CN104387360A

CN104387360A - 柚皮素脂肪酸酯、其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物及其应用

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Publication number: CN104387360A
Application number: CN201410673853.1A
Authority: CN
Inventors: 段煜
Original assignee: 段煜
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: CN104387360B

Abstract

本发明公开了柚皮素脂肪酸酯，是将柚皮素5位羟基酯化得到的柚皮素-5-O-脂肪酸酯。本发明同时公开了柚皮素-5-O-脂肪酸酯的制备方法，以其为活性成分制备的药物组合物，以及在抑制ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集方面和血小板聚集引起的心血管疾病方面的应用。

Description

柚皮素脂肪酸酯、其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及柚皮素-5-O-脂肪酸酯、其制备方法、以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在抗血小板聚集方面的应用。

背景技术

柚皮素是一类天然黄酮类化合物,广泛存在于枳实、化橘红、桃叶、菝葜等天然植物中，且毒副作用低，提取分离工艺成熟简单。柚皮素是柚皮甙的甙元，属二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。

1.抗菌：对金黄色葡萄球菌、大肠、痢疾和伤寒杆菌都有较强的抗菌作用。柚皮素对真菌亦有作用，1000ppm喷于大米上能降低稻瘟菌感染40-90％，且对人和家畜没有毒性。

2.抗炎：大鼠腹腔每天注射20mg/kg，明显抑制植入羊毛球所引起的发炎过程。Galati等人通过小鼠耳片实验发现，柚皮素各剂量组均有抗炎效果，随剂量增加，抗炎效果增强。高剂量组的抑制率，以厚度差指标为30.67％，以重量差为指标则达38％左右。冯宝民等采用DNFB法诱导小鼠3相皮肤炎后，第2～8天连续口服给以柚皮素，观察即时相(IPR)、迟发相(LPR)和超迟发相(vLPR)的抑制率。柚皮素对IPR、vLPR的耳缘浮肿产生有效的抑制，在抗炎方面具有一定的开发价值。

3.清除自由基及抗氧化作用：DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的自由基，借其517nm吸光衰减度可评价清除自由基的能力。Kroyer通过实验对柚皮素的抗氧化作用进行了研究，证实柚皮素具有抗氧化作用。张海德等人实验采用比色法测定LDL发生脂质过氧化的过程，测定了抑制LDL氧化修饰的能力。并阐述了柚皮素主要是通过4位羰基螯合Cu²⁺，或者提供质子与自由基中和，或者通过自身氧化而对LDL的脂质过氧化起保护作用。张海德等人采用 DPPH法发现柚皮素具有良好的清除自由基作用，清除自由基的作用可能是通过柚皮素自身供氢氧化实现的。彭述辉等人采用光照核黄素(IR)—氯化硝基四氮唑兰(NBT)—分光光度法实验模型,证明柚皮素对活性氧O^2-有明显的清除作用，清除效果强于阳性对照抗坏血酸。动物实验结果表明，柚皮素对小鼠脑、心、肝组织的脂质过氧化有较强的抑制作用，可明显增强小鼠全血的超氧化歧化酶(SOD)活性。

4.降血脂作用：张海德等人通过动物实验检测灌药后小白鼠静脉的血清胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)等项目，实验结果表明，在一定的剂量下，柚皮素能使血清TC、TG、LDL-C显著下降，并相对提高血清HDL-C，说明柚皮素对小白鼠具有降血脂的作用。

5.抗肿瘤作用：柚皮素具有调节机体免疫功能和抑制肿瘤生长的作用，对大鼠白血病L1210和肉瘤均有活性。实验表明小鼠经口服柚皮素后胸腺/体重比值增加，说明柚皮素能增强机体的免疫功能。柚皮素能调节机体T淋巴细胞水平，修复由于肿瘤或者放疗、化疗引起的继发性免疫缺陷，增强杀伤癌细胞的作用。据报道，实验证实柚皮素能增加腹水癌荷瘤小鼠的胸腺重量，提示它能增强机体的免疫功能，调动本身内在的抗癌能力。经动物移植性肿瘤试验发现柚皮提取液对S180肉瘤具有抑制作用，抑瘤率为29.7％。

