CN104328055A - 一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用 - Google Patents

一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用。本发明提供了一株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为CGMCC No.9534。本发明的实验证明，本发明的真菌HL，氨氮的去除效果良好，无亚硝酸盐氮积累，有及少量的硝酸盐氮积累；能有效控制粪便氨气的挥发，抑制率最高可达到79％，表现出了较高的应用潜力。

Description

一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用。
背景技术
目前，集约化的规模养殖已使改善畜禽场的环境成为一个紧迫的问题。畜禽生产和粪便储存过程中会产生了大量的恶臭物质，对人和动物的健康产生严重威胁，这些成分复杂的恶臭气体中，以氨气的危害最为突出。已有研究证明，大量的氨气挥发直接危害到动物和人类的健康，影响可入肺颗粒物(PM2.5)的形成，扩散到大气中与一些酸性物质反应，形成铵盐气溶胶，导致生态系统富营养化和酸化(NRC，2003)。
有调查研究显示，在养殖业密集地区，将近70％的氨挥发来自于农业生产。因此，抑制畜禽粪便中氨气的挥发显得尤为重要。
氨气的产生是由于粪便铵态氮的挥发造成的，因此可通过降低粪便中铵态氮的含量达到控制粪便氨气的挥发的目的，而具有硝化功能的微生物在此过程中发挥着至关重要的作用。近年来，有关异养型硝化微生物的报道较多，与自养型硝化细菌相比，异养型硝化细菌在自然界的分布更为广泛，包括真菌、放线菌和细菌，甚至一些藻类，其中真菌是数量最大效率最高的异养硝化微生物，在氨氮降解中发挥着重要的功能。目前实验室研究中多以具有硝化功能的细菌为主，如Rhodococcus sp，Acinetobactersp.，Bacillus sp.，Pseudomonas sp.，Alcaligenes faecalis等。
近些年的研究报告指出真菌在氨氮氧化中发挥着重要作用，显示了完全降解氨氮的潜能，并且对粪便中的挥发性脂肪酸等有害物质的耐受性强。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL。
本发明提供的宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为CGMCCNo.9534。
上述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解待测样品中氨氮的应用也是本发明保护的范围；
或上述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解待测样品中氨氮的产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述待测样品为水或粪便，所述氨氮为硫酸铵。
上述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在抑制粪便中氨气挥发中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备抑制粪便中氨气挥发产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述粪便为畜禽粪便，具体为鸡。
本发明的另一个目的是提供一种降解氨氮的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液接种在含有氨氮的样品和/或产品中，培养，实现降解氨氮。
上述方法中，
上述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1％的量接种在所述含有氨氮的样品和/或产品；
所述含有氨氮的样品和/或产品为水，
具体为模拟废水，氨氮初始浓度50mg/l模拟废水配方如下：葡萄糖1.25g，(NH4)2SO40.25g，NaCl 1.0g，K2HPO4·2H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.25g，微量元素溶液1.0ml，水1000mL，调pH7.2-7.4，其中氨氮含量约为50mg/L，通过改变葡萄糖和硫酸铵的量，维持C/N为10，调整溶液中氨氮的含量。
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
上述方法中，所述培养为37℃，140r/min摇床培养。
本发明第三个目的是提供一种抑制粪便中氨气挥发的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液接种在粪便中，混匀后静置，实现抑制粪便中氨气挥发。
上述方法中，所述粪便为畜禽粪便；
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1％的量接种在所述粪便中；
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为400NTU。
所述静置时间为1-4d。
拟青霉HL于2014年8月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号CGMCC No.9534，分类命名为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)。
