CN104360005B

CN104360005B - 一种快速评估用于氨基酸发酵的工业玉米浆品质的方法

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Publication number: CN104360005B
Application number: CN201410616266.9A
Authority: CN
Inventors: 宁健飞; 侯鸣; 侯一鸣; 李琼
Original assignee: WUXI JINGHAI AMINO ACID CO Ltd
Current assignee: WUXI JINGHAI AMINO ACID CO., LTD.
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: CN104360005A

Abstract

本发明公开了一种快速评估用于氨基酸发酵的工业玉米浆品质的方法，属于生物技术领域。本发明使用纸层析将玉米浆中的所有游离氨基酸分离并洗脱收集，同时以缬氨酸为标准样制作氨基酸含量与标样纸层析洗脱液吸光值关系的标准曲线，计算游离氨基酸的总含量。本发明建立了一种快速评估游离氨基酸含量的方法，并提供了判断玉米浆品质的标准，整个评估过程简便易操作，极大的提高了氨基酸发酵企业对玉米浆的质量控制水平，保障了氨基酸发酵的产酸率。

Description

一种快速评估用于氨基酸发酵的工业玉米浆品质的方法

技术领域

本发明涉及一种快速评估用于氨基酸发酵的工业玉米浆品质的方法，属于生物技术领域。

背景技术

玉米浆是玉米淀粉生产过程中得到的副产物，富含糖类、可溶性蛋白质、氨基酸、多肽、脂肪酸、维生素、肌醇、水解酶，以及其他有机化合物、重金属和无机离子。玉米浆是生产抗生素、有机酸和其他发酵产品的培养基组成成分之一，由于其富含可溶性蛋白和多种游离氨基酸，是微生物发酵的良好氮源。

玉米浆是氨基酸发酵工业的常规培养基成分，提供了微生物培养所需的氮源与生长因子。玉米浆的品质高低对氨基酸发酵的结果有重大的影响，高品质的玉米浆可以保障氨基酸发酵的产酸率，降低氨基酸粗品的提取难度；低品质的氨基酸能够显著降低氨基酸的产酸率，同时增加氨基酸粗品的提取难度。如何判定工业玉米浆的质量对于氨基酸发酵生产至关重要。

如今，国内尚未出台工业玉米浆的国家质量标准，只有地方标准或企业标准。这些玉米浆的质量标准非常的简单，只对干物质、蛋白质、酸度和亚硫酸做出了规定。国内市场上的工业玉米浆基本上都能满足这些标准。虽然各个企业提供的玉米浆基本都能满足这些简单的标准，但是各个企业提供的玉米浆，甚至是同一个企业提供的不同批次的玉米浆对氨基酸发酵还是存在显著差异。由于在生产原料、工艺控制和生产季节上存在着差异，所以不同厂家、不同生产批次玉米浆的成分变化较大，甚至在玉米浆的储运过程中都会引起成分的改变。

发明人发现玉米浆中游离氨基酸的总量对氨基酸发酵的产酸率有较大影响，游离氨基酸含量低的玉米浆能够明显降低氨基酸发酵的产酸率。如何快速评估玉米浆中游离氨基酸的总含量，以及建立氨基酸含量高低的标准是摆在眼前的实际问题。

使用HPLC检测方法可以对玉米浆中游离氨基酸进行精确定量检测，但是由于以下几个原因限制了HPLC的应用：1，HPLC法对仪器和操作人员有很高的要求，增加了企业的经济负担；2，玉米浆的成分很复杂，需要对玉米浆进行预处理，才能检测氨基酸；3，玉米浆中的游离氨基酸种类繁多，需要先对每种氨基酸进行定量，再经计算获得总量，这将是一种非常耗时耗力的过程，无法快速评估玉米浆中的氨基酸含量。

发明内容

为了解决用于氨基酸发酵的工业玉米浆难于评估的问题，本发明提供了一种快速评估用于氨基酸发酵的工业玉米浆品质的方法，使用纸层析将玉米浆中的所有游离氨基酸分离并洗脱收集，同时以缬氨酸为标准样制作氨基酸含量与标样纸层析洗脱液吸光值关系的标准曲线，计算游离氨基酸的总含量。

本发明首先解决的问题是提供一种快速评估玉米浆中游离氨基酸的方法，主要包括以下步骤：称取1g玉米浆加10ml水充分搅匀，作为供试品溶液；用微量进样器吸取供试品溶液及标准缬氨酸样品，按纸色谱法点样1μl；以正丁醇-冰乙酸-水按体积比4﹕1﹕5混合为展开剂，展开时间≥3小时；将晾干后的色谱滤纸放在盛有显色剂2％(g/100mL)茚三酮的丙酮溶液的瓷托盘中湿润、浸透，风干后置105℃烘箱中干燥5min，即呈现斑点；剪下所有显色斑，分别置于具塞试管中，用洗脱剂5ml洗脱2h以上；取各洗脱液在520nm的波长处测定吸光度；选取5个浓度梯度的缬氨酸标准样：0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％，同样品一起点样、展开、茚三酮丙酮显色、洗脱，在520nm的波长处测定吸光度，以标准样浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；根据供试品溶液处理后得到的洗脱液吸光度对应标准曲线中浓度，得出氨基酸含量。