6.解痉和利胆：为黄酮类化合物中具有较强作用者。柚皮素并有较强的增加实验动物胆汁分泌的作用。

7.止咳祛痰作用：利用苯酚红作为祛痰效果指示剂，实验说明柚皮素具有较强的止咳祛痰作用。

目前，对于柚皮素及其衍生物的研究也多集中于心脑系统疾病、肿瘤、呼吸系统方面的应用。

例如，申请号为200610023756.3的中国专利公开了柚皮素及其衍生物在制备抗心脑系统疾病方面的新用途，其公开了“单体柚皮素、柚皮苷、柚皮素-7-O-β-芸香糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-鼠李糖苷、橙皮素、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-鼠李糖苷、异樱花素、樱花素、枸桔苷、异樱花素-7-O-β-芸香糖苷、异樱花素-7-O-葡萄糖苷、异樱花素-7-O-鼠李糖苷、圣草酚、圣草枸橼苷、新圣草枸橼苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷或圣草酚-7-O-鼠李糖苷中的一种或多种”在抗心脑系统疾病方面的用途。

申请号为201210537184.6的中国专利，公开了一类新颖柚皮素衍生制备及抗肿瘤应用。

申请号为201210557413.0的中国专利，公开一种6,8位取代柚皮素衍生物，同时公开了该衍生物在改善呼吸系统功能方面的应用。

但是，迄今为止，未发现将柚皮素5位羟基酯化的文献，更没有将酯化后的产物柚皮素-5-O-脂肪酸酯应用于血小板聚集的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是公开了柚皮素脂肪酸酯、其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物及其应用，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

柚皮素脂肪酸酯，为如通式(Ⅰ)的化合物：

其中，R表示C1～C4烷基中的一种。

也就是说，本发明所指的柚皮素脂肪酸酯是指将柚皮素5位羟基酯化后得到的化合物，以下称之为“柚皮素-5-O-脂肪酸酯”。

作为一种优化的选择，所述R为甲基、乙基、正丙基、正丁基中的一种。

作为一种进一步优选的选择，所述R为甲基、乙基中的一种。

也就是说，本发明所指的柚皮素-5-O-脂肪酸酯，优选为柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-5-O-正戊酸酯中的一种，更进一步优选为柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯中的一种。

结构式分别如下所示：

本发明同时提供了柚皮素-5-O-脂肪酸酯的制备方法，详述如下。

柚皮素-5-O-脂肪酸酯的合成路线如下：

柚皮素-5-O-脂肪酸酯的合成方法，包括如下步骤：

S1、以柚皮素为起始原料，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与溴化苄反应得到相应的7,4’-O,O-二苄基柚皮素(Ⅱ)；

该步骤中，所述有机溶剂包括乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲基叔丁基醚中的一种或几种，所述碱性试剂包括三乙胺、吡啶、Na₂CO₃、K₂CO₃中的一种；

S2、所述的7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与酸酐或酰氯反应得到相应的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(Ⅲ)；

S3、所述的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在有机溶剂中，在吸附在吸附剂上的过渡金属系催化剂的催化作用下，加氢还原得到相应的柚皮素脂肪酸酯，即本发明所指的柚皮素-5-O-脂肪酸酯(Ⅰ)；

该步骤中，所述有机溶剂包括二氧六环、乙醇、甲醇、四氢呋喃中的一种或几种；所述过渡金属系催化剂包括钯系、钼系、镉系、铜系、镍系催化剂中的一种。

作为一种优化的技术方案，柚皮素-5-O-脂肪酸酯的合成方法，详细步骤如下：

S1、柚皮素的投料浓度为0.05～0.5mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.1～1.0mol/L；溴化苄的投料浓度为0.1～1.0mol/L；反应温度为10～100℃；反应完全后，反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S2、7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.008～0.08mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.016～0.16mol/L；酸酐或酰氯的投料浓度为0.02～0.2mol/L；反应温度为10～100℃；反应完全后，产物依次用盐酸水溶液、饱和Na₂CO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S3、5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.0008～0.008mol/L；5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素与过渡金属系催化剂的质量比为(2～20):1；在氢气氛中反应；反应温度为10～100℃；反应时间为4～10小时；过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-脂肪酸酯。

