，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗高血脂、防治动脉粥样硬化和抗病毒等药理活性。据2013年华讯市场咨询网报道，茶多酚已成为世界范围内的食品、饮料用防腐剂、抗氧化剂原料，以及医药保健品和功能性食品饮料用原料。
目前，茶多酚分离纯化常见的方法有溶剂萃取法、离子沉淀法和柱层析法。溶剂萃取法和离子沉淀法易造成有机溶剂或重金属残留，茶多酚产品纯度也不高，柱层析法是最具应用前景的方法，然而填料的选择是关键。目前已授权的专利，如CN102225122A无咖啡因茶多酚及其制备方法和CN102050843A一种从茶叶中提取生物碱、儿茶素的方法，使用的填料葡聚糖凝胶LH-20或交联葡聚糖凝胶价格昂贵，仅适合科学研究或实验室小批量茶多酚的制备，不适合工业化生产。申请号为201310290155.9、201210526795.0和200910055663.2的发明专利选用大孔吸附树脂D101、AB-8、HP-20、X-5、ADS-F8分离纯化茶多酚，大孔吸附树脂相对于葡聚糖凝胶来说，更加高效，且价格便宜几百倍，整个过程使用的有机溶剂主要是乙醇，易回收、无毒、安全，但它们对茶多酚的选择性较差，得到的产品纯度在76％～87％之间，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量达不到40％，需要结合其他纯化方法，而且咖啡因脱除效果不理想。
黄磊的学位论文《儿茶素单体EGCG绿色高效提取分离工艺研究》中，选用LX-16大孔吸附树脂先用10％乙醇同时除掉咖啡因和简单儿茶素，再用40％乙醇洗脱得到酯型儿茶素，这个分离纯化方法仅得到酯型儿茶素，虽然EGCG含量有所提高，可达50％以上，但是咖啡因和简单儿茶素无法分离，不能够达到综合利用的效果；其进而用LX-8大孔吸附树脂二级分离，通过10％乙醇洗脱将EGCG分离，再用20％乙醇洗脱得到ECG单体，然而，在不同吸附洗脱条件下纯化效果差异很大，该方法能否用于分离合格茶多酚产品未知。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有柱层析法分离纯化茶多酚成本较高或产品纯度较低的缺点，提供一种利用LX-8型大孔吸附树脂分离纯化无咖啡因茶多酚的方法，该方法成本低廉，对茶多酚尤其是EGCG选择性高，对咖啡因选择性低。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、提取
将茶叶粉碎后过60～80目筛，用体积分数为0～80％的乙醇水溶液提取，过滤，蒸发回收乙醇，用水稀释至茶叶与水的质量-体积比为0.02～0.05g:1mL，用盐酸调节pH值至3～5，离心或过滤分离，得到茶汤。
2、分离纯化
将茶汤上LX-8型大孔吸附树脂柱，上样量为柱体积的37～56倍，上样流速为0.5～2BV/h，先用体积分数为0～5％的乙醇水溶液洗脱除杂，其用量为柱体积的26～30倍、流速为1～4BV/h，再用体积分数为50％～70％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的14～20倍、流速为1～4BV/h，收集体积分数为50％～70％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。
上述的LX-8型大孔吸附树脂柱的径高比为1:5～15，优选径高比为1:10。
上述的茶汤的上样量优选为柱体积的51～56倍，上样流速优选为1BV/h。
上述的体积分数为0～5％的乙醇水溶液的用量优选为柱体积的28倍、流速优选为3BV/h。
上述的体积分数为50％～70％的乙醇水溶液的用量优选为柱体积的16倍、流速优选为3BV/h。
本发明的LX-8型大孔吸附树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
本发明采用LX-8型大孔吸附树脂柱分离纯化茶多酚，其对茶多酚尤其是其主成分EGCG选择性高，所得茶多酚纯度可以达到96％以上，不含咖啡因，其中抗氧化活性最强的EGCG含量在60％以上，且茶多酚的回收率可达到70％以上，EGCG的回收率可达到80％以上。本发明操作简单，成本低廉，生产效率高，经济环保，产品无有毒试剂残留，用于食品、医药等行业安全可靠，适用于大规模工业化生产。
附图说明
图1是实施例1中茶汤的HPLC图谱，其中1是没食子儿茶素(GC)，2是表没食子儿茶素(EGC)，3是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，4是咖啡因(CAF)，5是表儿茶素(EC)，6是表儿茶素没食子酸酯(ECG)。
图2是实施例1中水洗部分流出液的HPLC色谱图。
图3是实施例1所得无咖啡因茶多酚产品的HPLC色谱图。
图4是图1～3的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，并本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、提取
将绿茶粉碎后过80目筛，取300g绿茶粉末，用2.4L体积分数为65％的乙醇水溶液在70℃下提取两次，每次40分钟，过滤，滤液在55℃下减压浓缩回收乙醇，然后用蒸馏水稀释至茶叶与水的质量-体积比为0.02g:1mL，用盐酸调节pH值至5，离心分离，得到茶汤(其HPLC色谱图见图1)。
2、分离纯化
按常规方法对LX-8型大孔吸附树脂进行预处理(用体积分数为95％的乙醇水溶液浸泡过夜并反复淋洗，再用蒸馏水洗至无醇味，过滤)，将预处理后的LX-8型大孔吸附树脂装入1.5cm(直径)×60cm的层析柱中，装入树脂高度为15cm，以1BV/h的流速加入53倍柱体积的茶汤，上样完成后，先用蒸馏水洗脱除杂(流出液的HPLC色谱图见图2)，蒸馏水的用量为柱体积的28倍、流速为3BV/h，再用体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的16倍、流速为3BV/h，收集体积分数为70％的乙醇水溶液的洗脱液，在55℃下减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。
按照QB2154-1995《茶多酚含量的测定方法》对所得产品中茶多酚含量进行测定，以HPLC法对EGCG含量进行测定(见图3)。经测定，所得产品茶多酚含量为98.3％，EGCG含量为66.8％，未检测出咖啡因，茶多酚的回收率为78.8％，EGCG的回收率为88.9％。
对比实施例1
1、提取
