CN103823014B

CN103823014B - 组合物、试剂盒及其用途和用其分析氨基酸方法

Info

Publication number: CN103823014B
Application number: CN201410048846.2A
Authority: CN
Inventors: 于丽; 刘桂兰; 姜铭姝; 刘俊琦; 王德辉
Original assignee: CHANGCHUN DAHE BIO TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN DAHE BIO TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2034-02-12
Also published as: CN103823014A

Abstract

本发明提供一种组合物，其包含醇、酸和水和茚三酮的混合物，本发明还提供一种试剂盒，其包括能够容纳含有醇、酸或水的其中一种、两种或三种的容器和容纳含有茚三酮的容器。本发明同时提供该组合物和试剂盒用于分析氨基酸的用途以及分析氨基酸的方法，所述方法可使用本发明的组合物或试剂盒进行。本发明的组合物和试剂盒在分析氨基酸且特别是发酵液中的氨基酸的过程中，显色性好，分辨率高，能够分析出至少13中氨基酸。本发明的方法不仅成本低，操作简便，而且检测快，仅需10‑25分钟，此外，本发明的方法能够高分辨地分析出至少13种氨基酸。

Description

组合物、试剂盒及其用途和用其分析氨基酸方法

技术领域

本发明涉及一种组合物和试剂盒，其用于分析氨基酸、特别是发酵液中氨基酸的用途，还涉及用其分析氨基酸、特别是发酵液中氨基酸的方法。

背景技术

目前，分析发酵液中的氨基酸成份主要使用以下方法：1）高效液相色谱或氨基酸分析仪，这两种方法虽然能进行定量分析，但是所用仪器价格昂贵，很难普及；2）纸层析法，此法虽然对设备要求不高，也相对比较方便，但此法每次层析时间长，通常需要2-3小时，总分析时间则长达4小时，并且传统纸层析法采用喷雾显色，易显色不均或冲散色斑，影响分析判断。

赵建国等在文献《薄层色谱法分离僵蝉蛋白中蛋白质和氨基酸类成分的研究》，湖南中医学院报，2005年4月，第25卷，第2期：第26-29页公开了一种僵蝉蛋白质和氨基酸类成分的薄层色谱分离鉴别方法，虽然该方法可以实现僵蝉蛋白质中氨基酸的分析，但展开时间即需要90分钟，总分析时间更长，且可分析的氨基酸的种类有限。

发明内容

本发明提供一种组合物，所述组合物为含有醇、酸、水和茚三酮的混合物。所述组合物可用于分析氨基酸、特别是发酵液中的氨基酸。

在本发明组合物的一个实施方案中，其中含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与茚三酮配制而成，所述醇为正丁醇和一种或多种选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丙醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇的醇混合物。在本发明组合物的一个优选实施方案中，所述醇为正丁醇和乙醇的醇混合物。在本发明组合物的一个优选实施方案中，所述醇混合物混合摩尔比1/1-5/1。

在本发明组合物的一个优选实施方案中，其中含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与茚三酮配制而成。在本发明组合物的一个优选实施方案中，其中含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与固体茚三酮配制而成。

在本发明组合物的一个优选实施方案中，其中酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、冰乙酸。在本发明组合物的一个更优选实施方案中，酸为冰乙酸。

在本发明组合物的一个优选实施方案中，醇的量为20-50摩尔%，酸的量为10-35摩尔%，水的量为30-60摩尔%，基于所述醇、酸和水的量之和为100摩尔%计；茚三酮的量为每1升溶剂0.2-10克。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括选自下列之一的容器：

容纳含有醇、酸、水和茚三酮混合物的容器；

容纳含有醇、酸和水的容器和容纳含有茚三酮的容器；或

分别容纳含有醇、酸、水的容器和容纳含有茚三酮的容器；或

分别容纳含有醇、酸、水中的任选两种的容器和含有醇、酸、水中另外一种物质的容器以及容纳含有茚三酮的容器，

所述醇为正丁醇和任一种选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丙醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇的醇混合物。在本发明试剂盒的一个优选实施方案中，所述醇为正丁醇和乙醇的醇混合物。在本发明试剂盒的一个优选实施方案中，所述醇混合物的混合摩尔比1/1-5/1。

