CN104382920A

CN104382920A - 人参皂苷Rf的新应用

Info

Publication number: CN104382920A
Application number: CN201410709529.0A
Authority: CN
Inventors: 张文生; 刘晓丽; 王胜兰; 辛文锋
Original assignee: Beijing Normal University; Beijing Normal University Science Park Technology Development Co Ltd
Current assignee: Beijing Normal University; Beijing Normal University Science Park Technology Development Co Ltd
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明涉及医药领域，具体的说是涉及人参皂苷Rf的新应用，尤其是作为TRPV1的拮抗剂的应用。本发明所述人参皂苷Rf在细胞水平上，能够显著的抑制TRPV1蛋白表达，且在动物水平上，人参皂苷Rf能够显著的延长辣椒素(capsaicin，CAP)诱导的大鼠的缩爪潜伏期，降低大鼠的痛觉敏感程度。表明人参皂苷Rf可以作为TRPV1的拮抗剂用于以TRPV1为靶点的镇痛，可用于制备治疗与TRPV1受体相关的疾病的镇痛药物。

Description

人参皂苷Rf的新应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的说是涉及人参皂苷Rf的新应用，尤其是其作为TRPV1拮抗剂的应用。

背景技术

1994年，国际疼痛研究协会(International Association for the Study Pain，IASP)将疼痛定义为“一种与组织损伤或潜在的与损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验”，与临床上包括糖尿病、关节炎、癌症以及手术后的多种疼痛过程密切相关。疼痛医学逐渐成为目前医学界最为活跃的领域。据2005年中国镇痛周(10月11日-17日)公布的一组数据显示：我国至少有1亿的病人正在忍受疼痛的折磨，疼痛不仅能够严重的影响人们的身心健康外，还会造成病人家属经济上的极大负担。据调查显示，在英国因疼痛所致生产时间流失的量为4.6小时/周；而在美国，因疼痛导致生产时间流失而造成的经济损失高达612亿美元/年。鉴于疼痛给人类和社会所造成的各项损失，目前，国际上已经将疼痛定义为继呼吸、脉搏、体温、血压四大生命体征之后的第五大生命体征。因此，作为“人类第五大生命体征”之一的疼痛问题，因其普遍性和多发性已成为一个全球共同关注的话题。

目前，疼痛的治疗药物主要是以阿片类和非甾体抗炎类(Non-SteroidalAnti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)为主，代表药物分别为吗啡和阿司匹林，前者具有成瘾性，后者可引起机体严重的胃肠道反应，并且对神经伤害性疼痛的疗效欠佳，因此研究和解决慢性难治性疼痛的发病机理和治疗方案，寻找毒副作用小、成瘾性低的药物是21世纪医药学上的一个重要课题。

当机体受到外界伤害性刺激的时候，最先感知这些刺激的部位是伤害性感受器(nociptor)。伤害性感受器是一些位于初级感觉神经元上的离子通道，他们对某些强烈的、可引起机体损伤的外界刺激具有特异的感知功能，这些刺激包括机械刺激、温度刺激以及某些化学物质的刺激。这些离子通道又称为传感器，可感知和量化有害刺激，并将这些刺激以机体自身产生内向电流的形式发送信息。这一信息从初级感觉神经元传递到高级神经中枢，促使机体做出相应的反应。

瞬时感受器电位离子通道蛋白(Transient receptor potential ion channelprotein，TRPs)是近年来发现的存在于胞内细胞器膜上或细胞膜上的一类非选择性阳离子通道蛋白。作为果蝇的光感受器异常变异株基因—TRP基因于1989年被Montell等人首先用于描述在黑腹果蝇上。随后，Hardie等人发现，trp基因能够编码一种通透Ca²⁺的阳离子通道，并将这种通道命名为TRP通道。目前，TRP通道家族是治疗疼痛，焦虑，瘙痒，肠道及呼吸道病变的重要蛋白。并且，有研究表明TRP家族还是天然的相关病变治疗药物的传递器，它们均可高选择性针对靶细胞。因此，它的发现对于人们认识和了解感官知觉具有突破性意义。

TRP家族是感受体系中的门控分子，是外部环境与内部神经系统之间的中介，其可将机械性刺激、热刺激、化学刺激转换为内向电流，以信息的形式传递给机体的中枢神经系统。目前，TRP家族分为7个亚族，根据其序列同源性分为两大类，分别是跨膜结构域具有序列同源性的TRPs类，其中包括TRPV(vanilloid)、TRPA(ANKTM1)、TRPM(melastatin，long-TRP)、TRPN(NOMPC)和TRPC(canonical TRP)，他们不仅具有序列同源性还在第6个跨膜域均含有一个C短23-25氨基酸的“TRPs结构域”；和与第一类TRPs有较少的序列同源性并且在其第1和第2跨膜域之间存在一个胞外环的TRPML(mucolipin)、TRPP(polycystin)。机体就是通过这些感受器全面的感知外界环境对机体所造成的各种伤害性刺激，发出预警，使机体做出相关反应。

1997年Caterina及其同事成功克隆了一种能被辣椒素(capsaicin)激活的受体，即香草酸瞬时受体亚型1(Transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1，TRPV1)。TRPV1是最初发现的对伤害性热敏感的疼痛靶点，也是目前研究较多的一种非选择性阳离子通道。它属于香草酸受体(transient receptor potential，TRP)家族，该通道在介导神经性痛、深部组织痛、炎性痛、术后痛等多种疼痛中均起到重要的作用。它可被多种化学物理刺激兴奋，其中包括辣椒素(capsaicin)、热刺激(≥43℃)、酸和多种天然成分。TRPV1的成功克隆开启了研究疼痛的新时代。在此之后，研究者们又相继发现了多个能够感知外界伤害性刺激，并参与其所引起的疼痛发生和发展的受体通道。