本发明的实验证明，本发明提供了宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL，其氨氮降解能力测定结果表明，氨氮的去除效果良好，无亚硝酸盐氮积累，有及少量的硝酸盐氮积累；能有效控制粪便氨气的挥发，抑制率最高可达到79％，表现出了较高的应用潜力。
附图说明
图1为具有氨氮降解能力的真菌HL菌落图片。
图2为真菌HL的氨氮降解效率图。
图3为不同初始氨氮浓度对菌HL降解率的影响
图4为pH对氨氮降解率的影响
图5为温度对氨氮降解率的影响
图6为转速对氨氮降解率的影响
图7为不同碳源对氨氮降解率的影响
图8为不同C/N比对氨氮降解率的影响
图9为菌株HL对粪便氨气的抑制效果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
富集培养基：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO42.0g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO4·2H2O1.0g，FeSO4·7H2O0.4g，微量元素溶液1.0ml，水1000mL，调pH7.2-7.4。
分离培养基：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO42.0g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO4·2H2O1.0g，微量元素溶液1.0ml，琼脂20.0g，水1000mL，调pH7.2-7.4。
氨氮初始浓度50mg/l模拟废水：葡萄糖1.25g，(NH4)2SO40.25g，NaCl 1.0g，K2HPO4·2H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.25g，微量元素溶液1.0ml，水1000mL，调pH7.2-7.4，其中氨氮含量约为50mg/L，通过改变葡萄糖和硫酸铵的量，维持C/N(碳氮质量比)为10，调整溶液中氨氮的含量。
微量元素溶液：EDTA 10.0g，ZnSO41.2g，CaCl21.5g，MnCl2·4H2O 1.0g，FeSO4·H2O2.0g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.0g，CuSO4·5H2O 1g，CoCl2·6H2O 1.0g，水1L，PH7.2-7.4。
PDA培养基：PDA培养基：取新鲜马铃薯，去皮后称取200g，加入1000mL水，煮沸20min后，用4层纱布过滤，清液中加入20g葡萄糖，煮沸，补足失水。
查氏培养基：葡萄糖20g，FeSO40.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，NaNO32.0g，琼脂20g，K2HPO41.0g，再加入蒸馏水1000mL。
实施例1、氨氮降解菌HL的分离纯化及鉴定
1、HL的分离纯化
采集常温保存3天的鸡粪样品20g接种于装有100ml生理盐水的锥形瓶中，震荡30min，静置10min，取上清液1ml接种于100ml的富集培养基中，37℃140r/min培养2天后，再次取1ml培养液接种于新的富集培养基中，如此反复10代。取富集10代后的培养液1ml，经10-1梯度稀释后，取200ul涂布于分离平板上，于37℃培养24～72h，24h后开始观察菌的生长情况，选取生长快、菌落大、数量多的菌落采用三线法进行纯化。将纯化后的单菌落接种到模拟废水中，24h后测定氨氮含量，选取氨氮降解率最高的菌株，作为实验菌株，命名为HL。
2、形态观察
在PDA培养基上，HL菌株生长迅速，37℃培养3天，直径4-5cm，无固定大小，可延至整个培养基。菌落呈毯状，较致密，初为淡黄色，后期中间呈土黄色，四周为淡黄色。菌丝分隔，透明，光滑，培养基背面呈淡黄色，培养基颜色不改变。分生孢子梗光滑，瓶梗基部膨大，向上形成一细的长颈，分生孢子成熟后表面呈粉末状，干燥，单孢，形成离散型链状，单个孢子多为椭圆形，淡黄色(图1)。
3、分子生物学鉴定
从分离平板上挑取单克隆HL，接种于PDA培养基中，在37℃，140rmp条件下震荡24h，离心，收集菌体，提取总DNA。以菌株HL的总DNA作为模板，以NS1(5’GTAGTCATATGCTTGTCTC3’)与NS8(5’TCCG2CAGGTTCACCTACGGA3’)为引物进行18S rDNA的扩增。得长度为1800bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列1，将该序列进行blast比对分析，发现菌株HL与Paecilomyces variotii的相似度最高，为99％。
综合菌株形态特征和18SrDNA序列，鉴定HL为宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)。
拟青霉HL于2014年8月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号CGMCC No.9534，分类命名为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)。