在本发明试剂盒的一个优选实施方案中，其中含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与固体茚三酮配制而成；或者，所述容纳含有茚三酮的容器中容纳的是固体茚三酮。

在本发明试剂盒的一个优选实施方案中，本发明的试剂盒中还包括平板，其由塑料、玻璃、陶瓷等组成。

在本发明试剂盒的一个更优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包括含有对比样的容器。

在本发明试剂盒的各种实施方案中，前述对于组合物各优选实施方案的描述同样适用，并构成相应的优选、更优选的实施方案。

本发明还提供本发明的组合物或试剂盒用于分析氨基酸的用途。

在本发明用途的一个优选实施方案中，其中待分析的氨基酸为发酵液中的氨基酸。

在本发明用途的一个优选实施方案中，其中的发酵液为发酵物用水稀释后得到的水溶液。

在本发明用途的一个更优选实施方案中，发酵液为发酵物用水稀释1-100倍得到的发酵液。

在本发明用途的一个优选实施方案中，其中发酵物以选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉水解糖等的糖为底物并用选自德氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii）、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种（L.leichnanii）的微生物进行培养发酵获得。

在本发明用途的各实施方案中，所述氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。

此外，本发明还提供一种分析氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤：

a)点样：将含有氨基酸的样品点在平板上；

b)展层-显色：将点有含有氨基酸样品的平板的一端置于含醇、酸、水和茚三酮的混合物中，

步骤b)中所述含醇、酸和水和茚三酮的混合物得自本发明的组合物或本发明的试剂盒。

在本发明方法的一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤c)待所述含醇、酸、水的和茚三酮的混合物在所述平板上展层-显色完成后，取出平板，对其进行干燥，可见各种氨基酸的斑点。

在本发明方法的一个优选实施方案中，本发明的分析氨基酸的方法还包括d)将得自c)的平板与标准样的平板比较。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤a)中的平板为薄层板。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤a)中含有氨基酸的样品为氨基酸标准样品和/或其混合物，以及含有氨基酸的溶液。

在本发明方法的一个更优选实施方案中，其中含有氨基酸的溶液为含有氨基酸的发酵液。

在本发明方法的一个更优选实施方案中，其中发酵液为发酵物用水稀释后得到的水溶液。

在本发明方法的一个甚至更优选实施方案中，其中发酵液为用水稀释1-100倍得到的发酵液。

在本发明方法的一个优选实施方案中，其中发酵物以选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉（例如马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉）水解糖的糖为底物并用选自德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种（L.leichnanii）的微生物进行培养发酵获得。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤a)中的点样步骤重复多次进行。

在本发明方法的一个更优选实施方案中，每次点样完成后还包括进行干燥的步骤。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤b)中本发明组合物的液面不高于平板上的样品点。

在本发明方法的各实施方案中，所述氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。

本发明的组合物和试剂盒在分析氨基酸且特别是发酵液中的氨基酸的过程中，显色性好，分辨率高，能够分析出至少13种氨基酸。

本发明的方法不仅成本低，操作简便，而且检测快，仅需10-25分钟，此外，本发明的方法能够高分辨地分析出至少13种氨基酸。

具体实施方式

本发明提供一种组合物，其包含：含有醇、酸、水和茚三酮的混合物。

本发明组合物可用的醇可以是市售的已知醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇和/或其混合物，但不限于此。本发明组合物可用的醇优选正丁醇和任一种选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丙醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇的醇混合物，更优选正丁醇和乙醇的醇混合物，在醇混合物的情况下，所述醇混合物的混合摩尔比为1/1-5/1，优选为3/2-4/1，更优选为2/1-7/2。

