CN113181153B - 柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用，属于自身免疫病治疗技术领域；所述柠檬酸有促进抑炎细胞—Treg细胞分化，并抑制促炎细胞—Th17细胞分化的作用；用柠檬酸干预胶原诱导性关节炎模型小鼠，能够显著降低小鼠的关节炎评分，并能够降低关节炎小鼠的发病率；所述柠檬酸能够纠正生物体内的免疫细胞失衡状态，为类风湿关节炎等自身免疫性疾病提供了新的治疗方案。

Description

柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用
技术领域
本发明属于自身免疫病治疗技术领域，尤其涉及柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用。
背景技术
自身免疫性疾病是一类以血清中出现多种致病性自身抗体伴全身多系统受累为临床特征的疾病，包括类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、系统性硬化症(Systemic Sclerosis，SSc)等。类风湿关节炎是一种以自身抗体产生和关节破坏为主要特征的慢性炎症性自身免疫病，主要特点是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，同时常伴有关节外器官受累，包括心、肺、肾、神经系统等全身脏器。据统计，RA是致残率最高的疾病之一，严重影响着人类的健康，给社会带来巨大的经济负担。系统性红斑狼疮患者除了出现发热、面部皮疹、脱发、关节痛等损害，还可能出现重要脏器受累，包括溶血性贫血、急进性肾小球肾炎、癫痫、弥漫性肺泡出血等，危及患者的生命。
自身免疫病的发病机制尚不明确，治疗仅限于缓解症状，不能从根本上控制疾病的发生发展。因此，全面而深入地探究自身免疫的发病机制，寻找特异性的早期诊断指标及有效治疗靶点，具有重要的理论意义和临床应用价值。新近研究显示，机体代谢分子可以直接反映疾病状态又是研究疾病病因及病情变化的有效工具，因此机体代谢分子在自身免疫病发生发展中的作用逐渐被认可并受到重视。对类风湿关节炎血清、滑液及尿液的代谢组研究非常适合于生物标志物的发现，可能成为类风湿关节炎疾病监测和个性化治疗的一种潜在途径，但是目前异常代谢分子对类风湿关节炎的发病是否具有调控作用还需进一步深入研究。
目前，自身免疫病的治疗限于应用药物缓解症状，延缓疾病的进展。然而，过度使用激素、免疫抑制剂以及生物制剂等抑制免疫反应通常会伴随感染、肝肾功能异常、贫血等不良反应。因此寻找一种能调控免疫失衡和重建免疫耐受的治疗方法显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用；所述柠檬酸为自身免疫病的治疗提供了新方法，柠檬酸能够靶向性调节异常的免疫细胞，从上游途径治疗自身免疫疾病，调节免疫平衡。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用。
优选的，所述自身免疫病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和系统性硬化症。
优选的，所述药物的剂型为液体制剂或固体制剂。
优选的，当所述药物的剂型为液体制剂时，所述柠檬酸在液体制剂中的浓度为100～1000μM。
优选的，当所述药物的剂型为固体制剂时，所述柠檬酸在所述药物中的质量百分含量为99％～99.99％。
本发明提供了柠檬酸在制备促进初始T细胞向抑炎细胞分化的试剂或药物中的应用。
优选的，所述抑炎细胞包括调节性T细胞。
本发明提供了柠檬酸在制备抑制初始T细胞向促炎细胞分化的试剂或药物中的应用。
优选的，所述促炎细胞包括辅助性T细胞17。
本发明还提供了一种具有调节自身免疫功能的小鼠饲料，包括质量百分含量为1.5％～2.5％的柠檬酸。
本发明的有益效果：本发明提供的柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用，所述柠檬酸有促进抑炎细胞—Treg细胞分化，并抑制促炎细胞—Th17细胞分化的作用；用柠檬酸干预胶原诱导性关节炎模型小鼠，能够显著降低小鼠的关节炎评分，并能够降低关节炎小鼠的发病率。
附图说明
图1为实施例1中利用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测类风湿关节炎患者(RA，n＝42)和健康对照人群(HC，n＝36)的血清及尿液中柠檬酸含量的结果，其中A为RA患者血清中柠檬酸含量的检测结果；B为RA患者尿液中柠檬酸含量的检测结果；**P<0.01，RA,rheumatoid arthritis，类风湿关节炎；柠檬酸的相对含量表示为mean±sd；
