CN104306648B - 龙血竭作为制备防治自身免疫性疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了龙血竭作为制备防治自身免疫性疾病药物中的应用,通过抑制Kv1.3通道功能而产生的自身免疫性疾病的治疗作用,所述的含有龙血竭的药物制成颗粒剂、片剂、硬胶囊、口服液、软胶囊或滴丸。本发明揭示龙血竭对自身免疫疾病的治疗作用,将极大克服肾上腺皮质激素等传统治疗药物的副作用,能够保持病人正常的免疫防御反应。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及龙血竭作为制备防治自身免疫性疾病药物中的应用。
背景技术
全球有5-8%的人口受到类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等约40种自身免疫疾病的严重威胁,传统治疗过程中使用的免疫抑制剂(肾上腺皮质激素等)同时削弱了病人正常的免疫防御反应。如何找到新的药物治疗靶点,使靶点药物在治疗自身免疫疾病的同时,维持机体的正常免疫反应,成为国际上医药产业新的研发热点。龙血竭是传统名贵中药,以往的研究表明龙血竭具有抑制激活的T淋巴细胞增殖效应,从而产生免疫抑制作用,提示了龙血竭治疗自身免疫疾病的潜在可能。由于龙血竭免疫调节作用的分子机制尚不清楚,截止目前,国内外尚未见龙血竭治疗自身免疫性疾病的报道。
传统治疗自身免疫疾病过程中,使用的免疫抑制剂(肾上腺皮质激素等)同时削弱了病人正常的免疫防御反应。T淋巴细胞膜上的Kv1.3型钾通道的发现为自身免疫疾病的治疗提供了特异性药物作用靶标。通过基因敲除或使用特异性阻断剂减弱Kv1.3通道功能,能够阻断TEM细胞的激活与增殖过程,有效改善自身免疫疾病模型动物的病理症状,而不影响模型动物对病毒、细菌等保护性免疫反应。既然以往的研究表明龙血竭具有抑制激活的T淋巴细胞增殖效应,从而产生免疫抑制作用,提示了龙血竭治疗自身免疫疾病的潜在可能,本专利研究拟考察龙血竭是否可以抑制哺乳动物Kv1.3型钾通道功能,从而对多种自身免疫性疾病产生治疗作用。这一研究结果有助于阐明龙血竭产生免疫调节作用的分子机制,将首次揭示龙血竭对自身免疫疾病的治疗作用。龙血竭通过抑制Kv1.3通道功能而产生的自身免疫性疾病的治疗作用,将极大克服肾上腺皮质激素等传统治疗药物的副作用,能够保持病人正常的免疫防御反应等。
发明内容
本发明旨在提供龙血竭作为制备防治自身免疫性疾病药物的应用,目的在于通过抑制Kv1.3通道功能而产生的自身免疫性疾病的治疗作用,将极大克服肾上腺皮质激素等传统治疗药物的副作用,能够保持病人正常的免疫防御反应。
本发明通过以下技术方案实现:
本发明提供了龙血竭作为制备防治自身免疫性疾病药物中的应用。
本发明龙血竭对于治自身免疫性疾病的防治通过抑制Kv1.3通道功能完成。
本发明所述的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫或病溃疡性结肠炎。
本发明所述的龙血竭可以加工成任何可以药物接受的剂型,优选制成颗粒剂、片剂、硬胶囊、口服液、软胶囊或滴丸。
本发明所述的龙血竭还可以和其它组分复配制成颗粒剂、片剂、硬胶囊、口服液、软胶囊或滴丸。
本发明所述的药物可以由使用者在使用前经稀释或直接使用,其配制可由通常的本领域技术人员公知的加工方法制备。
本发明的有益效果为:提供了龙血竭具有抑制Kv1.3通道的功能,从而应用于自身免疫性疾病治疗方面的用途。
附图说明
图1是龙血竭对HEK293T外源性Kv1.3通道的浓度依赖性抑制作用;
图2是龙血竭对Jurkat T细胞上内源性表达的Kv1.3通道浓度依赖性抑制作用;
图3是龙血竭抑制激活的Jurkat T细胞IL-2释放。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
本专利研究采用膜片钳实验检测龙血竭对哺乳动物Kv1.3通道功能的抑制作用;采用ELISA实验检测龙血竭对Jurktat细胞炎性因子IL-2释放的抑制;制作自身免疫性脑炎、类风湿性关节炎等动物模型,从整体水平检测了龙血竭对自身免疫性疾病动物模型的治疗作用。具体研究技术及结果如下:
实施例1 龙血竭对哺乳动物Kv1.3通道功能的抑制作用
