CN105267215B - 一种用于严重烧伤治疗的免疫调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于严重烧伤及脓毒症治疗的免疫调节剂；所述调节剂为化合物salubrinal(Sal)，其化学结构式为3‑PHENYL‑N‑[2,2,2‑TRICHLORO‑1‑[[(8‑QUINOLINYLAMINO)THIOXOMETHYL]AMINO]ETHYL]‑2‑PROPENAMIDE，CAS号：405060‑95‑9。本发明通过动物实验研究发现，Sal具有降低严重烧伤小鼠死亡率，减轻机体炎症状态，促进严重烧伤小鼠脾脏树突状细胞(dendritic cell,DC)的成熟分化，调节效应性T淋巴细胞功能状态，减轻效应T凋亡。所述的Sal能够通过上述作用缓解严重烧伤后免疫抑制状态，特别是细胞免疫抑制，进而达到改善严重烧伤小鼠预后，可以用于严重烧伤及其脓毒症并发症的治疗。

Description

一种用于严重烧伤治疗的免疫调节剂

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及salubrinal及其应用，更具体地，涉及salubrinal在制备治疗严重烧伤、感染、脓毒症药物中应用，所述salubrinal增加严重烧伤机体的生存率和减轻机体过度炎症反应，通过调节树突状细胞(DC)及T淋巴细胞功能状态，有效改善严重烧伤后机体免疫功能紊乱，缓解机体过度炎症反应。

背景技术

严重烧伤后往往休克发生早、程度重，患者处于烧伤应激、失血失液、组织缺血/缺氧等因素导致内外环境失稳态，加之创面感染，发生脓毒症(sepsis)的概率极高。脓毒症既能加重休克，又是休克期延迟复苏的严重并发症之一，进一步发展可导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，已成为当前烧伤外科提高严重烧伤患者救治成功率的主要障碍。脓毒症发病机制非常复杂，其病理过程可能涉及炎症、免疫、凝血、组织损害等诸多问题，其中，免疫功能障碍是脓毒症发生与发展的重要基础[01]。

长期以来对于严重创、烧伤应激状态下机体免疫功能障碍在MODS发生与发展中的地位认识不足，临床上缺乏切实有效的预警及调理措施[02]。实际上，在脓毒症发生、发展的过程中，我们认为始终存在着同时导致炎症反应亢进和免疫功能抑制的双重因素，针对脓毒症复杂的病理生理反应，仅仅抗炎治疗难以奏效，兼顾同时并存的免疫功能障碍可能是防治脓毒症、改善患者预后的发展方向 [03]。因此，进一步探索严重烧伤并发脓毒症时免疫功能紊乱机制及其可能的调控环节，在关键环节进行精确干预将有助于恢复机体正常的免疫应答状态，防止严重并发症的发生与发展，对提高急危重症的整体救治水平具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中重要细胞器，内环境稳定是实现其功能的基本条件。ER具有极强的内稳态体系，但仍然有很多因素可导致ER功能的内稳态失衡，导致大量错误或者未折叠蛋白质在内质网腔内聚集，激发ER与高尔基体、细胞核之间的信号转导，启动下游一系列应激反应的发生，即内质网应激(endoplasmicreticulum stress, ERS)。ERS反应对细胞功能状态及存活至关重要，在轻度ERS时，这些反应可及时恢复正常蛋白的合成加工，促进细胞存活，但当ERS反应过激ER功能稳态未能及时恢复，则增强促凋亡蛋白的合成，从而启动ERS相关凋亡途径的激活，诱导细胞凋亡，引起组织器官损害。严重烧伤、创伤后大量失血、休克及并发脓毒症等应激刺激均可导致机体内环境稳态失衡，组织细胞内外环境急剧改变，稳态被打乱，激发ERS反应，直接影响机体免疫细胞正常生理功能的发挥并激发各种炎症及损伤^[04]。病理条件下未得到有效控制的ERS诱导大范围细胞凋亡，对多种疾病包括神经退行性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、肾脏病等的发生发展均具有重要意义，已成为一个广受关注的关键致病因素^{[05, 06]}。研究表明ERS持续时间及应激水平对于免疫细胞的功能状态及凋亡也具有重要影响，与脓毒症免疫功能紊乱状态密切相关 ^[07-09]。我室前期实验结果亦表明，ERS对机体重要免疫调节细胞树突状细胞(dendritic cell, DC)功能状态具有重要影响^[10]，诱导ERS关键分子XBP-1基因沉默使重度烧伤小鼠死亡率明显升高(本室资料，待发表)。内质网相关细胞凋亡途径参与了脓毒症中免疫细胞凋亡机制^{[04, 11]}。

