CN108371659B - 用于治疗自身免疫性疾病的柠檬苦素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及柠檬苦素在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，其中所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构，其中R选自任选羟基化的烷基。本发明进一步涉及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞17分化的药物中的应用，以及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞分化的药物中的应用。筛选用以抑制Th17,Th1,Th2和Treg中的一种或多种的细胞的物质的方法，其可用于治疗自身免疫性疾病。本发明的柠檬苦素化合物能够抑制Th17细胞、Th1、Th2细胞和/或Treg细胞的分化。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗患有自身免疫性疾病的受试者，其中受试者特别是人类的治疗方法。自身免疫性疾病尤其优选地(但并不局限于)包含系统性红斑狼疮、多发性硬化症和类风湿性关节炎等。所述方法包含给予受试者有效量的柠檬苦素的治疗步骤。本发明进一步涉及抑制T辅助细胞17(Th17)、T辅助细胞1(Th1)、T辅助细胞2(Th2)和/或调节性T细胞(Treg)的分化的方法以及筛选用以抑制Th17,Th1,Th2和Treg细胞中的一种或多种的分化的物质的方法，其可用于治疗自身免疫性疾病。
背景技术
当人体免疫系统错误地攻击和破坏自身时，就会发生自身免疫性疾病。目前有多达80种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)，它们是最常见的自体免疫性疾病之一。自身免疫性疾病是全球性问题，严重地影响着人们的身心健康。由于目前没有有效根治的治疗手段，目前针对自身免疫性疾病的治疗主要是缓解症状。许多证据表明，过度活化的T细胞是导致自身免疫性疾病的主要原因。T细胞可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，而CD4+T细胞又可分化为Th1、Th2、Th17和Treg等细胞亚群。其中Th17细胞被认为是自身免疫性疾病的发生与发展的主要调控者。因此，抑制Th17被认为是一种治疗自身免疫疾病的新策略，主要有两条途径，一是抑制Th17细胞的特征细胞因子白介素17(IL-17)的产生，二是抑制Th17细胞的主要转录因子类视黄醇相关的孤儿受体(ROR)-γt的表达。
柠檬苦素类化合物是一类三萜类衍生物，广泛分布在芸香科、楝科植物中。据报道，柠檬苦素类化合物对昆虫具有广泛的生物活性，包含杀虫、抗虫和生长调节等，对人类也具有一系列的药理活性，包含抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用。
现时自身免疫性疾病的发病率仍在上升，而且治疗方案也很有限，因此迫切需要进一步的方法、药物和化合物来治疗自身免疫性疾病。该方法、药物和化合物优选能够在治疗这些疾病的同时降低副作用的风险。相应的化合物也应该容易获得。
发明内容
本发明的第一个方面涉及到柠檬苦素在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，优选地该药物应用于人类。所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构：
优选地，R选自任选羟基化的烷基。
具体地，所述柠檬苦素包含选自式(II)至式(V)表示的一个结构：
本发明的应用可用于治疗自身免疫性疾病，该自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、多发性硬化症或类风湿性关节炎。
具体地，所述柠檬苦素抑制来源于初始CD4+T细胞的T辅助细胞和/或调节性T细胞的分化，即柠檬苦素能抑制T辅助细胞和/或调节性T细胞的分化。
本发明的另一方面涉及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞17分化的药物中的应用。优选地，所述药物应用在CD4+T细胞上。所述柠檬苦素包含式((I)表示的结构：
优选地，R选自任选羟基化的烷基。
柠檬苦素尤其降低ROR-γt蛋白的表达，即本发明的应用可抑制降低ROR-γt蛋白的表达。在另一实施例中，柠檬苦素减少白介素17(IL-17)的产生，即本发明可通过减少IL-17的产生来抑制T辅助细胞17的分化。
本发明的另一方面涉及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞中一种或多种的分化的药物中的应用。所述药物可用于初始CD4+T细胞，如使药物与有效剂量的柠檬苦素接触。优选地，所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构：
优选地，R选自任选羟基化的烷基。
优选地，柠檬苦素减少INF-γ的产生、IL-4的产生和/或Foxp3的产生中的一种或多种，能够抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞中的一种或多种的分化。
本发明的另一方面提供筛选用以抑制T辅助细胞17、T辅助细胞1、T辅助细胞2和/或调节性T细胞分化中的一种或多种的物质的方法，该物质可用于治疗自身免疫疾病，该方法包含以下步骤：
(i)对物质进行测定；
(ii)检测该物质是否能抑制T辅助细胞17、T辅助细胞1、T辅助细胞2和/或调节性T细胞中的一种或多种的分化。
本发明为自身免疫疾病提供了非常有利和可行的治疗选择，即减轻炎性淋巴细胞功能。具体而言，本发明人意外地发现柠檬苦素化合物A、B、C和D(或称为Amotsangin A,B,C和D)能够抑制来源于小鼠的CD4+T脾细胞的T辅助细胞17(Th17)细胞的分化且没有细胞毒性作用。本发明人证明柠檬苦素化合物A，B，C和D能够通过减少ROR-γt萤光素酶活性和减少ROR-γt蛋白表达来抑制Th17细胞的分化。本发明人进一步发现了柠檬苦素化合物B和柠檬苦素化合物C对T辅助细胞1的分化具有抑制作用；柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对T辅助细胞2的分化具有抑制作用；柠檬苦素化合物C调节性T细胞的分化具有抑制作用，这些细胞是通过各自的标记物IFN-γ、IL-4和/或Foxp3确认的。
本领域技术人员将会理解，除了具体描述的这些以外，可以对本文所述的发明进行变化和修改。本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包含说明书中单独地或共同地提及或指出的所有步骤和特征，以及任何和所有步骤或特征的组合。
通过下面的详细描述和附图，本发明的其它特征和方面将变得显而易见。
附图说明
图1为不同浓度的柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对人外周血单个核细胞的存活率图。图1A为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物A作用下人外周血单个核细胞的存活率图。图1B为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物B作用下人外周血单个核细胞的存活率图。图1C为在浓度1μm、5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物C作用下人外周血单个核细胞的存活率图。图1D为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物D作用下人外周血单个核细胞的存活率图。