Jurkat E6-1T细胞(ATCC TIB152)和HEK293T细胞(ATCC ACS4500)分别培养在添加有10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及DMEM培养基中(Life Technologies,GrandIsland,NY,USA),细胞放置在37℃和5%CO2培养箱中培养。将载体pSP64中编码mKv1.3通道蛋白的cDNA经XhoI/BamHI多克隆位点亚克隆到pIRES2-EGFP(Clontech,Inc.,MountainView,CA,USA)载体中。构建的克隆由DNA测序分析以确定其核苷酸序列的正确性。用Lipofectamine2000(Invitrogen)将构建的载体转染给HEK293T细胞,24小时后用于电生理学实验。实验中用于记录Kv1.3通道电流的细胞外液成分(mmol/L)为:5KCl,140NaCl,10Hepes,2CaCl2,1MgCl2,10D-glucose,用NaOH调节外液pH值为7.4。电极内液成分(mmol/L)为:140KCl,1MgCl2,1EGTA,3Na2ATP,10Hepes,用KOH调节pH值到7.2。
实验用药国产血竭由广州医药公司提供。其它实验用药均购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)。采用EPC10放大器系统进行全细胞膜片钳记录,环境温度维持在22-24℃,实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Patch master软件来控制,滤波器1设置为10kHz(Bessel),滤波器2设置为2.9kHz(Bessel)。石英玻璃毛胚管(BF150-86-10;Sutter公司,美国)经P-97拉制仪(Sutter公司,美国)水平拉制,充灌内液后电极电阻为2-4MΩ。
在电极与细胞膜之间形成高阻封接后,进行快电容自动补偿(c-fast),稍加负压破膜后,再行慢电容自动补偿(c-slow)和串联电阻补偿(R-series)。在全细胞电压钳记录模式下将细胞膜电位钳制在-60mV,每30秒钟给予400ms步长、+50mV的去极化方波刺激激活细胞膜上Kv1.3通道电流。采用全细胞电流钳技术,在钳制电流为0时,记录细胞膜电位的变化。
HEK293-T细胞株本身不表达Kv1.3通道,是研究外源性Kv1.3通道结构与功能的良好宿主细胞。本研究将构建的hKv1.3-IRES2-EGFP重组表达载体转染HEK293-T细胞,通过全细胞电压钳技术,将HEK293-T细胞膜电位钳制在-60mV,给予400ms步长、+50mV去极化脉冲刺激激活HEK293-T细胞膜上外源表达的Kv1.3通道电流,观察细胞外液中不同浓度龙血竭对重组表达的Kv1.3通道电流影响。
结果如图1所示,龙血竭对外源表达在HEK293-T细胞膜上的Kv1.3通道电流表现出较强的抑制作用,细胞外液中0.0005%的龙血竭就可以显著抑制Kv1.3通道电流,当细胞外液中龙血竭的浓度增加到0.005%,其对Kv1.3通道电流可以达到73.24%的抑制效果,龙血竭的效应可以部分洗脱。
电生理结果表明龙血竭对外源重组表达的Kv1.3通道具有浓度依赖性抑制作用,通过Hill方程对龙血竭的量效曲线进行拟合,得到其对外源重组表达的Kv1.3通道半数抑制浓度为(0.00072±0.000026%)。龙血竭可以抑制外源表达的Kv1.3通道功能,提示其对内源性表达的Kv1.3通道可能具有类似的抑制作用。
人源性JurkatT细胞株上主要表达两类钾通道:电压门控性Kv1.3通道及2型小电导钙激活钾通道(Small conductance Ca2+-dependent K+channel,SKCa2)。当维持电极内液自由钙浓度为0时,细胞膜电位钳制为-60mV,通过施加400m步长、50mV的去极化电压刺激,可以选择性激活JurkatT细胞膜上内源表达的Kv1.3通道电流。
在此实验条件下,龙血竭对JurkatT细胞膜上内源表达的Kv1.3通道电流表现为浓度依赖性抑制作用,细胞外液中0.0005%的龙血竭可以抑制34.9±12.9%的内源性Kv1.3通道电流,当龙血竭浓度提高到0.005%时,其对Kv1.3通道电流的抑制效应显著增加,抑制率达到73.6±9.5%,龙血竭的抑制作用可以部分洗脱,如图2所示。
实施例2 龙血竭对Jurktat细胞炎性因子IL-2释放的抑制
Jurkat T细胞膜上Kv1.3通道的开放引起细胞膜电位复极化,该复极化电位是维持细胞外钙离子持续内流的主要电势能。阻断Jurkat T细胞膜上Kv1.3通道电流,相应的会阻止细胞外钙离子内流,从而降低细胞内游离钙离子浓度。由Jurkat T细胞分泌的细胞因子IL-2受细胞内游离钙浓度的影响,细胞内游离钙浓度的降低会减弱炎性细胞因子IL-2的释放。既然龙血竭可以抑制Jurkat T细胞Kv1.3通道功能,引起细胞膜电位去极化,本研究拟观察龙血竭是否会抑制Jurkat T细胞炎性细胞因子IL-2的释放,这一结果将有助于解释龙血竭的免疫抑制作用。
