CN102028689B - 一种治疗急性淋巴白血病的复方药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然药物领域，公开了一种治疗急性淋巴白血病的复方药物组合物，其特征是该复方药物组合物含6-姜烯酚和Salubrinal。6-姜烯酚和Salubrinal组合物可在低剂量配伍时产生6-姜烯酚高剂量下的生物学效应，从而可以大大降低6-姜烯酚的临床使用剂量，减少潜在的毒副作用产生，提高临床治疗安全指数，具有良好的临床用药开发前景。

Description

一种治疗急性淋巴白血病的复方药物组合物
技术领域
本发明涉及天然药物领域，公开了一种含6-姜烯酚、Salubrinal的复方药物组合物及其医药用途。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种严重危及生命的进行性恶性疾病，ALL占儿童急性白血病的80％，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20％。近年儿童ALL的无瘤生存率(DFS)已达80％以上[减少蒽环类抗生素使用剂量和头部放疗可以改善小儿急性淋巴白血病的治疗：来自急性淋巴白血病-BFM 90的临床报道(德国-澳大利亚-瑞士急性淋巴白血病研究联合中心).Blood，2000，95(11)：3310-3322.StJude儿童医院对11，12和13A型小儿急性淋巴白血病的长期治疗结果.Leukemia，2000，14(12)：2286-2294.通过延迟化疗强度改善香港小儿急性淋巴白血病治疗：HKALL 97的研究。Hong Kong Med J，2006，12(1)：33-39.]，但长期随访发现一些存活患者有长远后遗症，如心脏病、脑瘤等[放疗和化疗后诱发脑肿瘤的高发生率.Lancet，1999，354(9172)：34-39.]，严重影响了患者的预后生活质量。目前化疗仍然公认是急性白血病的主要治疗手段，传统化疗药物包括烷化剂、抗代谢药、抗生素类以及从植物中提取的生物碱类。但这些化疗药物除了杀伤白血病细胞，同时常常对正常细胞、组织也有比较严重的毒性损伤。绝大部分急性白血病患者在化疗过程中，会产生不同程度的消化道黏膜损害，心脏毒性、肾毒性等多系统毒副作用。随着近年白血病的研究和对患者的预后生存质量等因素的综合评价，人们开始迫切寻求高效低毒、安全性好、来源广泛、复发率低的白血病治疗药物。近年来，从具有雄厚临床基础的中草药中发现有效的抗癌成分及其有效组方成为新的热点之一。
6-姜烯酚(6-shogaol，简称6S)是常用中药生姜和干姜根茎中的挥发成分之一，其分子式为：C17H24O3，分子量为：276.37，为黄色粉状物或结晶物，易溶于乙醇，难溶于水。最近，文献报道6-姜烯酚对人卵巢癌SK-OV-3细胞、人黑色素瘤SK-MEL-2细胞、人结肠癌HCT15、COLO 205细胞和[干姜的细胞毒性成分.Arch Pharm Res 2008，31：415-418.6-姜烯酚通过ROS产生，Caspase激活和GADD153表达诱导结肠癌细胞凋亡.Mol Nutr FoodRes.2008，52，527-37.]及人肺癌A549细胞有一定抗肿瘤活性[干姜中活性成分6-姜烯酚通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自我吞噬.JAgric Food Chem.2009Oct2.]，但其活性均不强，如抑制COLO 205细胞生长的IC50＞60μM。同时，Suekawa M报道了6-姜烯酚在ddY系小鼠上的急毒实验，其静脉注射LD50约为50.9mg/kg，腹腔注射LD50约为109.2mg/kg，口服LD50约为687mg/kg[6-姜烯酚和6-姜酚的药理学研究I.J Pharmacobiodyn.1984，7(11)：836-48.]，说明6S具有非常好的安全性。又有Suzanna M.Zick研究了含5％总姜酚的姜提取物在健康志愿者身上口服耐受性试验，结果表明该类化合物吸收迅速，60min左右达到Tmax，代谢主要以葡萄糖醛酸苷和或硫酸盐形式，消除半衰期不到2小时，单次口服耐受剂量的可高达2g，并且副作用远未达到美国国家癌症研究所的一般毒性标准1级(第二版)的要求[6-姜酚，8-姜酚，10-姜酚和6-姜烯酚及组合物在健康人群中的药代动力学研究.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2008，17(8)：1930-1936.]，说明姜酚类化合物口服非常安全，同时也说明了6S毒副作用很小。但是，至今鲜有将该化合物用于抗白血病治疗研究的报道，本课题组前期证实了6S在人白血病U937、Jurkat和HL-60细胞株上具有良好的抗急性白血病作用[6-S治疗宫颈癌、白血病和乳腺癌的医药用途，中国发明专利公开号：101721397A]。