将以上步骤制备的柚皮素-5-O-脂肪酸酯粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，利用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-脂肪酸酯纯品。

上述步骤S1、S2中，反应时间均用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)，柚皮素或5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明反应完成。

作为一种更优化的技术方案，较佳制备方法的步骤如下：

S1、柚皮素的投料浓度为0.3mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.6mol/L；溴化苄的投料浓度为0.6mol/L；反应温度为40℃；反应完全(一般为4小时)后，反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S2、7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.02mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.04mol/L；酸酐或酰氯的投料浓度为0.04mol/L；反应温度为25℃；反应完全(一般为4小时)后，产物依次用盐酸水溶液、饱和Na₂CO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S3、5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.004mol/L；5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素与过渡金属系催化剂的质量比为10：1；氢气氛反应；反应温度为25℃；反应时间为6小时；过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-脂肪酸酯粗品，将粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，利用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-脂肪酸酯纯品。

以上方法中，当酸酐或酰氯采用不同种类便可以顺利制备出相应的、如之前所述的柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-5-O-正戊酸酯。

例如，当采用的酸酐为乙酸酐时，则可以顺利制备出相应的柚皮素-5-O-乙酸酯，当采用的酰氯为丙酰氯时，则可以顺利制备出相应的柚皮素-5-O-丙酸酯，当采用的酰氯为正丁酰氯时，则可以顺利制备出相应的柚皮素-5-O-正丁酸酯，而当采用的酰氯为正戊酰氯时，则可以顺利制备出相应的柚皮素-5-O-正戊酸酯。

除了以上四种，发明人同时制备出其他多种柚皮素-5-O-脂肪酸酯，但是在研究中发现，本发明提及的四种柚皮素-5-O-脂肪酸酯(即：柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-5-O-正戊酸酯)能够对ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集有比较好的抑制作用。尤其是柚皮素-5-O-乙酸酯和柚皮素-5-O-丙酸酯，在试验中表现出的抗血小板聚集活性明显高于柚皮素。

柚皮素是一种成熟的药剂成分，目前并未有任何报道显示单一服用柚皮素能引起副作用，而本发明提供的柚皮素-5-O-脂肪酸酯是通过结构修饰对柚皮素的5位羟基进行酯化，引入脂肪酰基，改变分子构型和分子间的排列，溶剂容易进入分子间隙，从而改善溶解性，同时保留活性基团(4’位羟基和7位羟基)，从而改善了成药性，提高药效，因此可以认为本发明提供的柚皮素-5-O-脂肪酸酯在单一服用时，不会导致受用体产生副作用。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述通式(Ⅰ)的化合物柚皮素脂肪酸酯为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明所提供的化合物和药物组合物能够在抑制ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集方面得以应用，而对于血小板聚集引起的心血管疾病也具有很好的应用价值。

如上所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶等，湿润剂如甘油等，崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠等，吸收促进剂如季铵化合物，表面活性剂如十六烷醇等。另外，还可以在组合物中加入其他辅剂，如香味剂、甜味剂等。

本发明提供的药物组合物可以按照医药领域的常规方法制成注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物，从而可以采用相应的给药手段施用于需要这种治疗的患者。

而本发明化合物的施用量可以根据用药途径、患者的年龄、体重、严重程度等变化进行合理的调整。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明的三步合成柚皮素-5-O-脂肪酸酯的方法具有酯化选择性高、产率高、操作简便、后处理简单，便于工业化生产的优势。

合成的柚皮素-5-O-脂肪酸酯具有较好的抗血小板聚集活性，对ADP、AA、胶原诱导的血小板聚集都有明显的抑制作用，尤其是柚皮素-5-O-乙酸酯和柚皮素-5-O-丙酸酯抗血小板聚集活性均明显高于柚皮素。