图2为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对ROR-γt荧光素酶活性的影响图。图2A为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物A作用下ROR-γt荧光素酶活性变化图。图2B为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物B作用下ROR-γt荧光素酶活性变化图。图2C为在浓度1μM、5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物C作用下ROR-γt荧光素酶活性变化图。图2D为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物D作用下ROR-γt荧光素酶活性变化图。
图3为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对转染了ROR-γt质粒的HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达(其中β-肌动蛋白是内参蛋白)的影响图。图3A为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物A作用于转染了ROR-γt质粒的HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达(其中β-肌动蛋白是内参蛋白)的影响图。图3B为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物B作用于转染了ROR-γt质粒的HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达(其中β-肌动蛋白是内参蛋白)的影响图。图3C为在浓度1μM、5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物C作用于转染了ROR-γt质粒的HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达(其中β-肌动蛋白是内参蛋白)的影响图。图3D为在浓度5μM、10μM、25μM、50μM的柠檬苦素化合物B作用于转染了ROR-γt质粒的HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达(其中β-肌动蛋白是内参蛋白)的影响图。
图4为不同浓度的柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th17细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药)。图4A为浓度5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物A对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th17细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图4B为浓度5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物B对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th17细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图4C为浓度1μM、5μM、10μM的柠檬苦素化合物C对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th17细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图4D为浓度5μM、10μM、25μM的柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th17细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图4E至4H为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D对IL-17产生的影响的数据统计图。统计上显着性差异相对于载体组表示为*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图5为不同浓度的柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th1细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药)。图5A为浓度25μM的柠檬苦素化合物A对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th1细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图5B为浓度25μM的柠檬苦素化合物B对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th1细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图5C为浓度10μM的柠檬苦素化合物C对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th1细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图5D为浓度25μM的柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th1细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图5E至5H为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D对IFN-γ产生的影响的数据统计图。统计上显着性差异相对于载体组表示为***P<0.001。
图6为不同浓度的柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th2细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药)。图6A为浓度25μM的柠檬苦素化合物A对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th2细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图6B为浓度25μM的柠檬苦素化合物B对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th2细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图6C为浓度10μM的柠檬苦素化合物C对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th2细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图6D为浓度25μM的柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Th2细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图6E至6H为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D对IL-4产生的影响的数据统计图。统计上显着性差异相对于载体组表示为*P<0.05；***P<0.001。