结构式I化合物为白色或灰白色粉状物，命名：Salubrinal(简称Sal)其分子式为：C21H17Cl3N4OS，分子量为：479.8：
Figure BDA0000037289740000021
易溶于二甲基亚砜(10mg/ml)，难溶于水。Sal是已经被证实了可通过选择性地诱导eIF-2α磷酸化和抑制其去磷酸化对抗内质网应激诱导的细胞凋亡，其对衣霉素诱导的嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡起保护作用，在最大细胞保护浓度(TD50＞100μM)时无任何细胞毒性作用，且其不保护与内质网应激无关的细胞凋亡刺激。此外，Salubrinal对细胞凋亡的保护作用并不只是诱导eIF-2α磷酸化和抑制eIF-2α去磷酸，还可以保护细胞免受布雷菲得菌素A通过，阻断内质网到高尔基囊泡运输导致的内质网应激。最近，Sal被证实能通过抑制eIF-2α去磷酸化而对缺血再灌注损伤的脑组织起到保护作用及无不良毒副作用。鉴于Sal的特异性和良好安全性，使它成为研究内质网应激的工具和可能的抗细胞凋亡治疗药物[通过eIF2alpha去磷酸化保护内质网应激的专一抑制剂.Science.2005，307(5711)：935-939.内质网应激在小鼠大脑局部缺血/再灌注模型中具有重要作用.Neurotox Res.2010，17(2)：189-202.]。
发明内容
本发明公开了一种6-姜烯酚和Salubrinal的复方药物组合物，药理试验证明该复方药物组合物具有协同抗急性淋巴白血病生物学效应。
本发明同时也提供了一种治疗急性淋巴白血病的方法，即施用治疗有效量的6-姜烯酚和Salubrinal组合物，该治疗方法可用于包括人在内的哺乳动物。
发明人在对6-姜烯酚药理活性作用机制研究中发现，发现eIF2alpha的去磷酸化选择性抑制剂Salubrinal(Sal)和6-姜烯酚(6S)具有很好的协同抗白血病细胞的疗效。发明人所在课题组采用人急性T细胞白血病细胞Jurkat进行体外MTT测定和流式细胞仪检测细胞凋亡率(Annexin V/PI双染法)评价，发现Sal单独作用白血病Jurkat细胞时，在80μM浓度下不影响白血病Jurkat细胞增殖；6S单独作用时(0，2.5，5，10，15，20，30μM)具有很强的抗Jurkat细胞增殖效应并呈良好时效和量效依赖性，且在同等剂量下不影响人正常肝细胞L-O2生长。当我们按一定比例组合Sal和6S时，发现Sal可显著地提高6S的抗Jurkat细胞增殖效应和促进细胞凋亡或死亡。这些结果说明Sal和6S组合物可在低剂量配伍时产生6S高剂量下的生物学效应，从而可以大大降低6S的临床使用剂量，减少潜在的毒副作用产生，提高临床治疗安全指数，具有良好的临床用药开发前景。
Salubrinal和6-姜烯酚的摩尔比优选1∶3～6∶1。
Salubrinal和6-姜烯酚的摩尔比优选1∶3～2∶1。
以下结合实施例对Sal和6S组合物的药理活性做进一步阐述。
附图说明
图1为MTT检测不同浓度6-姜烯酚在不同时间下作用Jurkat细胞的生长活力影响
图2为不同浓度的Salubrinal单用和6-S 15uM联合使用对Jurkat细胞生长活力的影响(注：与Sal组比较，※p＜0.01；与单用6S组比较：#p＜0.05，△p＜0.01)
图3为5μM Salubrinal和不同浓度6-S(2.5，5，10，15μM)组合后作用3，6，12和24小时后对Jurkat细胞生长活力影响(注：与Sal组比较，※p＜0.01；与单用6S组比较：#p＜0.05，△p＜0.01)
图4为5μM的Salubrinal和不同浓度的6-S组合后作用6和12小时间后诱导Jurkat细胞凋亡情况(注：与Sal组比较，※p＜0.01；与单用6S组比较：#p＜0.05，△p＜0.01)
具体实施方式
实施例1
6-姜烯酚的体外抗白血病作用
取对数生长期的细胞，接种3×104个细胞/孔于96孔板上，待生长4-6小时后，然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药组和加药组(浓度2.5～30μM)，每组设5或6个复孔，其中Salubrinal预处理1-2小时后再加入6-姜烯酚培养6，12和24小时，加入20μl含0.5mg/ml的MTT(四氮唑盐)培养4小时，加入100μl三联液(10％SDS，5％异丁醇，0.012mol/L HCL)过夜(或者DMSO 4小时后检测)；放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上570nm处检测OD值。每次实验重复3次。结果见图1。