TRPV1是一种配体门控的非选择性阳离子通道，当其与配体结合后离子通道开放，Ca²⁺、Na⁺等阳离子从胞外进入胞内，尤其是对Ca²⁺的通透性较大，进而会引发机体的一系列生物学反应。该受体编码蛋白由838个氨基酸组成，是一个四聚体膜蛋白伴有四个相同或不同的亚单位，每个亚单位都含有TRP家族所共有的6个跨膜结构域，在第5个和第6个跨膜区域之间有1个短的孔环样的疏水结构，此结构参与并调控了辣椒素激活TRPV1引起钙离子内流的过程，而与氢离子和温度的关系不大，在疏水端富含氨基酸的区域可参与PH相关的刺激。TRPV1的C端和N端也均在胞内，N端有3个锚蛋白结构域，该区域介导溶质蛋白间的相互作用并将共同片段暴露给蛋白激酶。而C端携带磷酸肌醇、钙调蛋白(CAM)结合域以及磷酸化位点。TRPV1受二磷酸磷脂酰基醇(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)调节的影响，PIP2既可以参与TRPV1的脱敏环节，又是炎性因子增敏TRPV1途径中不可或缺的重要环节。

TRPV1广泛的分布在伤害性感受器(nociceptor)上，它参与急性炎症痛敏的形成。疼痛形成的大致过程是：首先是伤害感受器的痛觉传感(transduction)，其次是一级传入纤维、脊髓背角、脊髓-丘脑束等上行束的痛觉传递(transmission)，再次是皮层和边缘系统的痛觉整合(interpretation)，最后是下行控制和神经介质的痛觉控制(modulation)。神经生理学家曾做了单个神经纤维的传入放电试验，他们发现有相当数量的传入神经纤维在只有给予皮肤伤害性刺激的时候才会发生放电反应，说明这些发生反应的传入神经纤维外周末端所形成的感受器是专一的痛觉感受器，并发现这些传递痛觉的神经纤维一般是较细的神经纤维，包括Aδ纤维和C纤维,Aδ纤维传导快痛，C纤维传导慢痛。

TRPV1主要介导炎性痛，神经病理性痛，机械性，化学性和温度等伤害性刺激，引起伤害性信号向中枢神经系统传递并最终产生痛觉。在TRPV1缺乏的小鼠上，由炎症介导的热痛敏会明显减少，说明其在介导炎性痛热痛觉过敏中起着重要的作用。在糖尿病神经病理性疼痛模型中，利用DNA干扰技术抑制单侧坐骨神经结扎大鼠模型的TRPV1的表达，可明显缓解模型中冷刺激诱导的疼痛，说明TRPV1在神经病理性疼痛方面也发挥着重要的作用。利用TRPV1的拮抗剂预处理，也可减轻肌肉注射TRPV1激动剂导致的急性伤害性感受和后期的机械性痛觉过敏，Christoph等人发现，TRPV1缺失的关节炎小鼠机械痛觉过敏减弱，说明TRPV1在机械痛觉过敏中起重要作用。TRPV1是治疗疼痛的重要靶点。

人参皂苷Rf，英文名为Ginsenoside Rf，又名(3β,6α,12β)-3,12,20-Trihydroxydammar-24-en-6-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量为801.01，结构式为

有研究表明人参皂苷Rf能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩，对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用，对猫的行为和脑电图显示中等抑制，同时还具有抗疲劳作用。但目前尚无文献报道人参皂苷Rf在镇痛方面的作用。

发明内容

本发明提供了人参皂苷Rf的新应用，即人参皂苷Rf作为TRPVI的拮抗剂的应用。

辣椒素(capsaicin，CAP)是最经典也是发现最早的TRPV1通道的激动剂，CAP具有矛盾的双向调节作用，小剂量时能够兴奋TRPV1，高剂量时会抑制TRPV1的表达。在一个具体实施方案中，申请人通过采用RT-PCR方法检测了mTRPV1-HEK293细胞在不同浓度CAP的刺激下TRPV1mRNA表达量的变化。结果显示CAP 8μmol/L、20μmol/L分别能显著升高TRPV1mRNA的表达。

三七具有活血化瘀、消肿定痛的功效，并也也有文献报道了三七总皂苷(PNS)具有镇痛的作用。在一个具体实施方案中，申请人采用RT-PCR方法检测了不同浓度的PNS对CAP诱导的疼痛的重要靶点TRPV1mRNA表达的影响。结果显示CAP能够显著的升高TRPV1mRNA的表达，而PNS 40μg/mL时就能够显著性的降低CAP诱导的TRPV1mRNA表达的升高。表明PNS对CAP诱导的mTRPV1-HEK293细胞TRPV1mRNA表达的具有显著的抑制作用。然而由于PNS中成分复杂，其含有多种单体活性成分，因此无法哪一种单体活性成分起作用。

进一步的，在一个具体实施方案中，申请人选择了8种PNS中含量较高的单体，分别为三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、Rd、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Re、Rf。将这8种单体分别作用于mTRPV1-HEK293细胞，采用RT-PCR法检测8种单体成分对CAP诱导的疼痛的重要靶点TRPV1mRNA表达的影响。结果显示CAP能够显著的升高TRPV1mRNA的表达(P＜0.05vs control)，三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、Rd、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Re各单体对CAP诱导的TRPV1mRNA表达的降低无显著性差异。而人参皂苷Rf虽然在1μmol/L以下时对CAP诱导的TRPV1mRNA表达的降低无显著性差异，但10μmol/L的人参皂苷Rf能够显著的降低CAP诱导的TRPV1mRNA表达。说明了人参皂苷Rf能够显著的抑制疼痛受体TRPV1蛋白的表达。