而且本发明提供的柚皮素-5-O-脂肪酸酯是通过结构修饰对柚皮素的5位羟基进行酯化，引入脂肪酰基，改变分子构型和分子间的排列，溶剂容易进入分子间隙，改善溶解性，同时保留活性基团(4’位羟基和7位羟基)，克服了传统柚皮素药物溶解性差，成药性差，生物利用度低的缺陷，从而改善了成药性，提高药效，有望进一步开发为治疗血小板聚集、以及因血小板聚集引起的心血管疾病的药物。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

以下制备实施例均采用如下合成路线：

且大概步骤均如下：

S1、以柚皮素为起始原料，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与溴化苄反应得到相应的7,4’-O,O-二苄基柚皮素(Ⅱ)；该步骤中，所述有机溶剂包括乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲基叔丁基醚中的一种或几种，所述碱性试剂包括三乙胺、吡啶、Na₂CO₃、K₂CO₃中的一种；

S2、所述的7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与酸酐或酰氯反应得到相应的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(Ⅲ)；该步骤中，所述有机溶剂包括包括乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲基叔丁基醚中的一种或几种，所述碱性试剂包括三乙胺、吡啶、Na₂CO₃、K₂CO₃中的一种；

S3、所述的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在有机溶剂中，在吸附在吸附剂上的过渡金属系催化剂的催化作用下，加氢还原得到相应的柚皮素脂肪酸酯，即本发明所指的柚皮素-5-O-脂肪酸酯(Ⅰ)；该步骤中，所述有机溶剂包括二氧六环、乙醇、甲醇、四氢呋喃中的一种或几种；所述过渡金属系催化剂包括钯系、钼系、镉系、铜系、镍系催化剂中的一种。

以下为详细的制备实施例。

实施例1

柚皮素-5-O-乙酸酯的合成

(1)7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

柚皮素(0.01mol，2.72g)在氮气保护下以0.3mol/L的浓度溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，以0.6mol/L的浓度加入K₂CO₃(0.02mol，2.76g)，室温25℃搅拌1小时，然后搅拌下以0.6mol/L的浓度缓慢滴加溴化苄(0.02mol，2.40mL)，滴加完毕后，升温至40℃搅拌反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应4小时后，柚皮素斑点消失，苄基化反应完全。反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸水溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素(4.17g，92.29％)。

(2)5-O-乙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.008mol，3.62g)以0.02mol/L的浓度溶于无水甲基叔丁基醚中，以0.04mol/L的浓度加入三乙胺(0.016mol，2.23mL)，冰浴下以0.04mol/L的浓度缓慢滴加乙酸酐(0.016mol，1.50mL)，滴加完毕后室温25℃反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应4小时后7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明酰化反应完全。产物依次用盐酸水溶液、饱和NaCO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-乙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(3.62g，91.43％)。

(3)柚皮素-5-O-乙酸酯的合成

5-O-乙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.005mol，2.47g)以0.004mol/L的浓度溶于二氧六环/乙醇(体积比1：1)中，以质量比为10：1加入钯碳催化剂(0.247g)，氢气氛室温(25℃)反应6小时，过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-乙酸酯。粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-乙酸酯纯品(1.43g，91.22％)。

熔点184-186℃。

ESI-MS：315.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：7.21(1H,d),7.12(1H,dd),6.91(2H,d),6.35(1H,s),6.28(1H,s),5.66(1H,t)，3.22(2H,bt),2.17(3H,s)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，600MHz)：δ:196.9(C-4),169.0(C＝O，乙酰基),163.9(C-7),158.7(C-9),154.6(C-5),157.4(C-4'),133.3(C-1'),128.6(C-2’,C-6’),116.1(C-3’,C-5'),99.0(C-6),98.8(C-8),79.0(C-2),42.8(C-3),20.3(CH₃)。