本研究在细胞培养基中加入10μg/ml的植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)激活Jurkat T细胞24小时,通过ELISA实验检测培养基中Jurkat T细胞释放的炎性细胞因子IL-2浓度。
ELISA实验检测结果发现,10μg/ml的PHA可以激活Jurkat T细胞,显著增加细胞培养基中IL-2的浓度,没有PHA诱导的Jurkat T细胞培养基中IL-2浓度极低且无明显变化。在PHA诱导Jurkat T细胞的同时加入不同浓度的龙血竭(0.0005%和0.005%)培养细胞24小时,发现龙血竭可以浓度依赖性的抑制Jurkat T细胞IL-2的释放,这一实验现象与另外一种Kv1.3通道强效抑制剂CP339818类似,如图3所示。
实施例3龙血竭对自身免疫性疾病模型动物的治疗作用
1、自身免疫性脑炎模型的制作
实验动物选用6-8周龄昆明雄性小鼠。将100μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55(Sigma公司)用100μl的弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)乳化后,在小鼠的两侧腋下采用皮下注射进行免疫接种,同时将125ng的百日咳毒素(pertussis toxin,Sigma公司)进行腹腔注射,接种48小时后重复将125ng的百日咳毒素进行再次腹腔注射。小鼠每天监测临床EAE的症状和给出基于以下标准的临床得分:0,没病;1,尾部柔弱下垂;2,后肢无力;3,后肢麻痹;4,垂死;5,死亡。
将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠随机分为三组:正常对照组(阴性对照组)、模型对照组(模型鼠+生理盐水)、给药组(模型组+龙血竭),每组10只。给药组将龙血竭按20mg.kg-1剂量腹腔注射,每天固定时间1次(上午),正常对照组和模型对照组腹腔注射等量生理盐水,连续给药。给药14天后,观察小鼠患实验性自身免疫性脑脊髓膜炎状况,根据实验动物状况评分,记录每只动物最高临床评分,取它们的均值为平均临床评分,结果见表1。
表1 EAE模型中各实验组小鼠的评分(均数±标准差)
实验结果表明:在造模的第14天,各组实验中,模型对照组的平均临床评分最高,达到3.11±0.38,此数值远远高于龙血竭给药治疗组的1.05±0.29,动物实验表明龙血竭能够有效的治疗自身免疫性脑脊髓炎,显著改善实验动物的临床症状。
2、身免疫性类风湿性关节炎模型的制作
实验动物选用6-8周龄昆明雄性小鼠。将鸡Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,CII,Sigma公司)0.1μg用100μl的弗氏完全佐剂乳化后,于每只小鼠的右后足皮下注射致炎。小鼠造模后20天全部发病,观察关节肿胀情况,每4天评分一次,评分标准为:0分,无红肿;1分,小趾关节红肿;2分,趾关节和足趾肿胀;3分,踝关节以下的足爪肿;4分,包括踝关节在内的全部足爪肿胀。
将实验小鼠随机分为:正常对照组(阴性对照组)、模型对照组(模型鼠+生理盐水)、给药组(模型组+龙血竭),每组10只。给药组将龙血竭按20mg.kg-1剂量腹腔注射,每天固定时间1次(上午),正常对照组和模型对照组皮下注射等量生理盐水,连续给药。给药14天后,观察小鼠患实验性自身免疫性类风湿性关节炎状况,根据实验动物状况评分,记录每只动物最高临床评分,取它们的均值为平均临床评分,结果见表2.
表2 各实验组小鼠的关节炎评分(均数±标准差)
实验结果表明:在造模的第21天,各组实验中,模型对照组的平均临床评分最高,达到3.47±0.72,此数值远远高于龙血竭给药治疗组的1.55±0.29,动物实验表明龙血竭能够有效的治疗自身免疫性类风湿性关节炎,显著改善实验动物的临床症状。
Claims (2)
1.龙血竭作为唯一活性成分在制备防治自身性免疫性疾病药物中的应用,其特征在于,所述的自身免疫性疾病为自身免疫性脑脊髓炎。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物制成颗粒剂、片剂、硬胶囊、口服液、软胶囊或滴丸。
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"龙血竭治疗系统性红斑狼疮红斑皮损的临床疗效观察";薛文娟;《中国医疗美容》;20140615(第3期);第81-82页 * |
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