本发明组合物可用的酸可以是市售的已知酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、冰乙酸，但不限于此。本发明组合物可用的酸优选乙酸、冰乙酸，更优选冰乙酸。

本发明组合物可用的水可以是，例如去离子水，但不限于此。

本发明组合物可用的茚三酮可以是市售产品，例如购自中国惠世生化试剂有限公司的分析纯茚三酮、购自上海华壹生物科技有限公司的分析纯茚三酮，但不限于此。

在本发明组合物的一个实施方案中，本发明的组合物为含有醇、酸、水和茚三酮的混合物，其由醇、酸、水与茚三酮配制而成。所述茚三酮可以是固体茚三酮。

本发明的组合物中，醇的量为20-50摩尔%，优选25-45摩尔%，更优选30-40摩尔%；酸的量为10-35摩尔%，优选15-30摩尔%，更优选18-25摩尔%；水的量为30-60摩尔%，优选35-50摩尔%，更优选40-45摩尔%；基于所述醇、酸和水的量之和为100摩尔%计。本发明的组合物中，茚三酮的量为每1升溶液0.2-10克，优选0.5-8克，更优选0.8-5克。所述茚三酮的量为纯物质（非水合物）的量，应理解，本发明可用的茚三酮既包括其纯物质，也包括其水合物或其他物质形式，对于茚三酮的水合物或其他物质形式，所述量应换算为纯茚三酮纯物质的量。

本发明还提供一种试剂盒，其包括选自下列之一的容器：

容纳含有醇、酸、水和茚三酮混合物的容器；

容纳含有醇、酸和水的容器和容纳含有茚三酮的容器；或

分别容纳含有醇、酸、水中的任选两种的容器和含有醇、酸、水中另外一种物质的容器以及容纳含有茚三酮的容器。

本发明试剂盒可用的醇及其量可以是上述针对本发明组合物提及的醇及其量。

本发明试剂盒可用的酸及其量可以是上述针对本发明组合物提及的酸及其量。

本发明试剂盒可用的水及其量可以是上述针对本发明组合物提及的水及其量。

本发明试剂盒可用的茚三酮及其量可以是上述针对本发明组合物提及的茚三酮及其量。

在本发明试剂盒的一个优选实施方案中，所述含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与固体茚三酮配制而成；或者，所述容纳含有茚三酮的容器中容纳的是固体茚三酮。

在本文中，容纳含有醇、酸、水和茚三酮混合物的容器为1个容器，其容纳有由醇、酸、水与茚三酮配制而成的混合物；容纳含有醇、酸和水的容器为1个容器，其容纳有含有醇、酸和水的混合物；分别容纳含有醇、酸、水的容器为3个容器，这3个容器分别容纳含有醇、含有酸和含有水的物质；分别容纳含有醇、酸、水中的任选两种的容器和含有醇、酸、水中另外一种物质的容器为2个容器，其中第一个容器容纳有醇、酸、水中任意两种的混合物，第二个容器容纳有醇、酸、水中未容纳在第一个容器中的物质；容纳含有茚三酮的容器为1个容器，其容纳有含有茚三酮的物质，所述含有茚三酮的物质可以是例如茚三酮固体、茚三酮的水合物、茚三酮的溶液等。

应理解，以上容器的数量和容纳方式仅为示例性的，只要包括本发明组合物组分的醇、酸、水和茚三酮的容器，无论容器的个数和容纳方式，均在本发明的范围内。

不限制容器的容量，优选小容量的容器，例如容量为10-25毫升的容器。

容器例如可由塑料或玻璃制成，例如由聚对苯二甲酸乙二酯（PET）制成，例如购自台州平基塑业有限公司的15mlPET瓶。不限制所述容器横截面，例如可为圆形，例如容器可为正圆柱形。所述容器可为透明、半透明或不透明的；容器可以有颜色，例如琥珀色，例如购自杭州莱伯斯实验设备有限公司的15ml棕色试剂瓶。