进一步，在一个具体实施方案中，申请人采用Western blot的试验方法检测人参皂苷Rf对CAP诱导的脊髓背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)神经元中的TRPV1表达的影响。结果显示，50nmol/L的CAP能够显著地升高DRG中的TRPV1的蛋白表达水平，给予人参皂苷Rf处理后，10μmol/L人参皂苷Rf能够显著的抑制辣椒素诱导的DRG神经元中TRPV1蛋白水平的表达。而单独给予人参皂苷Rf未给予辣椒素处理时，人参皂苷Rf单体对DRG神经元中TRPV1蛋白水平的表达的变化无显著性差异。表明在机体分布较多的DRG神经元上人参皂苷Rf能够显著的抑制疼痛受体TRPV1蛋白的表达。

人参皂苷Rf能够抑制疼痛受体TRPV1的蛋白表达水平，说明其可能是疼痛的良好的镇痛药物。为了进一步证明其镇痛效果，在一个具体实施方案中，申请人采用了热辐射-抬足法检测人参皂苷Rf对辣椒素大鼠疼痛缩爪潜伏期的影响。结果显示，辣椒素能够显著地降低大鼠的痛觉阈值，降低其缩爪潜伏期，而给予人参皂苷Rf能够显著地升高辣椒素诱导的痛觉阈值的降低，提高其缩爪潜伏期。表明在体内人参皂苷Rf能够显著的延长大鼠的缩爪潜伏期，降低大鼠的痛觉敏感程度。进一步说明人参皂苷Rf可以用于以TRPV1为靶点的镇痛。

因此，本发明提供了人参皂苷Rf作为TRPVI的拮抗剂的应用。

进一步的，本发明还提供了人参皂苷Rf在制备治疗与TRPVI受体相关的疾病的药物中的应用。

其中，所述与TRPVI受体相关的疾病包括伤害感受性疼痛、神经原性疼痛、癌性疼痛、头痛、膀胱功能障碍、炎症。

进一步的，所述与TRPVI受体相关的疾病包括具有炎性成分的慢性疼痛，例如类风湿性关节炎；骨和关节疼痛(骨关节炎)；手术后或创伤疼痛，包括牙疼，例如智齿拔除后牙痛、乳房切除术后疼痛和与扭伤或骨折相关的疼痛；肌肉骨骼疼痛，如纤维肌痛；肌盘膜疼痛综合征；头疼，包括偏头疼、急性或慢性紧张性头疼、丛集性头痛、颞下颌疼痛和上颌窦疼痛；耳痛；会阴切开术疼痛；烧伤和尤其是与其相关的原发性痛觉过敏；深部和内脏疼痛，如心脏痛、肌肉痛、眼痛、口面疼痛、腹痛、妇科疼痛如痛经和分娩阵痛；痔疮；与泌尿生殖道有关的疼痛如膀胱炎和vulvadynia；与神经损伤和/或影响神经系统的疾病相关的慢性疼痛，如与疱疹后神经痛、糖尿病性肾病、化疗诱导的神经病、截肢(“幻肢痛”)、神经卡压和臂丛撕脱伤、腰痛、坐骨神经痛和强直性脊柱炎、反射性交感神经营养障碍和其它慢性神经损伤相关的神经病性疼痛；复合性局部疼痛综合征；舌灼痛或口灼伤综合征；中枢神经系统疼痛，如由于脊髓或脑干损伤、多发性硬化或中风导致的疼痛；痛风；疤疲疼痛；与癌症有关的疼痛，常常称为癌症疼痛；与病毒(例如HIV)诱导的神经病、酒精和尼古丁滥用相关的疼痛；与日光灼伤或UV灼伤相关的疼痛；蛇、蜘蛛或昆虫叮咬和海蜇螯(jellyfish sting)相关的疼痛和其他症状。

对于上述疾病和病症，使用的剂量将随所用化合物、施用方式和所治疗疾病的性质和严重程度而异。

本发明所述人参皂苷Rf可体内单独或与其他药学活性剂组合施用，例如有效治疗与TRPVI受体相关的疾病和病症的化合物。因此本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的人参皂苷Rf。

本发明还提供了一种药物制剂，包括治疗有效量的人参皂苷Rf和药学上可接受的辅料。本领域技术人员可将所述人参皂苷Rf直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。

在一些实施方案中，本发明所述药物制剂为口服制剂、注射制剂或外用制剂。

其中，所述口服制剂可以为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂等；所述注射制剂可以为注射液、冻干粉针剂等；所述外用制剂可以为喷雾剂、滴剂、贴剂、软膏剂等。

本发明所述人参皂苷Rf在细胞水平上能够显著的抑制TRPV1蛋白的表达，且在动物水平上能够显著的延长CAP诱导的大鼠的缩爪潜伏期，降低大鼠的痛觉敏感程度。表明人参皂苷Rf可以作为辣椒素受体TRPVI的拮抗剂用于以TRPV1为靶点的镇痛，可用于制备治疗与TRPVI受体相关的疾病的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中不同浓度CAP诱导mTRPV1-HEK293细胞TRPV1mRNA表达图，其中a为凝胶电泳图，泳道从左到右分别为0μmol/L(即对照control)、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、20μmol/L CAP刺激；b为凝胶电泳图的EmageJ灰度分析结果图，横坐标为CAP浓度，纵坐标为TRPV1mRNA的表达水平，(N＝3，*P＜0.05vs control)；

图2示实施例1中PNS对CAP诱导的mTRPV1-HEK293细胞TRPV1mRNA表达图，其中a为凝胶电泳图，泳道从左到右分别为con(即对照control，不给予PNS，也不给予CAP)、CAP(不给予PNS，仅给予8μmol/L CAP)、40μg/mL(给予40μg/mL PNS后给予8μmol/L CAP)、80μg/mL(给予80μg/mLPNS后给予8μmol/L CAP)、100μg/mL(给予40μg/mL PNS后给予8μmol/LCAP)；b为凝胶电泳图的EmageJ灰度分析结果图，横坐标为PNS浓度，纵坐标为TRPV1mRNA的表达水平，(N＝3，**P＜0.01vs control，#P＜0.05vsCAP)；