上述资料提示，ERS在严重烧伤、感染及脓毒症病生理过程中发挥着重要作用，细胞ERS反应状态对脓毒症发展及控制具有重要影响。本发明提供了一种化合物能通过缓解严重烧伤后机体免疫细胞中的过度ERS，调控细胞免疫功能状态，减轻机体免疫抑制，有效治疗严重烧伤及脓毒症并发症。

主要参考文献

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02.Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, et al. The sepsis seesaw:tilting toward immunosuppression. Nat Med, 2009, 15: 496-497.

03.林洪远, 脓毒症免疫调理治疗临床研究协作组. 乌司他丁、α1胸腺肽联合治疗严重脓毒症——一种新的免疫调理治疗方法的临床研究. 中华医学杂志, 2007, 87:451-457.

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06.Chakrabarti A, Chen AW, Varner JD. A review of the mammalianunfolded protein response. Biotechnol Bioeng, 2011, 108: 2777-2793.

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08.Saleh M, Mathison JC, Wolinski MK, et al. Enhanced bacterialclearance and sepsis resistance in caspase-12-deficient mice. Nature, 2006,440(7087): 1064-1068.

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发明内容

本发明的目的之一是提供一种化合物，通过调节机体细胞免疫反应，缓解严重烧伤引起的细胞免疫抑制，用于治疗严重烧伤及脓毒症。

本发明的另一目的是提供一种化合物，通过缓解严重烧伤时机体重要免疫细胞中的内质网应激(ERS)，调节树突状细胞(dendritic cell, DC)、效应性T淋巴细胞等的免疫功能状态。

本发明的另一目的是提供一种治疗严重烧伤及脓毒症的化合物，所述化合物为salubrinal (简称Sal，本文后继内容所述Sal均为本化合物)，其化学结构为3-PHENYL-N-[2,2,2-TRICHLORO-1-[[(8-QUINOLINYLAMINO)THIOXOMETHYL]AMINO]ETHYL]-2-PROPENAMIDE，CAS号：405060-95-9。

本发明通过上述Sal干预严重烧伤小鼠模型，结果显示所述的Sal能够够明显增加严重烧伤小鼠模型的生存率，分别于伤后1小时(hour, h)、6 h腹腔注射给予1 mg/kg的Sal治疗，可明显增加小鼠伤后7天的生存率，以伤后6 h给予Sal干预效果更为明显；伤后6 h给于低浓度(0.2mg/kg )Sal干预保护作用不显著。

本发明通过上述Sal治疗严重烧伤小鼠模型，结果显示所述的Sal能够够明显减轻严重烧伤小鼠机体炎症状态，于伤后6 h腹腔注射给予Sal治疗(1mg/kg)可明显降低血浆中早期炎症介质(TNF-α、IL-12)及晚期炎症介质(HMGB1)水平。

本发明通过上述Sal治疗严重烧伤小鼠模型，结果表明Sal能够改善体内最强抗原提呈细胞——DC的功能状态，尤其是于伤后6h腹腔注射给予Sal治疗(1mg/kg)可明显上调DC表面标志物CD80、CD86、MHC-II表达水平，改善DC分泌功能；减轻严重烧伤诱导的DC凋亡水平；改善DC对效应性T细胞的免疫调节能力。

本发明通过上述Sal治疗严重烧伤小鼠模型，结果表明Sal能够促进小鼠脾脏效应性T淋巴细胞IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌，诱导CD4⁺ T由Th2功能极化向Th1方向漂移，纠正严重烧伤小鼠机体免疫抑制状态。

根据本发明的实施例，本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持药物活性即可。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是干粉。

根据本发明的实施例，所述药物还包含药学可接受的辅助剂。具体地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持药物活性即可。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1：Sal处理对严重烧伤小鼠生存率的影响分别于伤后1 h、6 h腹腔注射给予Sal干预(1mg/kg，图中标注为Sal1、Sal6)，或者伤后6 h给于不同浓度Sal干预(Sal-L：0.2mg/kg；Sal-H：1mg/kg)均可增加严重烧伤小鼠的7天生存率；尤以伤后6 h给予Sal (1mg/kg)干预保护作用显著，低剂量Sal干预保护作用不明显。