不限制容器的形式，可为瓶、袋、包、药袋或罐。

容器优选是封闭的。

为配送及销售，容器可以在外包装例如纸盒中提供。

为了方便使用，本发明的试剂盒中还可以包括平板，其由塑料、玻璃、陶瓷等组成。应理解，平板可以为薄层板，不对薄层板作任何限定，可以是任何市售的检测用薄层板，例如购自通用实验科技（香港）有限公司的薄层板、购自MERCK MILLIPORE（默克密理博）的薄层层析板、购自浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂的GF254-层析硅胶薄板。

可用在本发明中的平板为浅色的，优选白色的。

本发明的试剂盒中还可以包括含有对比样的容器，所述对比样可以是用于对比得出结果的单独的纯样或纯样的混合物，例如，可以是一组已知氨基酸纯样品。应理解，所述对比样与本发明组合物的组分放置在不同的容器中。此外，对比样也可以与本发明的组合物在不同的纸盒内提供，即本发明的组合物与对比样可以同时包含在一个盒内销售，也可以分别包含在不同的盒内销售。

本发明还提供本发明的组合物或试剂盒用于分析发酵液中氨基酸的用途。

可分析的氨基酸是指在其分子式中含有氨基的有机酸。氨基酸可以是，例如赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。在本文中，氨基酸可以呈酸的形式或者呈相应盐的形式。

本文提及的发酵液为发酵物用水、优选去离子水稀释后得到的溶液，稀释倍率为1-100倍，优选10-80倍，更优选15-50倍。

本文提及的发酵物通常以糖为底物用微生物进行培养发酵获得，所述糖可以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉（例如马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉）水解糖，所述微生物可以是，例如德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种（L.leichnanii）。

在本发明用途的一个实施方案中，用本发明的组合物或试剂盒分析以选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉（例如马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉）水解糖的糖为底物并以选自德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种（L.leichnanii）的微生物进行培养发酵获得的发酵物用水稀释1-100倍的溶液。

在本发明用途的一个优选实施方案中，用本发明的组合物或试剂盒分析以葡萄糖为底物并以德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）进行培养发酵获得的发酵物用水稀释10-80倍的溶液。

在本发明用途的一个更优选实施方案中，用本发明的组合物或试剂盒分析以葡萄糖为底物并以德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）进行培养发酵获得的发酵物用水稀释15-50倍的溶液。

a)点样：将含有氨基酸的样品点在平板上；

b)展层-显色：将点有含有氨基酸的样品点的平板的一端置于含醇、酸、水和茚三酮的混合物中。

含有氨基酸的样品可以是氨基酸标准样品或其混合物，例如选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸的氨基酸及其混合物，也可以是含有氨基酸的溶液，例如可以是含有氨基酸的发酵液。

步骤a)中，根据含有氨基酸样品的浓度不同，点样可以分次进行，例如1-10次，优选分2-8次点样，更优选分3-5次点样。优选地，在分次点样的情况下，每次点样完成后进行干燥。干燥可以在常温或加热下进行，如进行加热干燥，可使用任何已知的常规干燥设备，例如可以是干燥箱、吹风机。

步骤a)中，点样可以用任何已知的移液设备进行，例如可以是能够实现本发明方法步骤a)所述目的的任何移液设备，例如移液管、微量进样器。

步骤b)中，优选本发明组合物的液面不高于平板上的样品点。

步骤b)中，点有含有氨基酸样品的平板置于本发明组合物中的时间无特别限制，只要完成展层-显色即可，换言之，本发明的组合物沿着置于其中的平板的一端向另一端展层至另一端的边缘处即可，所述时间可以是，例如8-50分钟，优选10-30分钟，更优选10-25分钟。