图2为不同浓度的柠檬酸对初始T细胞(
Figure BDA0003091870970000031
T细胞)分化的影响，其中(A)为柠檬酸干预组(100μM，500μM，1mM)对/>
Figure BDA0003091870970000032
T细胞向Th17细胞分化的影响；(B)为柠檬酸干预组明显对/>
Figure BDA0003091870970000033
T细胞向Treg细胞分化的影响；(C)为100μM柠檬酸干预组对/>
Figure BDA0003091870970000034
T细胞向Th1细胞分化的影响影响；Citric acid，柠檬酸，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。Th：T helper，T辅助细胞；Treg：T regulatory cell，调节性T细胞；
图3为柠檬酸对关节炎小鼠模型疾病的发生发展的影响，其中A柠檬酸为实验性关节炎的发病率的影响，B为柠檬酸对实验性关节炎的评分的影响；发病率、关节炎评分表示为mean±sd，每组小鼠n＝10只；CIA：collagen-induced arthritis，胶原诱导性关节炎；Citric acid，柠檬酸，**P<0.01；
图4为柠檬酸对实验性关节炎小鼠淋巴细胞亚群比例的调控作用，其中A～C为在脾脏中，柠檬酸对Th17细胞、Treg细胞和Th1细胞的影响；D～F为在关节引流淋巴结(DLN)中，柠檬酸对Th17细胞、Treg细胞和Th1细胞的影响；淋巴亚群比例表示为Mean±SEM，每组小鼠n＝8只，*P<0.05，**P<0.01；Th：T helper，T辅助细胞；Treg：T regulatory cell，调节性T细胞。
具体实施方式
本发明提供了柠檬酸在制备预防和/或治疗自身免疫病的药物中的应用。
在本发明中，所述自身免疫病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和系统性硬化症。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，所述药物的剂型为液体制剂或固体制剂。当所述药物的剂型为液体制剂时，所述柠檬酸在液体制剂中的浓度优选为100～1000μM，更优选为200～500μM。当所述药物的剂型为固体制剂时，所述柠檬酸在所述药物中的质量百分含量为99％～99.99％。本发明对所述药物的辅料的种类以及用量没有特殊限定，采用柠檬酸在与药学上可接受的辅料即可。当所述药物为液体制剂时，所述药物的溶剂优选为H2O。在本发明中，所述药物能够应用于预防和/或治疗人或动物自身免疫病，本发明对动物的种类没有限定；在本发明具体实施过程中，以小鼠为例进行实验。
本发明提供了柠檬酸在制备促进初始T细胞向抑炎细胞分化的试剂或药物中的应用。在本发明中，所述抑炎细胞优选的包括调节性T细胞。本发明对所述促进初始T细胞向抑炎细胞分化的试剂或药物的应用没有特殊限定，不仅限于治疗类风湿关节炎，也包括治疗其他相关病症；还包括非疾病治疗的应用，例如通过柠檬酸作用由初始T细胞制备获得抑炎细胞，例如Treg细胞，用于科学研究。
本发明还提供了柠檬酸在制备抑制初始T细胞向促炎细胞分化的试剂或药物中的应用。在本发明中，所述促炎细胞优选的包括辅助性T细胞17。本发明对所述抑制初始T细胞向促炎细胞分化的试剂或药物的应用没有特殊限定，不仅限于治疗类风湿关节炎，也包括治疗其他相关病症；还包括非疾病治疗的应用，例如通过柠檬酸作用影响初始T细胞的分化，进而获得比例不同于常规的免疫细胞亚群。
本发明还提供了一种具有调节自身免疫功能的小鼠饲料，包括质量百分含量为1.5％～2.5％的柠檬酸。在本发明中，所述小鼠饲料优选的包括质量百分含量为1.8％～2.2％的柠檬酸，更优选的包括百分含量为2％的柠檬酸。在本发明中，所述具有调节自身免疫功能的小鼠饲料还包括常规饲料，本发明对所述常规饲料的组成没有特殊限定，采用本领域常规小鼠饲料即可。在本发明中，所述具有调节自身免疫功能的小鼠饲料的饲喂量为10g/天/只；所述具有调节自身免疫功能的小鼠饲料连续饲喂6周以上能够达到调节自身免疫功能、治疗自身免疫病的效果。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
类风湿关节炎患者血清及尿液中柠檬酸含量显著减少
实施方法
(1)尿液样本和血清学样本采集