图2：Sal处理对严重烧伤小鼠机体炎症状态的影响伤后6h给予Sal (1mg/kg)腹腔注射，可明显减轻小鼠体内炎症状态，血浆中早期炎症介质(TNF-α、IL-12)水平在伤后1天(PBD1)有明显降低；晚期炎症介质(HMGB1)水平在PBD1-3均有明显降低。

图3：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC中ERS相关分子表达/活化的影响 伤后1 h、6h给予Sal(1mg/kg)干预，可以显著降低烧伤小鼠脾脏DC中ERS标志性分子GRP78、CHOP蛋白表达水平及caspase-12活化水平。

图4：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC功能状态的影响 (PBD1) 伤后1 h及伤后6 h给予Sal (1mg/kg)腹腔注射均可促进DC成熟分化，伤后6 h给予Sal干预可明显上调DC表面标志物表达水平。

图5：Sal干预对严重烧伤小鼠脾脏DC功能状态的影响 (PBD3) 伤后1 h及伤后6 h给予Sal (1mg/kg)腹腔注射均可促进DC成熟分化，伤后6 h给予Sal干预可明显上调DC表面标志物表达水平。

图6：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC分泌功能的影响 严重烧伤后给予Sal干预可促进DC成熟分化，分泌TNF-α、IL-12水平明显提高(PBD3)。

图7：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC免疫调节功能的影响 模型小鼠脾脏DC与正常小鼠脾脏CD4⁺T共培养，严重烧伤后Sal干预可促进DC成熟分化，诱导效应性T细胞活化作用显著增强。

图8：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC凋亡的影响 严重烧伤后给予Sal干预可减轻烧伤诱导的DC凋亡，PBD1及PBD3均有明显保护作用。

图9：Sal对严重烧伤小鼠脾脏CD4⁺T细胞凋亡的影响 严重烧伤后给予Sal干预可减轻烧伤诱导的效应T细胞凋亡，PBD1、PBD3均有明显保护作用。

图10：Sal对严重烧伤小鼠脾脏CD4⁺T细胞活化的影响 严重烧伤后给予Sal干预可诱导T细胞活化，IL-2、IFN-γ分泌增加；IL-4、IL-10分泌明显降低。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明以下实施例所述的salubrinal(Sal)，其结构为：3-PHENYL-N-[2,2,2-TRICHLORO-1-[[(8-QUINOLINYLAMINO)THIOXOMETHYL]AMINO] ETHYL]-2-PROPENAMIDE，CAS号：405060-95-9。

实施例1：Sal对严重烧伤小鼠模型生存率的影响

1．实验动物和主要试剂

雄性BAL B/c小鼠，6-8w，20±2g，购自中国医学科学院实验动物研究所（动物合格证号：SCXK京2009-0007）。适应性饲养1周，自由进食水，室温25 ℃，昼夜节律为12 h。

麻醉用药：盐酸氯胺酮注射液(上海第一生化药业公司，中国)－速眠新Ⅱ注射液（军事医学科学院军事兽医研究所研制，中国）与0.9%生理盐水(山东鲁欣药业集团，中国)按2:2.5:4.5体积比混合后使用。

Sal (购自Tocris Bioscience公司，美国)：10 mg/支，将Sal溶于5 mL DMSO内，充分溶解后4℃保存，2周内用完。用前以0.9%生理盐水稀释20倍，充分混匀后获得0.1 mg/mL悬浊液；取部分0.1mg/mL悬浊液继续稀释5倍，充分混匀后获0.02mg/mL悬浊液。

2.给药方法：

①麻醉药物按照2ml/kg方式后肢外侧肌肉麻醉。②假伤组以及严重烧伤小鼠模型均于造模完成后经耳后皮下注射0.9%生理盐水 (40ml/kg)进行补液。③Sal干预组分别于制模后1 h或6 h按体重给于Sal 1次(10 ml/kg)，假伤组给于同等体积的生理盐水。采用腹腔注射给药方式。