步骤b)中，本发明的和茚三酮的混合物可以由本发明的组合物或本发明的试剂盒提供。

在本发明方法的一个优选实施方案中，还包括c)待本发明的组合物在所述平板上展层-显色完成后，取出平板，对其进行干燥，可见各种氨基酸的斑点。

步骤c)中，干燥可以在常温下进行，也可以在加热下进行，优选在加热下进行，加热干燥的温度可以为30℃-80℃，优选35-75℃，干燥时间无特别限定，只要能够实现烘干目的，可根据烘干温度进行调节，例如，如在70℃下烘干，可以是2-5分钟。

在本发明方法的一个优选实施方案中，还包括d)将得自c)的平板与标准样比较。

结果计算

用薄层板分析氨基酸时，通常用氨基酸在薄层板上的相对迁移率Rf（rate offlow）来对其进行鉴别分离。具体而言，Rf值为氨基酸沿溶剂运动方向迁移的距离（d₁）与氨基酸未迁移时距离液面的距离（d₂）之比。

Rf=d₁/d₂

本文中，例如，Rf可通过如下方式测量：在上述方法的步骤b)中，在点有含有氨基酸样品的平板的一端置于本发明的组合物中时，测量含有氨基酸的样品点（原点）中心距离本发明组合物液面的距离d₂；在得自上述分析方法步骤b)的平板上量出经展层-显色后的氨基酸斑点中心至原点中心的距离d₁，根据如下公式计算出本文所述发酵液中氨基酸的Rf值。如分析对象为含氨基酸的溶液，则根据上述计算得到的Rf值与已知标准氨基酸样品点Rf_标值进行比较，根据比较结果判别出本发明所述发酵液中氨基酸的种类，所述Rf_标值的测定可以根据本发明的方法进行。

下面将通过实施例详细说明本发明的优选实施方式，应理解，以下实施例仅为示例性的，不应理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1：制备本发明的组合物

原料

乙醇，优级纯，北京化工厂

正丁醇，优级纯，北京化工厂

冰乙酸，优级纯，北京化工厂

去离子水，自制

茚三酮，分析纯，中国惠世生化试剂有限公司

氨基酸的标准样品，中国惠世生化试剂有限公司

实验器材

层析硅胶薄板，5cm×3cm，GF254-薄板，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂

尺子、铅笔，市售

吹风机，飞利浦1600w

层析缸，7cm×7cm×10cm，天津玻璃仪器厂

烘箱，202-0台式电热干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司

1微升微量进样器，YY0088-92，宁波市镇海三爱仪器厂

制备发酵液

以葡萄糖为底物，选用德式乳杆菌进行深层发酵，得到发酵物，用去离子水将上述发酵物稀释25倍，得到发酵液。

制备本发明的组合物

将6.2ml正丁醇（27摩尔%）、1.5ml乙醇（12摩尔%）、2.9ml冰乙酸（19摩尔%）、2ml水（42摩尔%）、0.012g茚三酮（每1升溶液1.0克）在层析缸中混合，搅拌均匀后得到本发明的组合物。

用本发明的组合物分析发酵液中的氨基酸

a)点样：在层析硅胶薄板上用铅笔距离底边1cm的水平线上（点样线）确定13个点（原点），每个点相距约3mm，分4次将0.6微升含氨基酸的发酵液点在步骤a)中的同一个原点上，每点1次均用吹风机吹干；

b)展层-显色：将步骤a)中点有发酵液的层析硅胶薄板的一端浸入装有本发明组合物的层析缸中，本发明组合物的液面低于点样线，盖好层析缸盖，本发明的组合物沿着层析硅胶薄板向上展层。12分钟后，本发明的组合物展至距薄板上边沿2mm处，停止展层；