图7为不同浓度的柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Treg细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药)。图7A为浓度25μM的柠檬苦素化合物A对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Treg细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图7B为浓度25μM的柠檬苦素化合物B对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Treg细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图7C为浓度10μM的柠檬苦素化合物C对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Treg细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图7D为浓度25μM的柠檬苦素化合物D对从小鼠脾脏分离出来的CD4+T细胞分化成Treg细胞的影响图(其中地高辛为阳性对照药，浓度是10μM)。图7E至7H为柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D对Foxp3产生的影响的数据统计图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如在此所使用的，“包含”是指包含以下元素但不排除其他元素。“基本上由...组成”是指该材料由相应的元素以及通常不可避免的杂质例如通常由各自的制备或获得该材料的方法(例如痕量的其他组分或溶剂)产生的副产物和组分组成。在此使用的材料“是”某一元素的表述意味着材料基本上由所述元素组成。如本文所使用的，形式“一”、“一个”和“该”旨在包含单数和复数形式，除非上下文另有明确指示。
本发明提供一种治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法。所述方法包含给予所述受试者有效剂量的柠檬苦素的步骤。
柠檬苦素是具有原型结构的高度氧化和改性的萜类化合物，其含有或衍生自连接到D环上的呋喃环的4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾族骨架：
它们可存在于柑橘类水果和其他植物中，特别是芸香科和楝科植物。
用于本发明的方法中的柠檬苦素包含式(I)的结构：
R选自任选羟基化的烷基。
用于本发明的术语“烷基”是指包含碳和氢原子的直链或支链烃基。因此，“C1-C5烷基”是指包含1至5个碳原子的烃基，“C2-C5烷基”是指包含2至5个碳原子的烃基。“直链或支链烷基”包括全部直链或支链烷基。例如，C1-C5烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基及其异构体(例如正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基及其异构体(正戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基、3-戊基)。烷基优选为C1-C5烷基，进一步优选为C2-C5烷基。
术语“任选羟基化的烷基”是指任选具有一个或多个连接到烷基的一个或多个碳原子上的羟基(-OH)的烷基，特别是连接到烷基的一个碳原子上的一个羟基。
R优选地选自任选羟基化的C1-C5烷基，更优选地为任选羟基化的C2-C5烷基。
进一步更优选地，R选自乙基、2-丁基、异丙基或1-羟基-2-甲基-丁基中的一种。
即R更优选选自-C2H5，
最优选地，柠檬苦素包含选自式(II)至式(V)表示的结构一个结构：
在本发明的方法的特别优选的实施方案中，柠檬苦素由一种或多种式(II)至(V)的结构组成，即选自柠檬苦素化合物A(式(II))、柠檬苦素化合物B(式III))、柠檬苦素化合物C(式(IV))或柠檬苦素化合物D(式(V))或包含以上两种、三种或全部的混合物。所述柠檬苦素是市场上可买到的和/或可以从来自芸香科和楝科家族的植物的提取物中提取。本领域技术人员知道从植物获得柠檬苦素的合适方法，例如用乙醇提取，然后在乙酸乙酯和水之间分配，得到乙酸乙酯可溶级分，并分级所述级分，包括色谱法。
本发明使用的“自身免疫性疾病”是指由对受试者自身组织或组织成分的免疫反应应答或对受试者本身无害的抗原产生的病症。症状和严重程度可能会有所不同。该术语包括器官特异性自身免疫疾病和非器官特异性自身免疫性疾病例如I型糖尿病、克罗氏病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、桥本氏病、肾上腺皮质功能减退症和自身免疫性胃炎和自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等器官特异性自身免疫疾病和非器官特异性自身免疫疾病、系统性硬化症、多肌炎和皮肌炎、多发性硬化症和牛皮癣。本领域技术人员将理解，本发明的方法也可以应用于其他自身免疫性疾病。在本发明的具体实施方案中，自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化症和类风湿性关节炎。
术语“受试者”是指活的生物体，并且可以包括但不限于人类和动物。受试者优选是哺乳动物，更优选是人。
本发明的柠檬苦素可以以固体、半固体或液体形式存在。本发明的柠檬苦素可以通过口服或胃肠外途径给予受试者，特别是口服途径或静脉途径。
本发明的柠檬苦素可以以药物组合物的形式给药，所述药物组合物包含所述柠檬苦素和药学可接受的赋形剂，例如选自药学上可耐受的载体、盐、缓冲液、水、稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、表面活性剂或防腐剂或其组合。本领域技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可耐受的赋形剂，并且知道用于制造药物组合物的方法以及能够根据药学上可耐受的赋形剂的种类和药物组合物的形式选择合适的制备药物组合物的方法。药物组合物可以以固体、半固体或液体形式存在，以通过口服或胃肠外途径给予受试者。
在一个实施方案中，本发明的柠檬苦素可以作为用于治疗患者的单一化合物，特别是用于自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，本发明的柠檬苦素与其它治疗有效的治疗剂化合物组合施用用于治疗自身免疫性疾病。
表述“有效量”和“有效剂量”通常表示足以产生治疗所需的量，其中确切的剂量取决于所治疗的疾病的具体病症而变化。当疾病是一种自身免疫性疾病时，其表现通常是炎症减轻，例如炎性标记物的减少。
本发明的柠檬苦素的有效量可以取决于受试者的种类、体重、年龄和个体状况，并且可以通过标准程序例如细胞培养或实验动物来确定。
本发明的方法优选包括抑制来源于初始CD4+T细胞的T辅助细胞和/或调节性T细胞的分化，即柠檬苦素抑制T辅助细胞和/或调节性T细胞的分化。
术语“抑制”细胞分化用于T辅助细胞17(Th17)、T辅助细胞1(Th1)、T辅助细胞2(Th2)和调节性T细胞(Treg)，其包括任何种类的还原、抑制、特别是预防上述细胞的分化。具体而言，如本文所用的抑制T辅助细胞和/或调节性T细胞分化是指以下中的一种或多种减少，特别是显着减少的：
-ROR-γt蛋白质表达，其作为降低的Th17细胞分化的标记物；
-IL-17的产生，其作为降低的Th17细胞分化的标记物；
-IFN-γ的产生，其作为降低的Th1细胞分化的标记物；
-IL-4的产生，其作为降低的Th2细胞分化的标记物；和/或
-Foxp3的产生，其作为降低的Treg细胞分化的标记物.