元素分析：C65.21％，H4.26％，组成与化学式C₁₇H₁₄O₆一致。

实施例2

柚皮素-5-O-丙酸酯的合成

(1)7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

柚皮素(0.01mol，2.72g)在氮气保护下以0.05mol/L的浓度溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，以0.1mol/L的浓度加入K₂CO₃(0.02mol，2.76g)，室温25℃搅拌1小时，然后搅拌下以0.1mol/L的浓度缓慢滴加溴化苄(0.02 mol，2.40mL)，滴加完毕后，升温至100℃搅拌反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应6小时后，柚皮素斑点消失，苄基化反应完全。反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸水溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素(1.91g，42.21％)。

(2)5-O-丙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.008mol，3.62g)以0.008mol/L的浓度溶于无水甲基叔丁基醚中，以0.016mol/L的浓度加入三乙胺(0.016mol，2.23mL)，冰浴下以0.016mol/L的浓度缓慢滴加丙酰氯(0.016mol，1.40mL)，滴加完毕后55℃反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应6小时后7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明酰化反应完全。产物依次用盐酸水溶液、饱和NaCO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-丙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(2.06g，50.57％)。

(3)柚皮素-5-O-丙酸酯的合成

5-O-丙酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.005mol，2.54g)以0.0008mol/L的浓度溶于二氧六环/乙醇(体积比1：1)中，以质量比为20:1加钯碳催化剂(0.127g)，氢气氛室温25℃反应10小时，过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-丙酸酯。粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-丙酸酯纯品(1.20g，73.22％)。

熔点172-174℃。

ESI-MS：329.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：1.09(t,3H),2.27(d,2H),3.38(bt,2H),5.51(t,1H),6.13(s,1H),6.18(s,1H),6.66(d,2H),7.02(d,2H)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：192.9(C-4),169.2(C＝O，乙酰基),162.3(C-7),156.9(C-9),154.8(C-4’),151.1(C-5),130.3(C-1’)126.1(C-2',C-6'),114.5(C-3’，C-5’),96.5(C-8),76.4(C-2),40.4(C-3),22.4(CH₂),8.7(CH₃)。

元素分析：C66.75％，H4.52％，组成与化学式C₁₈H₁₆O₆一致。

实施例3

柚皮素-5-O-正丁酸酯的合成

(1)7,4’-O-二苄基柚皮素的合成

柚皮素(0.01mol，2.72g)在氮气保护下以0.5mol/L的浓度溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，以1.0mol/L的浓度加入K₂CO₃(0.02mol，2.76g)，室温25℃搅拌1小时，然后搅拌下以1.0mol/L的浓度缓慢滴加溴化苄(0.02mol，2.40mL)，滴加完毕后，于10℃搅拌反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应5小时后，柚皮素斑点消失，苄基化反应完全。反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸水溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素(3.06g，67.58％)。

(2)5-O-正丁酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.008mol，3.62g)以0.08mol/L的浓度溶于无水甲基叔丁基醚中，以0.16mol/L的浓度加入三乙胺(0.016mol，2.23mL)，冰浴下以0.16mol/L的浓度缓慢滴加正丁酰氯(0.016mol，1.40mL)，滴加完毕后40℃反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应3小时后7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明酰化反应完全。产物依次用盐酸水溶液、饱和NaCO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-正丁酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(3.03g，72.48％)。

(3)柚皮素-5-O-正丁酸酯的合成

5-O-正丁酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.005mol，2.61g)以0.008mol/L的浓度溶于二氧六环/乙醇(体积比1：1)中，以质量比为2:1加钯碳催化剂(1.31g)，氢气氛室温25℃反应4小时，过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-正丁酸酯。粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-正丁酸酯纯品(1.46g，85.13％)。

熔点164-166℃。

ESI-MS：343.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：0.87(t,3H),1.51(m,2H),2.12(t,2H), 3.21(bt,2H),5.42(t,1H),6.09(s,1H),6.12(s,1H),6.43(d,2H),6.92(d,2H)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：187.7(C-4),167.5(C＝O，乙酰基),160.4(C-7),153.7(C-9),151.7(C-4’),147.8(C-5),126.6(C-1’)122.8(C-2',C-6'),108.5(C-3’，C-5’),94.1(C-8),72.8(C-2),38.7(C-3),35.7(CH₂),18.4(CH₂),13.5(CH₃)。