采集健康对照人群(HC，n＝36)和类风湿关节炎患者(RA，n＝42)的血清和尿液。本研究连续纳入2018年3月至2018年5月于北京大学人民医院就诊的类风湿关节炎患者42例，患者均符合1987年美国风湿病学会类风湿关节炎的分类标准或早期类风湿关节炎(ERA)的标准或2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟的类风湿关节炎分类标准，同时纳入36例性别、年龄匹配的健康志愿者。
1)嘱受试者取清洁中段尿，留取45mL，分装于3只15mL无菌离心管，1h内送入实验室保存-80℃冰箱。
2)留取尿液样本的当日，静脉采血，收集血清，1h内送入实验室保存-80℃冰箱。
(2)气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测尿液和清学中的代谢物含量
1)尿液代谢组：
A.在4℃下融化样本；取200μL样本到5mL离心管，再加入30μL尿素酶，37℃孵育1.5h；加入甲醇1.7mL，充分混匀；
B.60μL的0.2mg/mL 2-氯苯丙氨酸以及60μL 0.2mg/mL十七碳酸作为内标，涡旋5min；4℃10000g离心10min，取1.5mL上清转移到另一个2mL离心管中，用真空离心浓缩仪浓缩样品至干；加入60μL甲氧基溶液，涡旋30s后，37℃反应2h；最后加入60μL BSTFA试剂(含质量百分含量为1％三甲基氯硅烷)，37℃反应90min。4℃12000rpm离心10min，取上清加入检测瓶；自每个待测尿液样本各取20μL混合成QC样本，(QC：quality control，用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的误差)；用剩余的待测样本进行气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)检测(气相色谱采用HP-5MS毛细管柱(5％苯/95％甲基聚硅氧烷30m×250μm i.d.,0.25μm film thickness,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)以1mL/min的恒流氦气来分离衍生化物质，1μL样品以分流比20:1的方式通过自动进样器注入。注射温度为280℃，接口设置为150℃和离子源调整到230℃。升温程序以60℃为初始温度，持续2min，以10℃/min的速率上升到300℃并在300℃停留5min。质谱采用的是范围从35到750(m/z)的全扫描方法)。
2)血清代谢组：
将所有样本在4℃下融化，取样本100μL于1.5mL离心管中，加入400μL甲醇，振荡60s，充分混匀；其余步骤与1)尿液代谢组中的B步骤记载相同。
实验结果：
气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对血清和尿液的代谢组学检测(附表中的1和2)。结果如图1所示，与健康对照人群相比，RA患者血清(1.62±0.06vs.1.138±0.07)和尿液(104.7±7.041vs.42.93±4.062)中柠檬酸相对含量均显著减少(P<0.01)(附图1中的A和B)，提示柠檬酸在RA发病过程中可能具有保护作用。
实施例2
柠檬酸抑制
Figure BDA0003091870970000061
T细胞向促炎细胞Th17分化，促进其向抑炎T细胞Treg分化
实施方法
(1)分选
Figure BDA0003091870970000062
T细胞：分离小鼠的淋巴结或者脾脏，淋巴结：置于含10％胎牛血清的1640培养基中，剪刀剪碎，滤网研磨，制成单细胞悬液。脾：将脾置于含10％胎牛血清1640培养基中，用滤网研磨，制成单细胞悬液。加红细胞裂解液6mL，颠倒混匀后，室温放置10min。常温，1800rpm，离心8min，弃上清。淋巴结和脾脏细胞均用PBS缓冲液洗涤2次，蓝帽流式管过滤，置于冰上待用。
(2)流式细胞术分选
Figure BDA0003091870970000063
T细胞(CD4+CD62L+CD44-)。
(3)提前2h，在37℃的温度下，在96孔板上包被anti-CD3和anti-CD28抗体(包被量为5μg/mLα-CD3和5μg/mLα-CD28)；
(4)将分选好
Figure BDA0003091870970000064
T细胞以2×105/200μL每孔接种于包被好的96孔板中，含10％胎牛血清1640培养基分别包括以下不同诱导分化的细胞因子(不同的孔内)：
Th0:αnti-interferon-γ(α-IFN-γ)(10μg/mL)，αnti-IL-4(10μg/mL)；