c)取出层析硅胶薄板，用70℃烘箱烘干3分钟，即可见各自氨基酸的斑点。

结果计算

量出展层显色后各个斑点中心至原点中心距离d₁，再量出原点中心至溶剂液面的距离d₂，计算出它们的Rf值，结果列于表1。

测定氨基酸标准样品的Rf _标值

氨基酸标准样品的分析方法和结果计算方法与上述发酵液中发酵液中的氨基酸分析方法和结果方法类似，不同之处在于，用氨基酸标准样品代替发酵液。

将测得的发酵液中氨基酸的Rf值与测定的各氨基酸标准样品的Rf_标值进行比较得到发酵液中氨基酸的种类，比较结果列于表1。

表1测量结果

d₁(cm)	d₂(cm)	Rf值	氨基酸种类
				0.50	3.95	0.13	赖氨酸
1.30	3.95	0.33	天冬氨酸
				1.80	3.95	0.46	谷氨酸
2.50	3.95	0.63	蛋氨酸
				2.80	3.95	0.71	异亮氨酸
0.90	3.95	0.23	精氨酸
				0.60	3.95	0.15	组氨酸
2.00	3.95	0.51	丙氨酸
				2.65	3.95	0.67	色氨酸
2.20	3.95	0.56	酪氨酸
				1.45	3.95	0.37	丝氨酸
3.00	3.95	0.76	苯丙氨酸
				1.60	3.95	0.41	苏氨酸

实施例2：制备本发明的试剂盒

原料

与实施例1相同。

实验器材

15ml玻璃试剂瓶，购自杭州莱伯斯实验设备有限公司。

其他实验器材与实施例1相同。

制备本发明的试剂盒

本发明的试剂盒包括：

盒1：其中包括

14个瓶a，各自为15ml玻璃试剂瓶，其中均含有6.2ml正丁醇（27摩尔%）、1.5ml乙醇（12摩尔%）、2.9ml冰乙酸（19摩尔%）和2ml水（42摩尔%）的混合物，

14个瓶b，各自为15ml玻璃试剂瓶，其中均含有0.012g茚三酮（相当于每1升溶液1.0克）;

盒2：其中包括

13个瓶c，各自为15ml玻璃试剂瓶，其中各自独立地含有10ml赖氨酸、10ml天冬氨酸、10ml谷氨酸、10ml蛋氨酸、10ml异亮氨酸、10ml精氨酸、10ml组氨酸、10ml丙氨酸、10ml色氨酸、10ml酪氨酸、10ml丝氨酸、10ml苯丙氨酸、10ml苏氨酸的纯样。

所述瓶均具有可重复盖紧的盖子。

所述14个瓶a、14个瓶b、13个瓶c和薄层板一起在纸盒中提供。

用本发明的试剂盒分析发酵液中的氨基酸

制备发酵液：制备发酵液的方法与实施例1相同。

用本发明的试剂盒分析发酵液中的氨基酸：

将上述1个瓶a中和1个瓶b中的物质倒入层析缸中，混合均匀后，按照如下步骤用本发明的试剂盒分析发酵液中的氨基酸：

b)展层-显色：将步骤a)中点有发酵液的层析硅胶薄板的一端浸入装有瓶a和瓶b中的物质的混合物的层析缸中，所述混合物的液面低于点样线，盖好层析缸盖，所述混合物沿着层析硅胶薄板向上展层。12分钟后，所述混合物展至距薄板上边沿2mm处，停止展层；

结果计算：结果计算方法与实施例1相同。计算结果与表1相同。

测定氨基酸标准样品的Rf标值：氨基酸标准样品的分析方法和结果计算方法与上述发酵液中发酵液中的氨基酸分析方法和结果方法类似，不同之处在于，用本实施例盒2中的氨基酸标准样品代替发酵液。

将测得的发酵液中氨基酸的Rf值与测定的各氨基酸标准样品的Rf_标值进行比较得到发酵液中氨基酸的种类，比较结果与表1相同。

应理解，为了适应大规模测试的需要，本发明组合物的上述量可以按比例进行放大，只要包含本发明组合物所述物质的组合物且量比例在本发明提及的范围内，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种使用组合物分析氨基酸的方法，所述组合物为含有醇、酸、水和茚三酮的混合物，所述醇为正丁醇和乙醇的醇混合物，所述醇混合物混合的摩尔比正丁醇:乙醇为2/1-7/2，所述酸为冰乙酸，且