元素分析：C67.75％，H4.90％，组成与化学式C₁₉H₁₈O₆一致。

实施例4

柚皮素-5-O-正戊酸酯的合成

(1)7,4’-O-二苄基柚皮素的合成

柚皮素(0.01mol，2.72g)在氮气保护下以0.15mol/L的浓度溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，以0.3mol/L的浓度加入K₂CO₃(0.02mol，2.76g)，室温25℃搅拌1小时，然后搅拌下以0.3mol/L的浓度缓慢滴加溴化苄(0.02mol，2.40mL)，滴加完毕后，于65℃搅拌反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应6.5小时后，柚皮素斑点消失，苄基化反应完全。反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸水溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素(2.29g，50.73％)。

(2)5-O-正戊酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的合成

7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.008mol，3.62g)以0.08mol/L的浓度溶于无水甲基叔丁基醚中，以0.16mol/L的浓度加入三乙胺(0.016mol，2.23mL)，冰浴下以0.16mol/L的浓度缓慢滴加正戊酰氯(0.016mol，2.00mL)，滴加完毕后35℃反应。用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)。反应2.5小时后7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明酰化反应完全。产物依次用盐酸水溶液、饱和NaCO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-正戊酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(2.76g，64.31％)。

(3)柚皮素-5-O-正戊酸酯的合成

5-O-正戊酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素(0.005mol，2.68g)以0.001mol/L 的浓度溶于二氧六环/乙醇(体积比1：1)中，以质量比为15:1加钯碳催化剂(0.179g)，氢气氛室温25℃反应8小时，过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素-5-O-正戊酸酯。粗品干法上样于聚酰胺色谱柱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得柚皮素-5-O-正戊酸酯纯品(0.92g，51.67％)。

熔点151-153℃。

ESI-MS：357.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：0.96(bt,3H),1.47(m,2H),2.31(bt,2H),5.21(t,1H),6.14(s,1H),6.24(s,1H),6.51(d,2H),7.03(d,2H)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δ：189.8(C-4),172.6(C＝O，乙酰基),162.6(C-7),158.6(C-9),152.9(C-4’),150.2(C-5),128.6(C-1’)124.6(C-2',C-6'),110.4(C-3’，C-5’),96.7(C-8),74.9(C-2),40.2(C-3),38.8(CH₂),21.7(CH₂),18.5(CH₃)。

元素分析：C68.12％，H5.23％，组成与化学式C₂₀H₂₀O₆一致。

由于本发明提供的药物组合物均可以采用常规的药剂学方法制备成所需的各种剂型，在此仅仅以片剂制备为例简单描述。

柚皮素-5-O-乙酸酯 10mg

乳糖 150mg

玉米淀粉 50mg

硬脂酸镁 5mg

将以上原料压制成片剂。

效果实施例1

柚皮素-5-O-脂肪酸酯体外抗血小板聚集试验

1实验目的：测定柚皮素-5-O-脂肪酸酯体外对ADP、AA、胶原诱导的新西兰兔血小板聚集的抑制率和IC₅₀。

2实验材料

2.1实验动物：新西兰兔，普通级，雌雄兼用，山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，许可证号：SCXK鲁20080001，室温饲养，自由进食。

2.2受试样品：柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-5-O-正戊酸酯、柚皮素、阿司匹林分别溶于二甲基亚砜(DMSO) 中，各配成5个浓度梯度的溶液。

2.3其它试剂：戊巴比妥，北京普博斯生物科技有限公司。ADP、AA、胶原，阿司匹林，Sigma试剂公司。

2.4实验仪器：普利生LBY-NJ4A血小板聚集仪，北京普利生仪器有限公司。

3实验方法

实验前12小时禁食。戊巴比妥耳源静脉注射麻醉，颈总动脉取血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(体积比9：1)。离心分离富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整PRP浓度为5×10⁸cell/mL。