所述洗脱剂是75％乙醇和0.2％CuSO₄·5H₂O按体积比39﹕1混合。

所述标样缬氨酸还可以替换为其他天然氨基酸。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种用于氨基酸发酵的工业玉米浆的质量控制方法，是以玉米浆中的游离氨基酸为特征成分，以游离氨基酸的含量作为控制工业玉米浆质量的质量参数。

所述方法首先通过上述快速评估玉米浆中游离氨基酸的方法测定玉米浆中游离氨基酸的含量，游离氨基酸含量为7.5％-10％时，为合格的玉米浆，适于氨基酸发酵。所述含量百分比为质量百分比。

本发明填补了氨基酸发酵领域内对工业玉米浆品质无有效评估方法的空白，通过一种快速简单，无需昂贵仪器，就能实现快速评估玉米浆中游离氨基酸，实现了对玉米浆品质的有效评判，从而帮助氨基酸发酵企业保持高水平的发酵产酸率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

从鲁洲生物科技(山东)有限公司采购了10个批次的工业玉米浆，分别命名为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#分别称取1g玉米浆加10ml水充分搅匀，作为供试品溶液；用微量进样器分别吸取10种供试品溶液及标准缬氨酸样品(浓度分别0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％)，按纸色谱法点样1μl，每个样品点3个平行样；以正丁醇-冰乙酸-水(4﹕1﹕5；v/v/v)为展开剂，展开3小时；将晾干后的色谱滤纸放在盛有显色剂2％(g/100mL)茚三酮的丙酮溶液的瓷托盘中湿润、浸透，风干后置105℃烘箱中干燥5min，即呈现斑点；剪下所有显色斑，置于具塞试管中，用洗脱剂(75％乙醇﹕0.2％CuSO₄·5H₂O＝39﹕1)5ml洗脱2h；将洗脱液在520nm的波长处测定吸光度，结果如表1-1所示。第二天，重新配制涉及检测的所有溶剂，重复第一天所做的所有实验，结果如表1-2所示。第三天，重新配制涉及检测的所有溶剂，重复第一天所做的所有实验，结果如表1-3所示。

表1-1、1-2、1-3、1-4中，游离氨基酸含量是根据洗脱液吸光值和标准曲线换算得到的，玉米浆中的实际游离氨基酸含量要在此基础之上乘以11，因为是称取的1g玉米浆加10ml水混匀后作为供试品溶液的。因此，表1-1、1-2、1-3、1-4中的游离氨基酸含量，是原玉米浆样品稀释11之后的游离氨基酸的含量。

以标准样浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；根据供试品溶液处理后得到的洗脱液吸光度对应标准曲线中浓度，得出氨基酸含量。从表1-1、1-2、1-3、1-4所显示的结果可知，三次试验所绘制的标准曲线的线性相关度高，且针对10批次的工业玉米浆所获得的三次游离氨基氨酸含量基本一致，这说明了本发明方法具有很高的稳定性和重现性。选择8#(氨基酸含量为7.7％)、10#(氨基酸含量为6.6％)工业玉米浆用于后续的试验，并分别命名为1#-1和1#-2玉米浆。

实施例2

从邳州市奋达淀粉有限公司采购了多个批次的工业玉米浆，从中选择游离氨基酸含量分别为7.7％和6.71％的两个批次的玉米浆用于试验，分别命名为2#-1和2#-2玉米浆。

实施例3

从宝应县永昌淀粉有限公司采购了多个批次的工业玉米浆，从中选择游离氨基酸含量分别为7.59％和6.6％的两个批次的玉米浆用于试验，分别命名为3#-1和3#-2玉米浆。

实施例1～3所选择的六个批次的玉米浆成分(质量百分比)如下表2所示，表2中氨基酸含量为玉米浆稀释11倍之后的氨基酸含量：

表2 六个批次玉米浆主要成分

玉米浆编号	1#-1	1#-2	2#-1	2#-2	3#-1	3#-2
							干物质％	41.6	41.4	42.1	42.0	41.4	41.7
蛋白质％	45.1	45.0	42.4	42.5	43.2	42.9
							酸度％	4.5	4.6	5.8	5.6	4.7	5.1

亚硫酸％	0.15	0.16	0.13	0.15	0.18	0.16
							氨基酸％	0.70	0.60	0.70	0.61	0.69	0.60

实施例4

异亮氨酸发酵菌种(1#菌)、缬氨酸发酵菌种(2#菌)以及谷氨酰胺发酵菌种(3#菌)的种子培养基是相同的，均是工业常见氨基酸发酵菌株，种子培养基配方为：葡萄糖4.0％、硫酸铵1.5％、酵母膏1.0％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、尿素0.125％；培养条件如下：温度27～36℃、pH是7.2～7.5、压力常压、培养时间16～20h，当菌种的菌浓(OD600)到达0.5±0.05时，培养结束，分别获得1#菌、2#菌、3#菌的种子液，备用。