进一步优选地，与没有柠檬苦素的对照组相比，在IL-17的产生、IFN-γ的产生、L-4的产生和/或Foxp3的产生的减少意味着产生IL-17、IFN-γ、IL-4或Foxp3的细胞的量减少至少3个百分点，特别是至少5个百分点，进一步优选至少7个百分点，特别是至少8个百分点(通过流式细胞术测定的方法测定)。进一步优选地，与没有处理的对照组相比ROR-γt蛋白质表达的降低意指在用本发明的柠檬苦素处理后，ROR-γt的表达量降低至少约10％，进一步优选降低至少约30％，这可以通过蛋白质印迹实验的方法或者使用萤光素酶报告分析或ELISA分析。特别地，与不具有柠檬苦素处理的对照组相比，ROR-γt蛋白质表达的降低可以意指用荧光素酶报告基因测定法测量的萤光素酶活性降低至少30％，特别是至少50％。
柠檬苦素明显地降低了ROR-γt蛋白的表达，即本发明的方法包括降低ROR-γt蛋白的表达。
或者或另外，柠檬苦素特别地减少了IL-17的产生，即本发明的方法包括减少IL-17的产生。
本发明同时涉及柠檬苦素在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用。所述柠檬苦素和自身免疫疾病如上定义。
本发明的另一方面涉及抑制T辅助细胞17分化的方法。所述方法包含使初始CD4+T细胞与有效剂量的柠檬苦素接触，其中所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构：
R选自任选羟基化的烷基。
本发明同时涉及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞17分化的药物中的应用。
术语“CD4+T细胞”是指产生CD4蛋白的淋巴细胞。这样的CD4+T细胞包括从天然来源例如血液中分离的细胞、培养基中生长的细胞系。典型地，根据本发明的CD4+T细胞是人CD4+T细胞。如本文所用，术语“初始CD4+T细胞”是指通过初始细胞表面标记物的表达功能性定义的CD4+T细胞。它们可以在抗原刺激后被激活并且主要取决于包括Th1、Th2、Th17和Treg细胞的微环境的细胞因子环境而分化为特定的细胞亚型。
将初始CD4+T细胞与本发明的柠檬苦素接触的步骤优选包括将本发明的柠檬苦素给予具有初始CD4+T细胞的受试者，特别是具有自身免疫性疾病的受试者。使本发明的初始CD4+T细胞与柠檬苦素接触的步骤可替代地包括将包含本发明的柠檬苦素培育溶液应用于初始CD4+T细胞，所述培育溶液可以进一步包含合适的赋形剂如缓冲剂或合适的生长介质。
所述方法可以进一步包含将所述初始CD4+T细胞与另外的化合物例如用于治疗自身免疫性疾病的另一种化合物接触。
初始CD4+T细胞与本发明的柠檬苦素接触至少约24小时。
柠檬苦素尤其降低ROR-γt蛋白的表达，即本发明抑制T辅助细胞17分化的方法包括降低ROR-γt蛋白的表达。
或者或另外，柠檬苦素减少了IL-17的产生，即本发明抑制T辅助细胞17分化的方法包括减少IL-17的产生。
初始CD4+T细胞优选与本发明的柠檬苦素以1μM至50μM的浓度接触。柠檬苦素的浓度优选在1μM和25μM之间，并且可以在1μM和10μM之间。如果柠檬苦素包含或具体地由式(II)、(III)或(V)之一表示的结构组成，则浓度优选为5μM至25μM。
如果柠檬苦素包含或由式(IV)表示的结构组成，则浓度优选为1μM至10μM。
在制备药物的应用中，优选地柠檬苦素在药物中的浓度为1μM至50μM，或如以上定义。
更优选地，用于接触初始CD4+T细胞的柠檬苦素包含选自式(II)至(V)表示的一个结构：
最优选地，用于接触初始CD4+T细胞的柠檬苦素包含式(II)表示的结构：
并以5μM至50μM的浓度使用，更具体地，柠檬苦素由式(II)表示的结构组成，即柠檬苦素化合物A。
另一方面，本发明涉及抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞中的一种或多种的分化的方法。所述方法包括使初始CD4+T细胞与有效量的柠檬苦素接触，其中所述柠檬苦素包含式(I)的结构：
R选自任选羟基化的烷基。
同时，本发明涉及柠檬苦素在制备抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞分化的药物中的应用。
具体地，柠檬苦素减少IFN-γ的产生、IL-4的产生和/或Foxp3的产生中的一种或多种，即抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞中的一种或多种的分化的方法包括减少一种或多种IFN-γ的产生，IL-4的产生和/或Foxp3的产生。
在本发明的方法的优选实施方案中，T辅助细胞1的分化受到抑制，并且柠檬苦素包含式(III)或(IV)表示的结构：
柠檬苦素以10μM至25μM的浓度使用。
在具体的实施方案中，柠檬苦素由式(III)或(IV)之一表示的结构组成，即柠檬苦素化合物B或柠檬苦素化合物C或者是两者的混合物。
包含或优选由式(III)表示的结构组成的柠檬苦素优选以25μM的浓度使用。
包含或优选由式(IV)表示的结构组成的柠檬苦素优选以10μM的浓度使用。