将绿茶粉碎后过80目筛，取300g绿茶粉末，用2.4L体积分数为65％的乙醇水溶液在70℃下提取两次，每次40分钟，过滤，滤液在55℃下减压浓缩回收乙醇，浓缩液用水稀释，得到茶汤，测得茶汤中EGCG含量为4.10mg/mL。
2、分离纯化
按常规方法对LX-8型大孔吸附树脂进行预处理，将预处理后的LX-8型大孔吸附树脂装入1.5cm(直径)×60cm的层析柱中，装入树脂高度为15cm，以1BV/h的流速加入4倍柱体积的茶汤，上样完成后，先用体积分数为10％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的4倍、流速为2BV/h，再用体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的4倍、流速为2BV/h，分别收集体积分数为10％和20％的乙醇水溶液的洗脱液，在55℃下减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥。经测定，体积分数为10％的乙醇水溶液的洗脱液部分所得产品中茶多酚含量为84.2％，EGCG含量为52.4％，咖啡因含量为12.5％；体积分数为20％的乙醇水溶液的洗脱液部分所得产品中茶多酚含量为96.9％，EGCG含量为73.0％，咖啡因含量为0.4％；两部分茶多酚的总回收率为58.7％，EGCG的总回收率为43.7％。
实施例2
本实施例的提取步骤1与实施例1相同。在分离纯化步骤2中，将预处理后的LX-8型大孔吸附树脂装入3cm(直径)×60cm的层析柱中，装入树脂高度为28.5cm，以1BV/h的流速加入52倍柱体积的茶汤，上样完成后，先用体积分数为5％的乙醇水溶液洗脱除杂，其用量为柱体积的26倍、流速为3BV/h，再用体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的17倍、流速为3BV/h，收集体积分数为60％的乙醇水溶液的洗脱液，在55℃下减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。经测定，所得产品茶多酚含量为96.7％，EGCG含量为62.2％，未检测出咖啡因，茶多酚的回收率为71.6％，EGCG的回收率为93.6％。
实施例3
本实施例的提取步骤1中，用蒸馏水稀释至茶叶与水的质量-体积比为0.05g:1mL，用盐酸调节pH值至3，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到茶汤。在分离纯化步骤2中，按常规方法对LX-8型大孔吸附树脂进行预处理，将预处理后的LX-8型大孔吸附树脂装入3cm(直径)×60cm的层析柱中，装入树脂高度为15cm，以0.5BV/h的流速加入37倍柱体积的茶汤，上样完成后，先用蒸馏水洗脱除杂，蒸馏水的用量为柱体积的30倍、流速为1BV/h，再用体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的20倍、流速为1BV/h，收集体积分数为50％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩蒸除乙醇，冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。经测定，所得产品茶多酚含量为96.0％，EGCG含量为64.3％，未检测出咖啡因，茶多酚的回收率为80.4％，EGCG的回收率为81.9％。
实施例4
本实施例的提取步骤1与实施例1相同。在分离纯化步骤2中，按常规方法对LX-8型大孔吸附树脂进行预处理，将预处理后的LX-8型大孔吸附树脂装入3cm(直径)×60cm的层析柱中，装入树脂高度为45cm，以2BV/h的流速加入51倍柱体积的茶汤，上样完成后，先用体积分数为5％的乙醇水溶液洗脱除杂，其用量为柱体积的28倍、流速为4BV/h，再用体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的14倍、流速为4BV/h，收集体积分数为70％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩蒸除乙醇，冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。经测定，所得产品茶多酚含量为97.2％，EGCG含量为61.2％，未检测出咖啡因，茶多酚的回收率为70.9％，EGCG的回收率为86.8％。
Claims (6)
1.一种无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)提取
将茶叶粉碎后过60～80目筛，用体积分数为0～80％的乙醇水溶液提取，过滤，蒸发回收乙醇，用水稀释至茶叶与水的质量-体积比为0.02～0.05g:1mL，用盐酸调节pH值至3～5，离心或过滤分离，得到茶汤；
(2)分离纯化
将茶汤上LX-8型大孔吸附树脂柱，上样量为柱体积的37～56倍，上样流速为0.5～2BV/h，先用体积分数为0～5％的乙醇水溶液洗脱除杂，其用量为柱体积的26～30倍、流速为1～4BV/h，再用体积分数为50％～70％的乙醇水溶液洗脱，其用量为柱体积的14～20倍、流速为1～4BV/h，收集体积分数为50％～70％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥，得到无咖啡因茶多酚产品。
2.根据权利要求1所述的无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于：所述的LX-8型大孔吸附树脂柱的径高比为1:5～15。
3.根据权利要求1所述的无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于：所述的LX-8型大孔吸附树脂柱的径高比为1:10。
4.根据权利要求1所述的无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于：所述的茶汤的上样量为柱体积的51～56倍，上样流速为1BV/h。
5.根据权利要求1所述的无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于：所述的体积分数为0～5％的乙醇水溶液的用量为柱体积的28倍、流速为3BV/h。
6.根据权利要求1所述的无咖啡因茶多酚分离纯化的方法，其特征在于：所述的体积分数为50％～70％的乙醇水溶液的用量为柱体积的16倍、流速为3BV/h。
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