图3示实施例1中三七各单体成分对CAP诱导的mTRPV1-HEK293细胞TRPV1mRNA表达图，其中a为凝胶电泳图，泳道从左到右分别为con(即对照control，不给予单体成分，也不给予CAP)、CAP(不给予单体成分，仅给予8μmol/L CAP)、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb₁、三七皂苷R₁、人参皂苷Re，每个单体成分分别设置三个泳道，为各单体成分处理mTRPV1-HEK293细胞的不同剂量(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)；b为凝胶电泳图a的EmageJ灰度分析结果图，横坐标为各单体成分的浓度，纵坐标为TRPV1mRNA的表达水平；c为凝胶电泳图，泳道从左到右分别为con(即对照control，不给予单体成分，也不给予CAP)、CAP(不给予单体成分，仅给予8μmol/L CAP)、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃，每个单体成分分别设置三个泳道，为各单体成分处理mTRPV1-HEK293细胞的不同剂量(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)；d为凝胶电泳图c的EmageJ灰度分析结果图，横坐标为各单体成分的浓度，纵坐标为TRPV1mRNA的表达水平；(N＝3，*P＜0.05vs control，#P＜0.05vs CAP)；

图4示实施例2中人参皂苷Rf对DRG神经元中TRPV1蛋白表达水平的影响结果图，其中a为Western blot图，泳道从左到右分别为Control组、CAP刺激Model组、人参皂苷Rf预处理后和CAP共孵育组、人参皂苷Rf处理组；b为Western blot图的EmageJ灰度分析结果图，横坐标为组别，纵坐标为TRPV1mRNA的表达水平；(N＝3，***P＜0.001vs control，##P＜0.01vs CAP)；

图5示实施例3中人参皂苷Rf对CAP诱导的疼痛行为学检测统计结果图，横坐标为组别，纵坐标为缩爪潜伏期(s)，为给药前，为给药后(N＝8，*P＜0.05vs control，#P＜0.05vs CAP)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中本发明中使用的所有原材料如无特殊说明均可以通过商业渠道购得。

实施例1三七对TRPV1影响作用研究

1.实验材料、试剂及其仪器

1.1实验材料

人胚肾细胞(HEK293)购于上海生博生物医药科技有限公司。

大肠杆菌感受态BL21，购于北京蓝弋化工产品有限责任公司。

载体质粒pcDNA3.1购于Invitrogen公司。

mTRPV1质粒购于北京诺兰信生化科技有限责任公司。

1.2实验试剂

试剂名称	公司
		Lipofectamine 2000转染试剂	Invitrogen公司
细胞培养基(Opti-MEM、DMEM-H、EBSS)	北京茂健联星科技有限公司
		胰蛋白胨(Tryptone)	北京创欣慧宇科技有限责任公司
酵母提取物(Yeast Extract)	北京创欣慧宇科技有限责任公司
		氯化钠(NaCl)	北京创欣慧宇科技有限责任公司
氨苄	北京蓝弋化工产品有限责任公司
		无水乙醇	北京蓝弋化工产品有限责任公司
琼脂糖	北京创欣慧宇科技有限责任公司

PBS磷酸盐粉剂	北京蓝弋化工产品有限责任公司
		辣椒素(capsaicin，CAP)对照品(批号：110839-201205)	中国药品食品检定研究院
三七总皂苷(PNS)对照品(批号：110870-201002)	中国药品食品检定研究院
		人参皂苷Rg₁对照品(批号：110703-201128)	中国药品食品检定研究院
人参皂苷Rb₁对照品(批号：110704-201223)	中国药品食品检定研究院
		人参皂苷Rb₂对照品(批号：111715-201203)	中国药品食品检定研究院
人参皂苷Rb₃对照品(批号：111686-201203)	中国药品食品检定研究院
		人参皂苷Rd对照品(批号：111818-201302)	中国药品食品检定研究院
人参皂苷Re对照品(批号：110754-201324)	中国药品食品检定研究院
		人参皂苷Rf对照品(批号：111719-201104)	中国药品食品检定研究院
三七皂苷R₁对照品(批号：110745-200617)	中国药品食品检定研究院
		二甲基亚砜	SIGMA
胎牛血清	北京协和细胞中心提供
		青霉素(200000U/mL)	北京茂健联星科技有限公司
链霉素(20000ng/mL)	北京茂健联星科技有限公司
		RNAperp pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒	天根生化科技有限公司
高纯度质粒小提中量试剂盒	天根生化科技有限公司
		RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis kit	北京经科宏达生物技术有限公司

1.3实验仪器

仪器名称	公司名称
		二氧化碳恒温培养箱MCO-15AC	日本SANYO
生物安全柜BHC-1300	苏州安泰空气技术有限公司
		CL32L高压灭菌器	日本ALP
医用离心机TL80-2型	中国天力医疗器械有限公司
		RT-PCR仪	MJ Research公司
低温离心机	Beekman公司
		Nano Drop 2000	美国Thermo公司
Geldoc系统凝胶成像仪	美国Bio-Rad公司
		电热恒温鼓风干燥箱	北京雅士林试验设备有限公司

微型离心机	杭州奥盛仪器有限公司
		恒温水浴锅	国华电器有限公司
气浴摇床	美国Thermo公司
		Mini-Sub cell GT水平电泳仪	美国Bio-Rad伯乐

2.实验方法

2.1HEK293细胞培养

人胚肾细胞(HEK293)用含有10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM-H的完全培养基在37℃，5％CO₂，相对湿度90％的培养箱中培养。