在本发明的其他实施方案中，T辅助细胞2的分化受到抑制，并且柠檬苦素包含式(III)、式(IV)或式(V)表示的结构：
并且柠檬苦素以10μM至25μM的浓度使用。
在具体的实施方案中，柠檬苦素由式(III)，(IV)或(V)表示的结构组成，即柠檬苦素化合物B，柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D或其混合物。
包含或优选由式(III)表示的结构组成的柠檬苦素优选以25μM的浓度使用。
包含或优选由式(IV)表示的结构组成的柠檬苦素优选以10μM的浓度使用。
包含或优选由式(V)表示的结构组成的柠檬苦素类优选以25μM的浓度使用。
在本发明的方法的其他实施方案中，调节性T细胞的分化受到抑制，柠檬苦素包含式(IV)表示的结构：
并且柠檬苦素以10μM的浓度使用。
在具体的实施方案中，柠檬苦素由式(IV)表示的结构组成，即柠檬苦素化合物C.
另一方面，本发明提供筛选用以抑制Th17、Th1、Th2和/或Treg细胞分化中的一种或多种的物质的方法，其可用于治疗自身免疫性疾病，该方法包括以下步骤：
(i)对物质进行测定；
(ii)检测该物质是否能抑制T辅助细胞17、T辅助细胞1、T辅助细胞2和/或调控T细胞分化中的一个或多个。
所述对细胞分化的抑制作用可以在步骤(ii)中通过以下一种或多种方法检测：确定相应T细胞分化的标记物是否减少，ROR-γt荧光素酶活性是否降低和/或ROR-γt蛋白质表达或活性是否减低。
例如，筛选方法可以包括以下步骤：
(i)将物质进行对包含ROR-γt的测定；
(ii)检测物质是否降低ROR-γt的活性或蛋白质表达。
实施例1
目的：
本实验分析测定了柠檬苦素化合A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对人外周血单个核细胞的细胞存活率的影响。
方法：
人外周血单个核细胞从人血白膜层分离得到，人血白膜层由澳门输血中心提供。具体如下，将人血白膜层与生理盐水以1:1的比例稀释在50毫升的离心管中，然后通过Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞。收集人外周血单个核细胞，用生理盐水洗两次并在350g的转速下离心10分钟。这些细胞可以用来进行后续实验。
细胞存活率实验：
人外周血单个核细胞培养在RPMI 1640培养基中(含有10％的胎牛血清(体积比)，青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100克/毫升))。以1×105个细胞每孔种板于96孔板中，然后加入不同浓度的柠檬苦素化合物A或柠檬苦素化合物B或柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D，在37℃培养箱孵育72小时。之后，加入10微升每孔的MTT试剂(浓度5毫克/毫升)到96孔板中，在37℃培养箱孵育3小时，然后加入100微升的溶剂(含有10％的十二烷基硫酸钠(SDS)，50％的N，N-二甲基甲酰胺，pH 7.2)来溶解孔板中的沉淀，过夜。第二天，用UV/VIS分光光度计检测570nm波长下的吸光度。细胞存活率比率计算公式：细胞存活率(％)＝(OD加药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)*100。
结果：
结果参见图1，柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C、柠檬苦素化合物D对人外周血单个核细胞没有明显的毒性，甚至在浓度高达50μM也没有明显的毒性。
实施例2
目的：
本实验分析测定了柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对ROR-γt荧光素酶活性的影响。
方法：
Lightswitch荧光素酶报告测定，ROR Gamma T LUCPorterTM Stable Reportercells和LUCPorterTM Vector Control HEK293细胞培养在RPMI 1640培养基中(含有10％的胎牛血清(体积比)，青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100克/毫升)和嘌呤霉素(3g/mL))。它们分别以5×104个细胞每孔种板于96孔板中。然后加入5、10、25和50μM的柠檬苦素化合物A或柠檬苦素化合物B或柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D或10μM的阳性对照药地高辛。在37℃培养箱孵育16小时，然后加入荧光素酶分析试剂于96孔板中，室温避光反应30分钟，之后转移液体至白色的96孔板中，用UV/VIS分光光度计检测荧光值。重复三次独立实验。
结果：
结果参见图2，柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B和柠檬苦素化合物D能够从浓度为5-50μM以剂量依赖方式抑制ROR-γt荧光素酶的活性。柠檬苦素化合物C能够从浓度为1-25μM以剂量依赖方式抑制ROR-γt荧光素酶的活性。
实施例3