3.实验步骤：

雄性BALB/c小鼠分为以下几组：假伤组、烧伤组以及Sal干预组(包括伤后1 h给药组、伤后6 h给药组以及Sal低剂量干预组)，假伤组8只，其余各组32只。按照常规方法制作15%体表面积的深及全层皮肤的严重烧伤小鼠模型(背部浸入98 ℃热水，8 s)，假伤组操作相同，浸入37℃温水；按照相应体重给予药物。放回鼠笼内，给予充足食水，保持室温25℃。每12h观察一次小鼠生存情况，共观察至烧伤后7天 (PBD7)。Sal对严重烧伤小鼠生存率的影响见图1。

4．结果评价：

伤后1 h、6 h腹腔注射给予Sal(1mg/kg)干预能够提高严重烧伤小鼠生存率，尤以伤后6 h给予1mg/kg Sal保护效果最为明显，PBD7烧伤小鼠生存率为 46.88%；Sal干预组(伤后6 h给药)生存率为 71.88%。低浓度Sal干预(0.2mg/kg )保护作用不够显著。

实施例2：Sal对严重烧伤小鼠机体炎症状态的影响

1.实验动物和主要试剂

本实施例中所用小鼠及Sal同实施例1。TNF-α、IL-12 ELISA试剂盒：北京达科为生物技术有限公司，中国；HMGB1 ELISA试剂盒：Shino-Test 公司，日本。

2.实验步骤：

① 严重烧伤小鼠模型的复制及Sal用药同实施例1中所述。② 分别于烧伤后1天、3天给小鼠摘除眼球采血后分离血清，-30℃保存。③ 样本收集齐全后，按ELISA试剂盒操作说明对血清中TNF-α、IL-12和HMGB1等炎症因子水平进行检测。

Sal干预对严重烧伤小鼠血清中炎症因子水平的影响如图2所示。

3.结果评价：

伤后6 h给予Sal (1mg/kg)腹腔注射，可明显减轻小鼠体内炎症状态，血浆中早期炎症介质(TNF-α、IL-12)水平在伤后1天(PBD1)有明显降低；晚期炎症介质(HMGB1)水平在PBD1-3均有明显降低。

实施例3：Sal处理对严重烧伤小鼠脾脏DC功能状态的影响

1.实验动物和主要试剂

本实施例中所用小鼠及Sal同实施例1。

小鼠CD11c分离试剂盒、小鼠CD4⁺T分离试剂盒：Miltenyi Biltec GmbH公司，德国； 小鼠ELISpot( IL-12/IL-23 p40、TNF-α)、Dual-color ELISPOT试剂盒(IL-4/ IL-10、IFN-γ/ IL-2)：R＆D Systems公司，美国；抗小鼠FITC-CD80、PE-CD86、FITC-MHC-II：Miltenyi Biltec GmbH公司，德国；兔抗小鼠GRP78抗体、兔抗小鼠CHOP抗体：EPITOMICS 公司，美国；兔抗小鼠caspase-12抗体：Cell-signaling Technology公司，美国。

2.实验步骤：

① 严重烧伤小鼠模型的复制及Sal用药同实施例1中所述。② 小鼠烧伤1天后断颈处死，留取脾脏组织，切碎研磨、200目钢筛过滤后淋巴细胞分离液分离单个核细胞，免疫磁珠法分离其中的DC，提取细胞内总蛋白，经高温变性后用于Western blotting分析。③小鼠烧伤1天、3天后断颈处死，留取脾脏组织，分离获取其中的DC后，每组样本分为三份，每份约含5×10⁵细胞，分别与抗小鼠FITC-CD80、PE-CD86、FITC-MHC-II抗体共孵育，上流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。④ 小鼠烧伤1天后断颈处死，留取脾脏组织，分离获取其中的DC后，调整各组样本中细胞数达1×10⁶细胞/mL，取细胞悬液接种于IL-12 p40、TNF-αELISpot孔板(100 μL/孔)，各组设重复孔3个，37℃孵育24 h后，按试剂盒说明进行显色及检测。⑤ 免疫磁珠法提取正常小鼠脾脏CD4⁺ T细胞，ConA刺激18 h，调整细胞浓度为2×10⁶细胞/mL，与烧伤小鼠脾脏DC按150:1的比例混合均匀，接种于IL-4/ IL-10、IFN-γ/ IL-2Dual-color ELISPOT板(100 μL/孔)，各组设重复孔3个，37℃孵育24小时后，按试剂盒说明进行显色及检测。