2.2HEK293细胞的冻存与复苏

选对数生长期HEK293细胞，PBS轻轻冲洗，以含20％胎牛血清、10％甘油的DMEM-H细胞冻存液(过滤)轻柔吹打细胞，使之混合均匀制成细胞悬液，置于细胞冻存管中，封好，并标记好细胞种类及冻存时间。放入冻存盒中-20℃8hr，然后转移到-80℃冰箱中过夜，再放入液氮长期保存。

先将水浴锅打开，调制37℃备用，从液氮中取出HEK293冻存细胞，迅速放入37℃水浴中，不停振荡使之快速融化。在细胞培养瓶中加入新鲜10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM-H完全培养液，吸出细胞冻存悬液接入细胞培养瓶，使之混匀，超净台中静置数分钟，放入37℃，5％CO₂，相对湿度90％的培养箱中培养24hr，更换完全培养基，继续培养。2.3mTRPV1-HEK293细胞的瞬时转染

2.3.1mTRPV1质粒扩增

1.从-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态BL21，冰上融化(因感受态十分脆弱，所以一定要保持冰浴)。从-20℃取出待待扩增质粒，融化。

2.取2个1.5ml EP管，放在冰上预冷。轻柔取20μl和40μl大肠杆菌感受态BL21加入各EP管中。

3.取适量体积的质粒与感受态混匀，并做好标记。

1).阴性对照：只加20μl大肠杆菌感受态BL21

2).待扩增质粒：2μl待扩增质粒+大肠杆菌感受态BL21，加完后，冰浴30min。

4.打开金属浴，42℃热激30sec，冰浴3-5min。

5.复苏：向个EP管中加入1mL LB培养基(不含抗生素氨苄)，并分别转入试管中，做好标记，37℃摇床120rpm培养1hr。

6.涂板：用复苏后的菌液原液或其稀释液涂平板。

7.37℃培养箱中过夜，平板要倒置。

2.3.2质粒的提取

1.挑取待扩增质粒转化平皿上的单克隆于2mL LB培养基中(含抗生素氨苄)置于试管中，37℃，150rpm培养到对数期。

2.将对数期质粒1:100比例转接到50mL LB培养基中(含抗生素氨苄)，37℃，150rpm培养过夜。

3.根据高纯度质粒小提中量试剂盒的方法提取：

1).在收集管中安放吸附柱CP4，然后向吸附柱CP4中加入500μl的平衡液BL，12000rpm(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CP4重新放回收集管中。(最好使用的吸附柱CP4为当天处理过的)

2).在离心管中加入5-15mL过夜培养的菌液，12000rpm(-13400×g)离心1min，尽可能的吸出上清。注意：菌液量较大时可以通过多次离心将沉淀得到的菌体收集到同一个离心管中，菌体量一定要以能够充分裂解为佳，菌体量过多会是其裂解不够充分进而使质粒的提取效率变低。

3).将已含有RNaseA的500μl溶液P1加入到留有菌体沉淀的离心管中)，然后使用移液器或涡旋振荡器使菌体沉淀彻底悬浮。注意：请务必使细菌沉淀彻底悬浮，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。

4).向离心管中加入500μl P2，轻柔的上下翻转6-8次，以便菌体能够充分裂解。注意：轻柔的混合，千万不要剧烈震荡，以免基因组DNA被污染。此时，菌液应该是变成清亮粘稠，所用的时间不药超过5min，以免破坏质粒。如果未变成清亮粘稠，可能是因为菌体过多，裂解的不充分，应使菌体量适量的减少。

5).将700μl溶液P3加入到离心管中，然后立即轻柔的上下翻转离心管6-8次，使其充分的混匀，此时离心管中会有白色絮状的沉淀出现。12000rpm(-13400×g)离心10min，此时会在离心管底部形成白色沉淀。注意：P3加入后就应立即使离心管中的液体混匀，要避免液体产生局部的沉淀。如果离心后上清液中还有微小白色沉淀悬浮，可以通过再次离心提取上清。

6).过滤住放入收集管中，将上一步骤收集的上清液分次加入到过滤住CS中，12000rpm(-13400×g)离心2min，CP4放入收集管中，然后将离心后收集管中得到的溶液小心的分次的加入到吸附柱CP4中，(如果过滤住中有残余的液体说明上一步骤吸取的上清中含有的杂质过多，可适当的延长离心时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，应尽可能的吸取上清)。

7).12000rpm(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，然后将吸附柱CP4放入收集管中。

8).吸取500μl的去蛋白液PD加入到吸附柱CP4中，12000rpm(-13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回到收集管中。

9).先检查漂洗液PW是否已加入无水乙醇，确定无水乙醇已加入后，12000rpm(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CP4放回到收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，为最佳，因其可以更好的去除杂质。

10).重复操作步骤9。

11).将吸附柱CP4重新放回到收集管中，12000rpm(-13400×g)离心2min，其目的是去除吸附柱中残余的漂洗液。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(如：酶切、PCR等)实验。为了确保下游的实验不受到残留乙醇的影响，建议打开吸附柱CP4的盖，室温放置数分钟，以便彻底的除去吸附残料中残留的漂洗液。

12).将吸附柱CP4放入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加入100-300μl洗脱缓冲液TB，一般以100μl为宜，少于100μl会影响质粒的回收率。室温放置2min，12000rpm(-13400×g)离心1min后将质粒溶液收集到离心管中。

13).测所得质粒浓度，并做好相应标记，贮存备用。

2.3.3TRPV1-HEK239细胞的瞬时转染

1.细胞准备：以2.5×106/mL的密度将HEK293细胞接种于6孔板中，每孔接种2ml细胞。37℃，5％CO₂条件下培养48h(此时，细胞覆盖率应达到90％左右)(注意：转染前一天换成无PS但含FBS的培养基)。