实验设为空白组、阳性对照组(阿司匹林组)、柚皮素-5-O-乙酸酯组、柚皮素-5-O-丙酸酯组、柚皮素-5-O-正丁酸酯组、柚皮素-5-O-正戊酸酯组、柚皮素组。

空白组的测定：血小板聚集仪以PPP调零，PRP中加入一定量DMSO(DMSO终浓度小于1％以消除DMSO对实验结果的干扰)，于37℃温育5分钟，加入一定量的聚集诱导剂(ADP或AA或胶原)溶液，磁子搅拌下记录5min内血小板最大聚集率。

药物组(阿司匹林组、柚皮素-5-O-乙酸酯组、柚皮素-5-O-丙酸酯组、柚皮素-5-O-正丁酸酯组、柚皮素-5-O-正戊酸酯组、柚皮素组)的测定：血小板聚集仪以PPP调零，PRP中加入一定量配制好的药液(药物的5个梯度终浓度控制在300～20μmol/L，并保证DMSO终浓度小于1％以消除DMSO对实验结果的干扰)，于37℃温育5分钟，一定量的聚集诱导剂(ADP或AA或胶原)溶液，磁子搅拌下记录5min内血小板最大聚集率。

结果计算：聚集抑制率(％)＝[(1－药物组聚集率/空白组聚集率)]×100

计算血小板聚集抑制率为50％时的药物浓度(半数药物浓度IC₅₀)。

4实验结果

表1柚皮素-5-O-脂肪酸酯、柚皮素体外对ADP、AA和胶原诱导的兔血小板聚集的影响

n＝6，x±s,*P＜0.01，与空白比较。

空白组聚集率(％)：ADP为40.3±3.3；AA为68.4±3.5；胶原为54.2±3.2。

由表1可见，柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-3-O-正戊酸酯在各剂量均对ADP、AA和胶原诱导的兔血小板聚集有抑制作用，且呈浓度依赖性关系。

表2柚皮素-5-O-脂肪酸酯、柚皮素、阿司匹林体外抑制ADP、AA和胶原诱导的兔血小板聚集的IC₅₀

由表2可见，柚皮素-5-O-乙酸酯的IC₅₀活性最小，其次为柚皮素-5-O-丙酸酯，说明这两种柚皮素衍生物的体外抗血小板聚集活性均高于柚皮素。柚皮素-5-O-正丁酸酯和柚皮素-5-O-正戊酸酯的IC₅₀均大于柚皮素，其活性低于柚皮素。

结论：柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-5-O-正戊酸酯均有体外抗血小板聚集的作用，其中柚皮素-5-O-乙酸酯和柚皮素-5-O-丙酸酯体外抗血小板聚集的作用优于柚皮素。

效果实施例2柚皮素-5-O-脂肪酸酯体内抗血小板聚集试验

1实验目的：测定柚皮素-5-O-脂肪酸酯体内对ADP、AA和胶原诱导的Wistar大鼠血小板聚集的抑制率。

2实验材料

2.1实验动物：Wistar大鼠，SPF级，重量为250-300g，雄性，山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，许可证号：SCXK鲁20080002，室温饲养，自由进食与饮水。

2.2受试样品：柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-3-O-正戊酸酯、柚皮素、阿司匹林分别溶于生理盐水中，加丙二醇助溶得到一定浓度的溶液。

3实验方法

Wistar大鼠随机分为7组，每组8只，实验前12小时禁食。

实验设为空白组、阳性对照组(阿司匹林组)、柚皮素-5-O-乙酸酯组、柚皮素-5-O-丙酸酯组、柚皮素-5-O-正丁酸酯组、柚皮素-5-O-正戊酸酯组、柚皮素组。空白组：尾静脉注射生理盐水(含与柚皮素-5-O-脂肪酸酯溶液相同浓度的丙二醇)。药物组：尾静脉注射柚皮素-5-O-脂肪酸酯或柚皮素或阿司匹林，给药量10mg/kg。