Sal对严重烧伤小鼠脾脏DC中ERS相关分子表达/活化水平的影响见图3；Sal对严重烧伤小鼠脾脏DC功能状态的影响见图4-7。

严重烧伤刺激引起脾脏DC中ERS相关分子GRP78、CHOP表达上调、caspase-12活化水平增加，Sal干预可减轻烧伤诱导的ERS相关分子表达/活化水平的上调。相应地，烧伤刺激导致脾脏DC成熟分化异常，Sal干预改善DC功能状态，促进DC成熟分化，使DC表面标志物分子表达上调(图4、图5)、分泌功能增强(图6)；对效应T细胞免疫调节能力增强、诱导T向Th1方向分化(图7)。

3.结果评价：

Sal干预减轻严重烧伤小鼠脾脏DC中ERS反应水平，有效改善DC功能状态，促进DC成熟分化，增强其免疫调理能力。

实施例4：Sal干预对严重烧伤小鼠脾脏DC凋亡的影响

1.实验动物和主要试剂

本实施例中所用小鼠及Sal、小鼠CD11c分离试剂盒同实施例3。Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（100 test,内含1 ml Annexin-Ⅴ-PE、500 μl 7-AAD以及bindingbuffer 80ml）BD公司，美国。

2.实验步骤：

① 严重烧伤小鼠模型的复制及Sal用药同实施例1中所述。② 小鼠烧伤1天后断颈处死，留取脾脏组织，切碎研磨、200目钢筛过滤后淋巴细胞分离液分离单个核细胞，免疫磁珠法分离其中的DC，调整细胞浓度，与Annexin-Ⅴ-PE、7-AAD共孵育，室温15 min，上流式细胞仪检测DC凋亡情况。

Sal干预对烧伤小鼠脾脏DC凋亡的影响见图8所示。PBD1即有脾脏DC明显凋亡，Sal干预可减轻烧伤模型小鼠脾脏DC的凋亡水平，在伤后1天、3天均可看到Sal减轻DC凋亡的保护效应。

3.结果评价：

Sal干预可减轻严重烧伤诱导的脾脏DC凋亡，作用明显。

实施例5：Sal干预对严重烧伤小鼠脾脏CD4⁺T功能状态的影响

1.实验动物和主要试剂

本实施例中所用小鼠及Sal、CD4⁺T分离试剂盒、Dual-color ELISPOT试剂盒(IL-4/ IL-10、IFN-γ/ IL-2)同实施例3；Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒同实施例4。

2.实验步骤：

① 严重烧伤小鼠模型的复制及Sal用药同实施例1中所述。② 小鼠烧伤1天后断颈处死，留取脾脏组织，切碎研磨、200目钢筛过滤后淋巴细胞分离液分离单个核细胞，免疫磁珠法分离其中的CD4⁺T。③ 取各组细胞约5×10⁵与Annexin-Ⅴ-PE、7-AAD共孵育，室温15min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。④ 各组细胞均调整细胞浓度为2×10⁶细胞/mL，按100 μl/孔的量接种于ELISpot板中，每份样本设三个复孔。Sal干预对烧伤小鼠脾脏T细胞活性的影响见图9、图10所示。烧伤后脾脏CD4⁺T发生明显凋亡，特别是伤后1天。Sal干预可显著减轻烧伤小鼠脾脏T的凋亡水平 (图9)。烧伤小鼠脾脏CD4⁺T分泌IL-4、IL-10水平增加(图10)，向Th2方向分化。Sal干预可改善烧伤小鼠T细胞功能抑制状态，降低CD4+T分泌IL-4、IL-10分泌水平、提高IFN-γ/ IL-2 分泌水平。

3.结果评价：

Sal干预可减轻烧伤诱导的T细胞凋亡、促进T细胞向Th1方向分化，改善机体免疫功能抑制状态。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种非诊疗目的的促进离体DC成熟分化的方法，其特征在于，所述方法包括施用salubrinal促进离体DC成熟分化，所述salubrinal的化学结构为3-苯基-N-[2,2,2-三氯-1-[[8-喹啉基氨基)硫代甲基]氨基]乙基]-2-丙烯酰胺。