2.用Opti-MEM培养基将脂质体Lipofectamine 2000稀释成合适的浓度(其中，二者质量比为：Lipofectamine 2000：Opti-MEM＝1：25)，混匀，室温静置5min，<25min。

3.用Opti-MEM培养基将pcDNA3.1和mTRPV1质粒稀释成合适的浓度(其中，各组分质量比为：pcDNA3.1:Lipofectamine 2000＝1:3，mTRPV1：Lipofectamine 2000＝1:3)，混匀。

4.将Lipo-2000稀释液分别与Opti-MEM、pcDNA3.1和mTRPV1的稀释液1：1混匀，室温静置20min。

5.室温静置期间，将细胞从培养箱中取出，将培养基换成Opti-MEM，将步骤4的混合物分别加入相应各孔中，放回培养箱中。

6.4hr后，将培养基更换成无双抗的EBSS常规培养基。

7.此后每4hr，更换一次培养基，至24hr，备用。

2.4不同药物的细胞药物处理(CAP、PNS、各单体)

辣椒素(capsaicin，CAP)溶于DMSO，至10mM，用时稀释。三七总皂苷(PNS)溶于milipore超纯水配成1mg/mL，用时稀释。人参皂苷Rg₁溶于milipore超纯水，至1mM，用时稀释。人参皂苷Rb₁溶于milipore超纯水，至1mM，用时稀释。人参皂苷Re溶于DMSO，至10mM，用时稀释。人参皂苷Rd溶于DMSO，至10mM，用时稀释。人参皂苷Rf溶于DMSO，至10mM，用时稀释。人参皂苷Rb₂溶于DMSO，至10mM，用时稀释。人参皂苷Rb₃溶于DMSO，至10mM，用时稀释。三七皂苷R₁溶于DMSO，至10mM，用时稀释。

2.5细胞总RNA的提取

2.5.1HEK293细胞总RNA提取

1.确定细胞数量，彻底吸出细胞培养基上清液(如有残余会影响细胞裂解不完全)。

2.将350μl裂解液RL(已提前加入1％的β-巯基乙醇)加入到离心管中，涡旋振荡混匀。

3.把过滤柱CS放在收集管中，然后将所有溶液转移至过滤柱CS上，标记上相应的编号，12000rmp(-13400×g)离心2min，收集滤液。

4.向滤液中加入350μl的70％乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将吸附柱放入收集管中，然后将滤液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rmp(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CR3放回到收集管中。

5.向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rmp(-13400×g)离心1min，将收集管中的滤液倒掉，将吸附柱CR3放回收集管中。

6.向吸附柱CR3中央加入80μl的DNaseⅠ工作液(含10μl DNaseⅠ和70μlRDD溶液)，室温静置15min。

7.向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rmp(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CR3放回收集管中。

8.漂洗液RW使用前先确保已加入乙醇，向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12000rmp(-13400×g)离心1min，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CR3放回收集管中。

9.重复步骤8。

10.12000rmp(-13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3室温放置数分钟，以充分晾干吸附材料中残余的漂洗液，如有残余可能会影响后续的RT等实验结果。

11.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30μlRNase-Free ddH₂O(体积不能低于30μl，以免影响其回收效率)室温放置2min，12000rmp(-13400×g)离心2min，得到RNA溶液。

2.5.2RNA浓度的测定

1.打开NanoDrop2000和Thermo程序，用RNase-Free ddH₂O设定空白对照。

2.做好编号，测样，记录测得的RNA浓度值和OD值。

2.6RT-PCR法检测mTRPV1表达

2.6.1引物序列

Primer名称	序列(5'to3')
		mTRPV1Forward	TCGTCTACCTCGTGTTCTTGTTTG

mTRPV1Reverse	CCAGATGTTCTTGCTCTCTTGTGC
		actin Forward	GGAGGTGCAATGGCTGTCTTGTCC
actin Reverse	CTGCCTTGGGTCACCTTACACCTCAC

2.6.2RT-PCR反应

1.反转录

1).Oligo(dT)¹⁸、总RNA和ddH2O混合配液(总体积12μl)，使总RNA的浓度一致，加入PCR管中65℃，5min。

2).分别将5×Reaction Buffer 4μl、10mM dNTP Mix 2μl、Ribdock RNaseinhibitor 1μl、RcvertAid Reverse Transcriptase 1μl加入上一步的PCR管，放入PCR仪中，程序为42℃60min，70℃5min。

3).结束后，-20℃保存。

2.PCR反应

1).反应体系：

3).程序结束后，取出放入4℃暂时保存或-20℃长期保存。

3.凝胶电泳分析

1).将50×TAE用ddH₂O稀释成1×TAE，备用。

2).称取琼脂糖0.5g，放入锥形瓶中，用50mL1×TAE微波溶解。

3).从微波炉中取出，室温放至60-70℃时，加入GV-Ⅱ(GoldView)5μl，轻轻晃动，混合混匀。

4).将混匀后的溶液倒入插好梳子的胶板中，注意不要产生气泡，凝固。

5).加样，设定好电压90V，时间20min。

6).曝光，用EmageJ进行灰度值分析。

2.7统计分析

实验数据以平均值±SE表示，采用SPSS 20分析软件分析数据，进行单因素方差分析，对结果进行组间差异性统计，Origin 8.0做绘图。P值<0.05认为两组数据间具有统计学显著性差异。

3.实验结果

3.1CAP升高TRPV1mRNA的表达

mTRPV1-HEK293细胞分别给予0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、20μmol/L CAP刺激，24hr后提取细胞总RNA，检测CAP对TRPV1mRNA的作用，结果如图1所示。