给药0.5h后，戊巴比妥腹腔注射麻醉，心脏取血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(体积比9：1)。离心分离富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整PRP浓度为5×10⁸cell/mL。

聚集率测定按照效果实施例1方法进行。

4实验结果

表3柚皮素-5-O-脂肪酸酯、柚皮素、阿司匹林体内对ADP、AA和胶原诱导的大鼠血小板聚集的影响

n＝6，x±s,*P＜0.01，与空白组比较。

空白组聚集率(％)：ADP为45.7±7.2；AA为59.2±4.4；胶原为50.2±4.4。

数据表明，柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-3-O-正戊酸酯均在给药0.5h后即明显抑制ADP、AA和胶原诱导的大鼠血小板聚集。其中柚皮素-5-O-乙酸酯的抑聚率最高，其次为柚皮素-5-O-丙酸酯，均大于柚皮素的抑聚率。而柚皮素-5-O-正丁酸酯及柚皮素-3-O-正戊酸酯的抑聚率均小于柚皮素。

结论：柚皮素-5-O-乙酸酯、柚皮素-5-O-丙酸酯、柚皮素-5-O-正丁酸酯、柚皮素-3-O-正戊酸酯均具有体内抑制血小板聚集的作用，其中柚皮素-5-O-乙酸酯和柚皮素-5-O-丙酸酯的作用大于柚皮素。

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。

Claims

1.柚皮素脂肪酸酯，其特征在于：为如通式(Ⅰ)的化合物：

其中，R表示C1～C4烷基中的一种。

2.如权利要求1所述的柚皮素脂肪酸酯，其特征在于：所述R为甲基、乙基、正丙基、正丁基中的一种。

3.如权利要求2所述的柚皮素脂肪酸酯，其特征在于：所述R为甲基、乙基中的一种。

4.制备如权利要求1所述化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、以柚皮素为起始原料，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与溴化苄反应得到相应的7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S2、所述的7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在无水有机溶剂中，以碱性试剂作为催化剂，与酸酐或酰氯反应得到相应的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S3、所述的5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素，在有机溶剂中，在吸附在吸附剂上的过渡金属系催化剂的催化作用下，加氢还原得到相应的柚皮素脂肪酸酯；

5.如权利要求4所述制备方法，其特征在于：步骤如下：

S3、5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.0008～0.008mol/L；5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素与过渡金属系催化剂的质量比为(2～20):1；在氢气氛中反应；反应温度为10～100℃；反应时间为4～10小时；过滤得滤液，真空脱溶剂得柚皮素脂肪酸酯。

6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于：步骤S1、S2中，反应时间均用GF254硅胶薄层层析板监测反应进程，展开剂：乙酸乙酯/丙酮/冰乙酸(6：6：1.5)，柚皮素或5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素斑点消失，说明反应完全。

7.如权利要求5所述制备方法，其特征在于：步骤S3得到的柚皮素脂肪酸酯为粗品，将其干法上样于聚酰胺色谱柱，利用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得纯品。

8.如权利要求5所述制备方法，其特征在于：步骤如下：

S1、柚皮素的投料浓度为0.3mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.6mol/L；溴化苄的投料浓度为0.6mol/L；反应温度为40℃；反应4小时后，反应液倒入冰水中，用10wt％乙酸溶液调pH＝6，过滤，用水洗涤滤饼直至中性，得到7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

S2、7,4’-O,O-二苄基柚皮素的投料浓度为0.02mol/L；碱性催化剂的投料浓度为0.04mol/L；酸酐或酰氯的投料浓度为0.04mol/L；反应温度为25℃；反应4小时后，产物依次用盐酸水溶液、饱和Na₂CO₃水溶液和纯净水洗涤，收集有机层，真空脱溶剂，得到5-O-脂肪酰基-7,4’-O,O-二苄基柚皮素；

9.用于抑制ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集以及治疗由血小板聚集引起的心血管疾病的药物组合物，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

10.如权利要求1-3任一项所述的化合物在制备抑制ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集以及治疗由血小板聚集引起的心血管疾病药物中的应用。