目的：
本实验分析测定了柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D对HEK293细胞中ROR-γt蛋白表达的影响。
方法：
ROR-γt质粒转染到HEK293细胞
转染实验按照Lipofectamine LTX转染试剂说明书来进行。HEK293细胞购买与美国ATCC公司，该细胞培养在DMEM培养基中(含有10％的胎牛血清(体积比)，青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100克/毫升))。以5×105个细胞种板于6孔板中，其中加入1.5毫升的DMEM培养基备用。然后500微升的opti-MEM培养基加入1.25微克ROR-γt质粒，再加上1.25微升的PLUS试剂，轻轻混匀，室温反应5分钟。之后再加入LTX试剂，轻轻混匀，在室温下反应30分钟。最后将这些opti-MEM混合液加入6孔板中的一个孔里，留出空白对照组，剩余的孔都是如此操作。然后再在37℃培养箱里孵育24小时。
蛋白免疫印迹实验
24小时之后，6孔板中加入5、10、25和50μM的柠檬苦素化合物A或柠檬苦素化合物B或柠檬苦素化合物C或柠檬苦素化合物D或10μM的阳性对照药地高辛。在37℃培养箱再次孵育24小时。之后，收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液去裂解细胞，得到总细胞蛋白，同时蛋白浓度通过BCA方法检测计算得出。然后，蛋白样品用荷载染料混匀，在100℃的加热板上煮10分钟以达到蛋白变性。接着在在10％的SDS/PAGE中，所以的蛋白样品被电泳，并转移到硝化纤维膜上。之后在用含有5％脱脂牛奶的TBST封闭1小时后，TBST洗三次，然后该膜在ROR-γt或β-肌动蛋白抗体进行4℃孵育过夜，第二天用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行孵育2小时。最后用化学发光的手段检测蛋白表达情况。
结果：
结果参见图3，柠檬苦素化合物A能够从浓度为5-50μM以剂量依赖方式抑制ROR-γt蛋白的表达。同时柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D都能够剂量依赖地抑制ROR-γt蛋白的表达。
实施例4
目的：
本实验用流式细胞术分析测定了柠檬苦素化合物A、柠檬苦素化合物B、柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D分析检测Th17、Th1、Th2和Treg细胞分化的影响。
方法：
T细胞分化
第一天，将抗鼠CD3ε(2μg/ml)和抗鼠CD28(5μg/ml)抗体孵育24孔板中，4℃过夜。第二天，取出C57BL/6小鼠的脾脏用磁珠分选方法分选出天然CD4+T细胞。分选出的CD4+T细胞以5×105个细胞每板种于第一天准备好的24孔板中。对于Th17细胞分化，加入以下抗体及细胞因子，重组人转变生长因子(TGF-β1,50纳克/毫升)，重组鼠白介素6(IL-6,5纳克/毫升Biolegend)，重组鼠白介素23(IL-23,5纳克/毫升)，抗鼠白介素4(IL-4,10微克/毫升Biolegend)。对于Th1细胞分化，加入以下抗体及细胞因子，重组鼠白介素2(IL-2,2纳克/毫升)，抗鼠IL-4(20微克/毫升)。对于Th2细胞分化，加入以下抗体及细胞因子，重组鼠白介素2(IL-2,2纳克/毫升),重组鼠IL-4(20微克/毫升)和抗鼠干扰素(IFN-γ,20微克/毫升)。对于Treg分化，加入以下抗体以细胞因子，重组人TGF-β1(1纳克/毫升)和重组鼠IL-2(5纳克/毫升)。然后在加入不同浓度的化合物，在37℃培养箱孵育3天。
流式细胞术试验
孵育3天后，对于Th17细胞，其被收集并加入50纳克/毫升的PMA(Biolegend)，和1微克/毫升的离子霉素(ionomycin,Biolegend)和1X布雷非德菌素A(Brefeldin A,Biolegend)刺激，孵育4～5个小时。对于Th1和Th2，细胞被收集并加入50ng/ml PMA和1微克/毫升的ionomycin孵育1小时，之后加入1X的莫能菌素(Monensin,Biolegend)在孵育4个小时。对于Treg细胞，其无需再次刺激。之后细胞被收集并用PBS洗一遍，之后用PerCP/Cy5.5抗鼠CD4抗体(Biolegend)标记。然后细胞用固定液固定15分钟，接着用破膜液孵育30分钟。接着用PE抗鼠IL-17A抗体(Biolegend)或者FITC抗鼠IFN-γ(Biolegend)或者APC抗鼠IL-4(Biolegend)或者APC抗鼠Foxp3(eBioscience)标记。之后流式细胞检测Th17，Th1，Th2和Treg的分化情况。结果：