由图1结果可见CAP 8μmol/L、20μmol/L均能显著升高TRPV1mRNA的表达，分别升高了52.89±9.44％、53.34±5.86％(N＝3，与对照比，*P＜0.05)。3.2PNS降低CAP诱导的TRPV1mRNA的表达

mTRPV1-HEK293细胞分别给予40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的PNS处理1h后，再给予8μmol/L的辣椒素刺激，24小时候提取细胞的总RNA。结果如图2所示。

由图2结果可见，CAP能够显著的升高TRPV1mRNA的表达，升高了66.33±13.09％(与对照比，**P＜0.01)。给予40μg/mL PNS时就能够显著性的降低CAP诱导的TRPV1mRNA表达的升高，降低了39.14±12.20％(与CAP比#P<0.05)。

3.3三七中各单体对TRPV1mRNA表达的影响

选择了8种PNS中含量较高的单体，分别为三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、Rd、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Re、Rf。将这8种单体分别作用于mTRPV1-HEK293细胞，采用RT-PCR法检测8种单体成分对CAP诱导的疼痛的重要靶点TRPV1mRNA表达的影响。mTRPV1-HEK293细胞分别给予0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L的各单体成分处理1h后，再给予8μmol/L的辣椒素刺激，24小时候提取细胞的总RNA。结果如图3所示。

由图3结果可见，CAP能够显著的升高TRPV1mRNA的表达(与对照比，*P＜0.05)。而三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、Rd、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Re各单体对CAP诱导的TRPV1mRNA表达的降低无显著性差异。但人参皂苷Rf(在图中会用Rf代替)在1μmol/L以下时对CAP诱导的TRPV1mRNA表达的降低无显著性差异，而10μmol/L的人参皂苷Rf能够显著的降低CAP诱导的TRPV1mRNA表达，降低了69.72±15.20％(与CAP比#P<0.05)。

实施例2人参皂苷Rf对DRG中TRPV1的影响研究

1.实验材料、试剂及其仪器

1.1实验动物

体重80-100g SPF级SD雄性大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为：SCXK(京)2012-0001、SCXK(京)2012-0001。在SPF级动物房饲养，自由饮水，饲喂普通无菌鼠粮，室内温度控制为23±2℃，湿度控制在为45％-60％。

1.2实验试剂

名称	公司
		细胞基础培养基(EBSS)	Sigma-Aldrich
胶原蛋白酶	Sigma-Aldrich
		Western blot相关试剂	北京赛驰生物科技有限公司
β-actin抗体	SANTA CRUZ
		辣根酶标记山羊抗鼠	北京中杉金桥生物技术有限公司
辣根酶标记驴抗羊	北京中杉金桥生物技术有限公司
		TRPV1抗体	优宁维公司

1.3实验仪器

名称	公司
		Odessey红外扫描仪	Li-COR公司
Western-blot电泳仪及其相关设备	美国Bio-Rad公司

脱色摇床	普阳科学仪器研究所
		小梁剪	上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂
低速离心机	上海耐圣卡兰实业有限公司
		显微眼用镊	上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂

2.实验方法

2.1脊髓背根神经节细胞培养

1.取基础培养基EBSS，加入胶原蛋白酶放入冰盒中备用。

2.取SD大鼠，用乙醚麻醉后断头，迅速剥离大鼠脊柱置于冰上培养皿中，用高压灭菌后的小梁剪刀和镊子在体视镜下取出DRG。

3.取出的DRG，去除纤维，放入步骤1的含1.25mg/ml胶原蛋白酶培养基中，封口膜封好，置于37度孵育箱中进行消化1-1.5小时。

4.1-1.5小时后，从孵育箱中将消化后的DRG取出，800rpm离心5min。去除上清液。

5.用含有10％胎牛血清FBS(Fetal Bovine Serum，gibco)、1％的双抗(P.S.)、2mM glutamax、的培养基吹打混匀悬浮神经节，以最终获得单一神经元。

6.将吹打散的神经元铺于6孔板中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中，培养过夜，备用。

2.2给药处理

参见实施例1中的给药处理方法

2.3Western blot

1.蛋白样品制备：用1×loading buffer刮板，制备细胞样品。

2.配胶：配制10％SDS-PAGE，浓度为5％浓缩胶。

3.上样：2.5μl Marker，12μl样品。

4.跑胶：电压100V，20min；电压160V，90min。

5.转膜：295Ma，90min。

6.封闭：将(nitrocellulose membrane，NCM)膜浸泡在用5％脱脂奶粉制成的封闭液中，封闭2小时。

7.一抗：封闭液稀释5倍，用稀释后的封闭液稀释将一抗分别按相应比例进行稀释，将NCM加入相对应的一抗中，4℃孵育过夜。

8.二抗：用PBST洗4次，5min/次。加入封闭液稀释液将二抗按相应比例稀释。将NCM加入到相应的二抗中，孵育1小时。

9.洗二抗：用PBST洗4次，5min/次；PBS洗2次，5min/次。

10.扫膜：打开Odesay，将程序设定好，然后将膜放好并记牢，进行扫膜及其灰度值分析。

2.4统计分析

3.实验结果

实验采用Western blot的试验方法检测人参皂苷Rf对CAP诱导的DRG神经元中的TRPV1表达的影响。

将DRG神经元分别四个组，分别为Control组、CAP刺激Model组、人参皂苷Rf预处理后和CAP共孵育组、人参皂苷Rf处理组。由于RDG神经元对其周围环境比较敏感，CAP浓度过高会造成DRG神经元中Ca²⁺的大量流失，进而引起细胞凋亡。因此，CAP的浓度做出相应的调整，以利于实验的顺利展开。通过预实验，选取CAP的浓度为50nmol/L，人参皂苷Rf的浓度维持不变。对DRG神经元先用10μmol/L人参皂苷Rf预处理1小时，然后加入50nmol/L辣椒素共同孵育，24小时后提细胞蛋白。Western blot检测人参皂苷Rf对CAP诱导的DRG神经元中的TRPV1表达的影响，结果见图4。