表16S单用或联合5μM Sal作用Jurkat细胞株24小时的IC50结果(n＝3，)
从表1和图1可看出6-姜烯酚对人急性T细胞白血病细胞Jurkat的24小时作用的IC50＜10μM说明6-姜烯酚具有较好的抗Jurkat细胞增殖作用。图1为在不同化合物浓度下(2.5，5，10，15，20，30μM)对Jurkat作用6，12，24小时和作用L-O2细胞株24小时后的细胞活力情况，结果提示，随着化合物的浓度增加，与相应不加化合物的对照组比较，Jurkat细胞活力明显下降，说明6-姜烯酚呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖；而不抑制正常肝细胞系L-O2细胞的增殖。此外，我们发现联合5μM Sal后，6S的24小时IC50降低到了3.7μM，预示6S和Sal组合物具有良好的协同效应。
上述实验结果表明，说明6-姜烯酚具有优效的抗Jurkat细胞增殖作用及良好的时效和量效关系，同时对正常肝细胞L-O2细胞具有低毒的特性。
实施例2
不同浓度的Salubrinal单用或联合15μM的6-姜烯酚对Jurkat细胞活力影响
取对数生长期的Jurkat细胞，按实施例1里面的方法处理，对不同浓度的Salubrinal(5，10，20，40，80μM)单用或联合15μM的6-S作用细胞12和24小时后(摩尔比为1∶3-6∶1)，MTT评价细胞活力。结果见图2。
从图2我们可以获得80μM浓度以下的Salubrinal对白血病Jurkat细胞无任何细胞毒作用，当跟15μM的6-姜烯酚联合作用时，具有显著性增加细胞毒作用，抑制细胞生长。同时，我们发现Salubrinal与15μM的6-姜烯酚联合作用时无浓度依赖性。这提示我们使用低浓度的Salubrinal可以协同6-姜烯酚抑制白血病细胞增殖。
实施例3
5μM的Salubrinal和不同浓度的6-S组合作用不同时间对白血病Jurkat细胞活力影响
根据实施例3的研究基础，我们采用单用5μM的Salubrinal和或不同浓度(2.5，5，10，15μM)的6S组合(摩尔比为2∶1-1∶3)作用3，6，12和24小时后对白血病Jurkat细胞活力进行分析，同样采用实施例1中的MTT检测细胞活力变化，结果见图3。
从图3的结果表明，5μM的Salubrinal和不同浓度(2.5，5，10，15μM)的6S组合物比单用6S的细胞活力减少更为显著，提示5μM的Salubrinal跟不同浓度(2.5，5，10，15μM)的6S具有明显协同效应。
为了进一步确证上述抑制增殖效应，我们通过流式细胞仪双染法检测5μM的Salubrinal和或不同浓度(10，15μM)的6S作用Jurkat细胞6和12小时的凋亡率，结果见图4。检测结果表明，Sal协同6S通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现抑制白血病细胞增殖。这也进一步证明了Sal和6S的复方组合物具有临床治疗的潜力。
实施例4
片剂
将药物和辅料分别过80目筛，将277.5克Salubrinal与48克微晶纤维素和12克羧甲基淀粉钠充分混合，10％淀粉浆制软材，18目筛制粒，60℃下干燥，得颗粒1。将107.5克6-姜烯酚与24克微晶纤维素、15克淀粉和8克羧甲基淀粉钠充分混合，10％淀粉浆制软材，18目筛制粒，60℃下干燥，得颗粒2。按等量递增原则，将颗粒1和颗粒2充分混合，16目筛整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，片重500mg。
实施例5
软胶囊
将300克聚乙二醇400加热至50℃，17.5克聚维酮缓慢搅拌加入混合均匀，再加入60克Salubrinal和103克6-姜烯酚，搅拌均匀至溶液澄清，形成均匀稳定的药液。将药液引入软胶囊压丸机，按照常规的软胶囊制备方法制备成软胶囊。

Claims (3)

1.一种治疗急性淋巴白血病的复方药物组合物，其特征是：含式I化合物和6-姜烯酚及药学上可接受的载体
Figure FDA0000108974650000011
其中式I化合物和6-姜烯酚的摩尔比为1∶3～6∶1。
2.权利要求1的复方药物组合物，其中式I化合物和6-姜烯酚的摩尔比为1∶3～2∶1。
3.权利要求1的复方药物组合物用于制备治疗急性淋巴白血病的药物的用途。
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