实施例2、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL的降解氨氮功能研究
一、菌株HL降解氨氮研究
菌丝悬浊液：挑取实施例1获得的真菌HL的单菌落接种于PDA液体培养基进行活化。48h后将培养液用灭过菌的4层纱布过滤，得到的菌体，用无菌生理盐水冲洗2次，之后将转移到手动匀浆器中，加无菌去离子水进行轻微匀浆，制成均匀的菌丝悬浊液(浊度为400NTU(浊度单位))，备用。
向模拟废水中(C/N比为10，葡萄糖和硫酸铵分别为唯一碳源)中接种体积百分含量为1％的上述菌丝悬浊液，37℃，140r/min摇床培养，分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24h采集培养液，测定各个时间段内氨氮、硝态氮以及亚硝态氮的含量。
氨氮的测定方法采用水杨酸-次氯酸盐光度法(GB7481—87)。硝酸盐氮测定采用酚二磺酸分光光度法(GB7480-87)。亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB 7493-87)。菌丝悬浊液浊度采用散射法—福尔马肼标准(生活饮用水检验方法感官性状和物理指标(GB/T 5750.4-2006)。
结果如图2所示，可以看出，菌体细胞进入新的培养体系后出现一段适应期，此时培养液中氨氮的浓度下降的较为缓慢，12h后开始快速下降，到21h以后再次呈现缓慢降低趋势，经24h培养，NH4 +-N浓度由初始的51.06mg/l，下降到1.33mg/l，去除率为97.39％。整个降解过程中未检测到亚硝酸盐积累，硝态氮稍有积累，24h的积累浓度为0.26mg/L，整体呈现先生高后下降的趋势
二、不同初始氨氮浓度对菌株HL降解氨氮的影响
氨氮初始浓度10mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成0.25g/l、(NH4)2SO4浓度替换成0.05g/l；
氨氮初始浓度100mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成2.5g/l、(NH4)2SO4浓度替换成0.5g/l；
氨氮初始浓度160mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成4.0g/l、(NH4)2SO4浓度替换成0.8g/l；
氨氮初始浓度200mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成5.0g/l、(NH4)2SO4浓度替换成1.0g/l；
氨氮初始浓度400mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成10.0g/l、(NH4)2SO4浓度替换成2.0g/l；
氨氮初始浓度600mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖浓度替换成15.0g/l、(NH4)2SO4浓度替换成3.0g/l。
将菌丝悬浊液按1％的体积比接种到氨氮初始浓度分别为10、50、100、160、200、400、600mg/l模拟废水中进行培养，在培养后的24、36h采集培养液，测定氨氮浓度。
结果如图3，在C/N比为10，硫酸铵为唯一氮源的培养体系中，接种1％的HL菌丝悬浊液，氨氮的最终去除率如表一所示；从图3(a)中可以看出，在营养水平较低的环境下(N浓度<200mg/l)，当氨氮浓度小于50mg/l时，24h内氨氮的去除率可达到95％以上，随着氨氮浓度的增加，氨氮的降解率开始下降，24h内的降解率保持在60％以上；从图3(b)中可以看出，在营养水平较高的环境下(N浓度≥200mg/l)，氨氮浓度在前48h内快速下降，之后下降速度极为缓慢，无法完全降解，可能是由于代谢产物积累积累过多、营养物质匮乏以及菌体开始进入衰亡期等因素造成的。
Zhang等，研究氨氮初始浓度对Bacillus methylotrophicus L7降解能力的影响，结果显示氨氮的去除效率随着氨氮浓度的增加而增加，初始浓度为78.75mg/L、427.44mg/L、1121.24mg/L的去除速率分别为11.08，41.22，90.95mg/d，但最终降解率偏低，分别为63.33％、46.43％、36.50％。Taylor等分离出一株Providencia rettgeriYL，研究表明，氨氮浓度为40和180mg/l时，去除率分别为98％和100％，该菌对氨氮浓度的最大耐受力为300mg/L。Chen等研究一株红球菌CPZ24，在氨氮浓度为50mg/L时，20h的去除率可达到100％。本研究中所用的真菌HL，表现出了较高的氨氮耐受性，并且去除率始终在65％以上，但需要进一步优化培养条件，以达到氨氮的完全去除的目的。
三、培养条件对菌株HL氨氮降解特性的影响
设计单因素方差实验，研究不同培养条件下(包括温度、pH、C/N、转速、碳源)，菌株HL的氨氮降解特性。
温度：温度设定为20、25、30、37、42℃，pH为7，C/N为10，140r/min培养。
pH：用1mol/L的HCl或NaOH将培养基的pH分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，C/N为10，温度37℃，140r/min培养。
C/N：氮源为硫酸铵，用葡萄糖将C/N比分别调整为5，10，15，20，pH为7，温度为37℃，140r/min培养。