由图4结果显示，50nmol/L的CAP能够显著地升高DRG中的TRPV1的蛋白表达水平，升高了42.10±7.47％(与对照比，***P＜0.001)。而给予人参皂苷Rf处理后，10μmol/L人参皂苷Rf能够显著的抑制辣椒素诱导的DRG神经元中TRPV1蛋白水平的表达，降低了29.08±5.71％(与CAP组比，##P<0.01)。而单独给予人参皂苷Rf未给予辣椒素处理时，人参皂苷Rf单体对DRG神经元中TRPV1蛋白水平的表达的变化无显著性差异。

实施例3人参皂苷Rf的镇痛作用研究

1.实验材料、试剂及其仪器

1.1实验动物

体重190-210g SPF级SD雄性大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为：SCXK(京)2009-0007。在SPF级动物房饲养，自由饮水，饲喂普通无菌鼠粮，室内温度控制为23±2℃，湿度控制在为45％-60％。

1.2实验试剂

辣椒素：0.05％溶于含有0.5％Tween20的生理盐水中；其他详见实施例1。1.3实验仪器

名称	公司
		1mL注射器	北京创欣慧宇科技有限责任公司
足底测试仪	意大利

2.实验方法

2.1实验动物分组与给药

Control组：SD大鼠，雄性，8只，先给予生理盐水50μl/只，1小时后再次注射生理盐水50μl/只；

Vehicle组：SD大鼠，雄性，8只，先给予含有DMSO的生理盐水50μl/只，1小时后再次注射含0.5％Tween 20的生理盐水50μl/只；

CAP组：SD大鼠，雄性，8只，50μl/只，先给予含有DMSO的生理盐水50μl/只，1小时后再次注射用生理盐水稀释的辣椒素溶液50μl/只；

人参皂苷Rf+CAP组：SD大鼠，雄性，8只，50μl/只，先给予用生理盐水稀释的人参皂苷Rf溶液50μl/只，1小时后再次注射生理盐水稀释的辣椒素溶液50μl/只；

人参皂苷Rf组：SD大鼠，雄性，8只，先给予用生理盐水稀释的人参皂苷Rf溶液50μl/只，1小时后再次注射含0.5％Tween 20的生理盐水50μl/只；2.2行为学检测

1.将老鼠放入有机玻璃板上的模块化动物笼中，使其后足充分暴露在外；适应1小时，使其稳定。

2.打开足底测试仪，将辐射光源置于仪器的有机玻璃板下，设置好相关程序，隔着有机玻璃板照射后足掌底部，开始记录每只老鼠的缩爪潜伏期，然后将老鼠分组，是其整组的基础值相近。

3.第一次给药处理：Control组先在其后爪的足底注射生理盐水50μl/只；Vehicle组先在其后爪的足底注射含有DMSO的生理盐水50μl/只；CAP组先足底注射含有DMSO的生理盐水50μl/只；人参皂苷Rf+CAP组先足底注射用生理盐水稀释的人参皂苷Rf溶液50μl/只；人参皂苷Rf组先足底注射用生理盐水稀释的人参皂苷Rf溶液50μl/只，每组老鼠预处理1小时。

4.第二次给药处理：1小时后，Control组在第一次注射的同一部位再次注射生理盐水50μl/只；Vehicle组在第一次注射的同一部位再次注射含0.5％Tween 20的生理盐水50μl/只；CAP组在第一次注射的同一部位再次注射用生理盐水稀释的辣椒素溶液50μl/只；人参皂苷Rf+CAP组在第一次注射的同一部位再次注射用生理盐水稀释的辣椒素溶液50μl/只；人参皂苷Rf组在第一次注射的同一部位再次注射含0.5％Tween 20的生理盐水50μl/只。

5.24小时后，按照药物注射前的检测方法进行缩爪潜伏期测定(测定之前还需要将老鼠放入有机玻璃板上的模块化动物笼中，适应1小时)。

6.记录测量结果。进行统计分析。

2.3统计分析

实验数据以平均值±SE表示，采用采用SPSS 20分析软件分析数据，进行单因素方差分析，对结果进行组间差异性统计，Origin 8.0做绘图。P值<0.05认为两组数据间具有统计学显著性差异。

3.实验结果

在实验过程中老鼠提前1小时预先足底注射100μM的人参皂苷Rf溶液，1小时后在老鼠足底的同一位置再次注射50μl/只辣椒素(0.05％的辣椒素溶解在含有百分之0.5％的Tween20中)。24小时进行行为学检测。检测结果如表1和图5所示。

表1人参皂苷Rf对大鼠的镇痛作用

结果显示，辣椒素能够显著地降低大鼠的痛觉阈值，降低了其缩爪潜伏期，使缩爪潜伏期由15.37±1.28(Sec)降低到了10.80±0.87(Sec)(p＜0.05)。给予人参皂苷Rf能够显著地升高辣椒素诱导的痛觉阈值的降低，提高了其缩爪潜伏期，使缩爪潜伏期由10.80±0.87(Sec)升高到了14.80±1.27(Sec)(p＜0.05)。

Claims

1.人参皂苷Rf作为TRPV1的拮抗剂的应用。

2.人参皂苷Rf在制备治疗与TRPV1受体相关的疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述与TRPV1受体相关的疾病包括伤害感受性疼痛、神经原性疼痛、癌性疼痛、头痛、膀胱功能障碍、炎症。

4.一种药物组合物，包括治疗有效量的人参皂苷Rf。

5.一种药物制剂，包括治疗有效量的人参皂苷Rf和药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其为口服制剂、注射制剂或外用制剂。