结果参见图4A，未刺激的正常组的IL-17含量为1.04％，在Th17条件刺激之后，IL-17的含量为12.7％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-17含量降低到5.43％。在5、,10和25μM的柠檬苦素化合物A作用之后，IL-17的含量分别降低为6.17％,5.20％,和4.28％。图4B，未刺激的正常组的IL-17含量为0.60％，在Th17条件刺激之后，IL-17的含量为12.3％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-17含量降低到5.17％。在5、10和25μM的柠檬苦素化合物B作用之后，IL-17的含量分别降低为11.5％,9.15％,和1.08％。图4C，未刺激的正常组的IL-17含量为0.761％，在Th17条件刺激之后，IL-17的含量为10.5％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-17含量降低到1.90％。在1、5和10μM的柠檬苦素化合物C作用之后，IL-17的含量分别降低为3.51％,2.25％,和1.91％。图4D，未刺激的正常组的IL-17含量为0.89％，在Th17条件刺激之后，IL-17的含量为9.76％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-17含量降低到5.43％。在5、10和25μM的柠檬苦素化合物D作用之后，IL-17的含量分别降低为7.97％,7.99％,和1.59％。这些结果表明柠檬苦素化合物A,柠檬苦素化合物B,柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D都能有效地抑制Th17细胞的分化。
结果参见图5A，未刺激的正常组的IFN-γ含量为2.19％，在Th1条件刺激之后，IFN-γ的含量为14.5％，在阳性药物地高辛作用之后，IFN-γ含量变为13.7％。在25μM的柠檬苦素化合物A作用之后，IFN-γ的含量变为14.8％。图5B，未刺激的正常组的IFN-γ含量为0.87％，在Th1条件刺激之后，IFN-γ的含量为12.7％，在阳性药物地高辛作用之后，IFN-γ含量变为10.8％。在25μM的柠檬苦素化合物B作用之后，IFN-γ的含量变为2.02％。图5C，未刺激的正常组的IFN-γ含量为0.77％，在Th1条件刺激之后，IFN-γ的含量为19.3％，在阳性药物地高辛作用之后，IFN-γ含量变为15.3％。在10μM的柠檬苦素化合物C作用之后，IFN-γ的含量变为10.2％。图5D，未刺激的正常组的IFN-γ含量为4.43％，在Th1条件刺激之后，IFN-γ的含量为19.3％，在阳性药物地高辛作用之后，IFN-γ含量变为17.0％。在25μM的柠檬苦素化合物D作用之后，IFN-γ的含量变为14.6％。这些结果表明柠檬苦素化合物B和柠檬苦素化合物C能够有效地抑制Th1细胞的分化，而柠檬苦素化合物A不抑制Th1细胞的分化，柠檬苦素化合物D轻微抑制Th1细胞的分化。
结果参见图6A，未刺激的正常组的IL-4含量为2.48％，在Th2条件刺激之后，IL-4的含量为17.6％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-4含量变为15.0％。在25μM的柠檬苦素化合物A作用之后，IL-4的含量变为14.8％。图6B，未刺激的正常组的IL-4含量为1.27％，在Th2条件刺激之后，IL-4的含量为13.6％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-4含量变为10.2％。在25μM的柠檬苦素化合物B作用之后，IL-4的含量变为4.11％。图6C，未刺激的正常组的IL-4含量为2.01％，在Th2条件刺激之后，IL-4的含量为14.1％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-4含量变为25.6％。在10μM的柠檬苦素化合物C作用之后，IL-4的含量变为8.7％。图6D，未刺激的正常组的IL-4含量为3.27％，在Th2条件刺激之后，IL-4的含量为16.2％，在阳性药物地高辛作用之后，IL-4含量变为15.3％。在25μM的柠檬苦素化合物D作用之后，IL-4的含量变为11.9％。这些结果表明柠檬苦素化合物B,柠檬苦素化合物C和柠檬苦素化合物D能够有效地抑制Th2细胞的分化，而柠檬苦素化合物A不抑制Th2细胞的分化。
结果参见图7A，未刺激的正常组的Foxp3含量为2.85％，在Treg条件刺激之后，Foxp3的含量为14.9％，在阳性药物地高辛作用之后，Foxp3含量变为13.8％。在25μM的柠檬苦素化合物A作用之后，Foxp3的含量变为15.1％。图7B，未刺激的正常组的Foxp3含量为2.22％，在Treg条件刺激之后，Foxp3的含量为13.9％，在阳性药物地高辛作用之后，Foxp3含量变为13.1％。在25μM的柠檬苦素化合物B作用之后，Foxp3的含量变为13.6％。图7C，未刺激的正常组的Foxp3含量为2.21％，在Treg条件刺激之后，Foxp3的含量为12.0％，在阳性药物地高辛作用之后，Foxp3含量变为12.6％。在10μM的柠檬苦素化合物C作用之后，Foxp3的含量变为8.49％。图7D，未刺激的正常组的Foxp3含量为3.23％，在Treg条件刺激之后，Foxp3的含量为15.7％，在阳性药物地高辛作用之后，Foxp3含量变为15.1％。在25μM的柠檬苦素化合物D作用之后，Foxp3的含量变为13.7％。这些结果表明柠檬苦素化合物C能够有效地抑制Treg细胞的分化，而柠檬苦素化合物A和柠檬苦素化合物B不抑制Treg细胞的分化，柠檬苦素化合物D轻微抑制Treg细胞的分化。