转速：设定为40、70、120、150、180、200r/min，pH为7，温度为37℃培养。
碳源：氨氮初始浓度为50mg/L，C/N为10，分别向培养基中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠、柠檬酸钠、甘露醇、麦芽糖作为唯一碳源，其添加量分别为1.25，1.18，1.125，1.71，1.572，1.26，1.187g/l，pH为7，温度为37℃，140r/min培养。
上述处理组均培养24h后，采集培养液测定氨氮浓度。
如图4所示，在pH小于7条件下，菌株HL的氨氮降解率都在88％以上，表明菌株HL对pH的要求不严格，在酸性和中性的条件下能够很好的降解氨氮。
从图5可以看出，培养温度为25、30、37℃时，氨氮的降解率均保持较高水平，20℃时，氨氮的降解率明显下降，当经过一段时间后，降解率于37℃并无区别，说明较低的温度仅仅延迟了菌株HL的降解时间，但并不影响最终的降解结果。菌株HL对环境温度和pH要求不严格，有很强的适应能力，因此，菌株HL在实际应用中具有一定的应用潜力。
研究转速对菌株HL氨氮降解率的影响，结果如图6所示，40—150r/min范围内，随着震荡速度的增加，氨氮的去除率逐渐增加，但转速从150r/min增至200r/min时，氨氮的去除率出现下降趋势。
在C/N比为10的培养基中，研究不同碳源对菌株HL氨氮降解率的影响，结果表明(见图7)，不同的碳源对菌株利用氨氮的能力影响很大，细胞优先利用葡萄糖和麦芽糖进行生长代谢和氨氮氧化，其次是淀粉、蔗糖和乙酸钠，对甘露醇的利用率非常低，几乎不能利用柠檬酸钠。
图8所示，C/N比为10、20、40，氨氮在24h内的降解率均达到90％以上，只有在才C/N比为5时，氨氮的降解率才明显低于其他各组。
从上述可以看出，废水中比大于等于10、C源为葡萄糖或麦芽糖，且菌株培养转速为120-150r/min、培养温度为25、30、37℃时，降解效果最佳。
实施例3、菌株HL在抑制粪便氨气挥发中应用
菌株HL在实验室条件下，能够很好降解培养基中的氨氮，但实际应用当中，环境极其复杂、影响因素众多，该菌能够在实际粪便中发挥主导作用，以及对粪便的耐受程度，直接关系到其应用前景。为此，在实验室的条件下，就该菌株对粪便氨气抑制效果进行了验证。
称取鸡新鲜粪样100g放入1L烧杯中，将实施例1培养得到的HL菌丝悬浮液按体积百分含量5％的接种量与烧杯中的粪便样品充分混匀，以10ml无菌水作为空白对照，以0.01mol/L硫酸溶液作为氨气吸收液，在每个烧杯中放入装有20ml的吸收液的小烧杯。将大烧杯用6层保鲜膜密封，于室温下分别放置1、2、3、4d，随后测定氨气的发散量。实验设3个重复。
结果如图9所示，与对照组相比，接种5％菌液的实验组在粪便堆放期间能够有效抑制粪便氨气的散发量(菌体利用氨氮生长，同时抑制氨气产生)，抑制率最高可达79％，并且随着接种时间的增加，粪便氨气抑制率呈现升高趋势，表明菌株HL对外界复杂环境有良好的适应性，易于发挥优势作用。

Claims (9)

1.一株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为CGMCC No.9534。
2.权利要求1所述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解待测样品中氨氮的应用；
或权利要求1所述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解待测样品中氨氮的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待测样品为水或粪便，所述氨氮为硫酸铵。
4.权利要求1所述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在抑制粪便中氨气挥发中的应用；
或权利要求1所述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备抑制粪便中氨气挥发产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述粪便为畜禽粪便。
6.一种降解氨氮的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液接种在含有氨氮的样品和/或产品中，培养，实现降解氨氮。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1％的量接种在所述含有氨氮的样品和/或产品；
所述含有氨氮的样品和/或产品为水；
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
8.一种抑制粪便中氨气挥发的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液接种在粪便中，混匀后静置，实现抑制粪便中氨气挥发。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述粪便为畜禽粪便；
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1％的量接种在所述粪便中；
所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
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