其中，所述醇的量为30-40摩尔％，所述酸的量为18-25摩尔％，所述水的量为40-45摩尔％，基于所述醇、酸和水的量之和为100摩尔％计；所述茚三酮的量为每1升溶剂0.8-5克，

且其中所述氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。

2.权利要求1所述方法，其中所述含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与茚三酮配制而成。

3.权利要求2所述方法，其中所述含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与固体茚三酮配制而成。

4.一种用试剂盒分析氨基酸的方法，所述试剂盒包括选自下列之一的容器：

容纳有醇、酸、水和茚三酮混合物的容器；

容纳有醇、酸和水的容器和容纳有茚三酮的容器；或

分别容纳有醇、酸、水的容器和容纳有茚三酮的容器；或

分别容纳有醇、酸、水中的任选两种的容器和含有醇、酸、水中另外一种物质的容器以及容纳有茚三酮的容器；

所述醇为正丁醇和乙醇的醇混合物，所述醇混合物的混合摩尔比正丁醇:乙醇为2/1-7/2，所述酸为冰乙酸，且

5.权利要求4所述的方法，所述试剂盒还包括平板和/或含有对比样的容器。

6.权利要求4所述的方法，其中所述含有醇、酸、水和茚三酮的混合物由醇、酸、水与固体茚三酮配制而成，或者，所述容纳有茚三酮的容器中容纳的是固体茚三酮。

7.权利要求1-3任一项所述组合物或权利要求4-6任一项所述试剂盒用于分析氨基酸的用途，其中所述氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。

8.权利要求7所述的用途，其中所述氨基酸为发酵液中的氨基酸。

9.权利要求8所述的用途，其中所述发酵液为发酵物用水稀释后得到的水溶液。

10.权利要求9所述的用途，其中所述发酵液为发酵物用水稀释1-100倍得到的发酵液。

11.权利要求9所述的用途，其中所述发酵物以选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉水解糖的糖为底物并用选自德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种(L.leichnanii)的微生物进行培养发酵获得。

12.一种分析氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤：

a)点样：将含有氨基酸的样品点在平板上；

b)展层-显色：将点有含有氨基酸样品的平板的一端置于含醇、酸、水和茚三酮的混合物中，所述含醇、酸和水和茚三酮的混合物得自权利要求1-3任一项所述的组合物或权利要求4-6任一项所述的试剂盒，

其中，所述氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。

13.权利要求12所述的方法，其中步骤a)中所述平板为薄层板。

14.权利要求12所述的方法，其中步骤a)中所述含有氨基酸的样品为氨基酸标准样品，以及含有氨基酸的待测溶液。

15.权利要求14所述的方法，其中所述含有氨基酸的待测溶液为含有氨基酸的发酵液。

16.权利要求15所述的方法，其中所述含有氨基酸的发酵液为发酵物用水稀释后得到的水溶液。

17.权利要求16所述的方法，其中所述含有氨基酸的发酵液为发酵物用水稀释1-100倍得到的发酵液。

18.权利要求16或17所述的方法，其中所述发酵物以选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油、淀粉水解糖的糖为底物并用选自德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌莱库南亚种(L.leichnanii)的微生物进行培养发酵获得。

19.权利要求12所述的方法，其中步骤a)中所述点样步骤重复多次进行。

20.权利要求19所述的方法，其中每次点样完成后还包括进行干燥的步骤。

21.权利要求12所述的方法，其中步骤b)中的所述醇、酸和水的和茚三酮的混合物的液面不高于平板上的样品点。

22.权利要求12所述的方法，其中所述分析氨基酸的方法还包括：c)待含醇、酸、水和茚三酮的混合物在所述平板上展层-显色完成后，取出平板，对其进行干燥，可见各种氨基酸的斑点。

23.权利要求22所述的方法，其中所述分析氨基酸的方法还包括：d)将得自c)的平板与标准样的平板比较。