实施例5

配制发酵培养基，三种氨基酸的发酵培养基如下表3所示：

表3 发酵培养基配方(按50L发酵体积计算)

使用1#-1玉米浆配制异亮氨酸发酵培养基，以1#菌为发酵菌种，在80L的发酵罐内加入50L发酵培养基，1#菌的接种量是10％，培养温度30±1℃，通气量3M³/h，搅拌速度50rpm，pH控制范围7.0～7.3，发酵时间50小时。按此发酵条件先后共做3批次，异亮氨酸的产酸分别是29.4g/L，31.1g/L，30.8g/L。

使用1#-2玉米浆配制异亮氨酸发酵培养基，除此之外，其他发酵条件与上述发酵条件完全相同，异亮氨酸的产酸分别是20.3g/L，19.4g/L，21.1g/L。

实施例6

使用2#-1玉米浆配制异亮氨酸发酵培养基，以2#菌为发酵菌种，在80L的发酵罐内加入50L发酵培养基，2#菌的接种量是10％，培养温度30±1℃，通气量1.5M³/h，搅拌速度40rpm，pH控制范围6.9～7.3，发酵时间40小时。按此发酵条件先后共做了3批次，缬氨酸的产酸分别是55.1g/L，53.7g/L，54.5g/L。

使用2#-2玉米浆配制缬氨酸发酵培养基，除此之外，其他发酵条件与上述发酵条件完全相同，异亮氨酸的产酸分别是41.2g/L，40.8g/L，41.4g/L。

实施例7

使用3#-1玉米浆配制谷氨酰胺发酵培养基，以3#菌为发酵菌种，在80L的发酵罐内加入50L发酵培养基，3#菌的接种量是10％，培养温度30±1℃，通气量2M³/h，搅拌速度60rpm，pH控制范围7.0～7.5，发酵时间45小时。按此发酵条件先后共做了3批次，谷氨酰胺的产酸分别是65.2g/L，64.4g/L，66.8g/L。

使用3#-2玉米浆配制谷氨酰胺发酵培养基，除此之外，其他发酵条件与上述发酵条件完全相同，谷氨酰胺的产酸分别是40.2g/L，40.9g/L，38.5g/L。

统计实施例5～7中不同氨基酸发酵的产酸率，统计结果如表4所示。表4罗列了使用不同厂家生产的工业玉米浆在不同品种的氨基酸发酵中的所获得的产酸结果。另外，参照实施例4-7的发酵方法，使用的玉米浆中游离氨基酸含量为8.8％、10％时，氨基酸产量略有提高；当使用于的玉米浆中游离氨基酸含量为5.3％、3％时，氨基酸产量明显下降。

综上，当工业玉米浆的游离氨基酸含量为7.5-10％时，能够保障氨基酸生产的正常产酸率，当玉米浆中的游离氨基酸含量≤6.6％时，明显降低氨基酸的产酸率，严重影响了工厂的生产效率，降低了原料利用率，提高了生产成本。

表4 不同氨基酸发酵的产酸率

通过本发明方法，可以有效地评估工业玉米浆中游离氨基酸的含量，从而帮助企业判断玉米浆的品质是否能够保障氨基酸发酵生产的需求，进而保证了发酵生产的持续稳定，对企业具有重大的意义。

表1-1 十批次工业玉米浆的游离氨基酸含量第一次检测结果

表1-2 十批次工业玉米浆的游离氨基酸含量第二次检测结果

表1-3 十批次工业玉米浆的游离氨基酸含量第三次检测结果

表1-4 十批次工业玉米浆的游离氨基酸含量的汇总

Claims

1.一种利用工业玉米浆进行氨基酸发酵的方法，其特征在于，所述方法是以玉米浆中的游离氨基酸为特征成分；首先通过纸层析法测定玉米浆中游离氨基酸的总含量，游离氨基酸总含量为7.5％-10％时，为适于氨基酸发酵的玉米浆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸发酵包括异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺的工业发酵生产。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纸层析法主要包括以下步骤：(1)称取1g玉米浆加10ml水充分搅匀，作为供试品溶液，按纸色谱法点样1μL；(2)将正丁醇、冰乙酸、水按体积比4﹕1﹕5混合作为展开剂，展开时间≥3小时；(3)展开结束后，将色谱滤纸晾干，将晾干后的色谱滤纸放在盛有显色剂的瓷托盘中湿润、浸透，风干后置105℃烘箱中干燥5min，即呈现斑点；所述显色剂是含2％茚三酮的丙酮溶液；(4)剪下所有显色斑，置于具塞试管中，用洗脱剂5ml洗脱2h以上；所述洗脱剂是75％乙醇和0.2％CuSO₄·5H₂O按体积比39﹕1混合得到的；(5)取洗脱液在520nm的波长处测定吸光度；(6)选取5个浓度梯度的缬氨酸标准样：0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％，采用与供试样品同样的方法点样、展开、茚三酮丙酮显色、洗脱，在520nm的波长处测定吸光度，以标准样浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；根据供试品溶液的洗脱液吸光度对应标准曲线中的浓度，得出玉米浆中游离氨基酸总含量。