结论
对于柠檬苦素化合物A来说，本发明已经证明了使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合物A能够以剂量依赖性方式抑制类视黄醇相关的孤儿受体γt(ROR-γt)荧光素酶报告的活性。使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合A还可以抑制ROR-γt蛋白的表达。在某些具体的表现中，有一种方法表明，柠檬苦素化合物A能够抑制Th17细胞的分化。本发明已经证明，浓度为25μM的柠檬苦素化合物A对Th1、Th2和Treg细胞的分化没有抑制作用。在其他的体现中，其表明柠檬苦素化合物A是有选择性的，特别是在Th17细胞的分化上，而不是Th1、Th2和Treg细胞的分化。
对于柠檬苦素化合物B来说，本发明已经证明了使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合物B能够以剂量依赖性方式抑制ROR-γt荧光素酶报告的活性。使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合物B还可以抑制ROR-γt蛋白的表达。在某些具体的表现中，其表明柠檬苦素化合物B抑制Th17细胞的分化。本发明已经证明，浓度为25μM的柠檬苦素化合物B对Th1、Th2细胞分化有抑制作用，对Treg细胞的分化没有抑制作用。
对于柠檬苦素化合物C来说，本发明已经证明了使用浓度为1-25μM的柠檬苦素化合物C能够以剂量依赖性方式抑制ROR-γt荧光素酶报告的活性。使用浓度为1-25μM的柠檬苦素化合物C还可以抑制ROR-γt蛋白的表达，。在某些具体的表现中，其表明柠檬苦素化合物C抑制Th17细胞的分化。本发明已经证明，浓度为10μM的柠檬苦素化合物C对Th1、Th2和Treg细胞分化都有抑制作用。
对于柠檬苦素化合物D来说，本发明已经证明了使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合物D能够以剂量依赖性方式抑制ROR-γt荧光素酶报告的活性。使用浓度为5-50μM的柠檬苦素化合物D还可以抑制ROR-γt蛋白的表达。在某些具体的表现中，有一种方法表明，柠檬苦素化合物D抑制Th17细胞的分化。本发明已经证明，浓度是25μM的柠檬苦素化合物D对Th2细胞分化有抑制作用，对Th1和Treg细胞的分化没有抑制作用。
Claims (11)
1.柠檬苦素在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，其中所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化症或类风湿性关节炎，所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构：
其中R选自任选羟基化的烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其中R选自任选羟基化的C1-C5烷基。
3.根据权利要求1所述的应用，其中R选自1-羟基-2-甲基-丁基。
4.柠檬苦素在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，其中所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化症或类风湿性关节炎，所述柠檬苦素包含式(I)表示的结构：
其中R选自乙基、2-丁基或异丙基。
5.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素抑制T辅助细胞17的分化。
6.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素减少类视黄醇相关的孤儿受体γt蛋白的表达。
7.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素减少白介素17的产生。
8.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述药物应用在CD4+T细胞上。
9.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素在药物中的浓度为1μM至50μM。
10.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素抑制T辅助细胞1、T辅助细胞2或调节性T细胞的分化。
11.根据权利要求1或4所述的应用，其中所述柠檬苦素减少INF-γ的产生、IL-4的产生或Foxp3的产生中的一种或多种。
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