Th1:IL-12(10ng/mL),αnti-IL-4(10μg/mL)；
Th17:IL-6(20ng/mL),TGF-β(3ng/mL),IL-23(50ng/mL),α-IFN-γ(10μg/mL),α–IL-4(10μg/mL)；
Treg:IL-2(50U/ml),TGF-β(2ng/mL)；
同时向培养基中添加柠檬酸至终浓度分别为0μM，100μM，500μM，1mM进行干预；
(5)第3天，添加新的等量培养基，并分为两个孔；
(6)第5天，收集细胞进行Th17/Th1/Treg的流式染色(Th1：CD3+CD4+IFN-γ+，Th17：CD3+CD4+IL-17+，Treg:CD3+CD4+CD25+Foxp3+)。
Th1：CD3+CD4+IFN-γ+，Th17：CD3+CD4+IL-17A+
A.刺激：每个样本加入刺激液1mL(PMA 50 ng/mL，离子霉素1μg/mL，BFA 10μg/mL，溶解于1640培养基)；37℃，避光刺激5h；加入2mL的washing buffer清洗，1800rpm离心7min，弃上清；100μL stain buffer冲悬。
B.染色：表面染色：加入表面抗原染色标记(BV510-FVD,1:100；FITC-CD3,1:50；BV421-CD4,1:50，4℃，避光，孵育30min，加入2mL的stain buffer清洗，1800rpm离心7min，弃上清。破膜：加入固定/破膜液1mL，4℃，避光，孵育40min，加入2mL的stain buffer清洗，1800rpm离心7min，弃上清。胞内染色：加入胞内抗原染色标记(PE-IL-17A,1:50；APC-IFN-γ,1:50；CF594-RORγt+,1:50)，4℃，避光，孵育30min。
C.检测：加入1mLPBS缓冲液洗涤，1800rpm离心7min，200μL PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测。
Treg：CD3+CD4+CD25+Foxp3+
A.封闭：每个样本中加入CD16/CD32(FcR的阻断单抗)，1:200；
B.染色：加入表面抗原染色标记(FITC-CD3,1:50；BV421-CD4,1:200；FITC-CD44,1:100；PE-PD-1,1:100；Biotin-CXCR5,1:100；PEcy7-CD25,1:100)，室温，避光，摇床孵育40min；加入1mLPBS洗涤，1800rpm离心7min，弃上清，100μL PBS冲悬；表面染色第二层：加入SA-Percp-Cy5.5(1:100)，室温，避光，摇床孵育30min；加入1mL PBS洗涤，1800rpm离心7min，弃上清，100μLPBS冲悬；破膜过程同前，破膜后胞内染色：加入胞内抗原染色标记(APC-Bcl-6,PE-CF594-Foxp3,1:50)，4℃，避光孵育30min。
C.检测：加入1mL PBS洗涤，1800rpm离心7min，200μL PBS缓冲液重悬，上机检测。
实验结果：
1、用柠檬酸(100μM，500μM，1mM)进行干预后，与对照组相比，柠檬酸干预组明显下调
Figure BDA0003091870970000081
T细胞向Th17细胞分化(％)(图2中的A，Control组25.30±3.043vs Citricacid100μM组15.05±3.466，P<0.01；Control组25.30±3.043vs Citric acid500μM组9.45±3.587，P<0.001；Control组25.30±3.043vs Citric acid1mM组1.185±0.211，P<0.001)(详细数据见附表3)。
2、用柠檬酸100μM进行干预后，与对照组相比，柠檬酸干预组明显上调
Figure BDA0003091870970000082
T细胞向Treg细胞分化(％)(图2中的B，Control组14.60±0.53vs Citric acid100μM组24.03±0.21，P<0.05)(详细数据见附表4)。
3、用柠檬酸100μM进行干预后，与对照组相比，柠檬酸干预组对Th1细胞分化无显著影响(图2中的C，Control组89.35±5.00vs Citric acid100μM组67.43±15.25，P>0.05)(详细数据见附表5)。
结果提示，柠檬酸有促进
Figure BDA0003091870970000083
T细胞向调节性T细胞Treg分化，抑制其向促炎细胞-Th17细胞分化的作用。/>
实施例3
柠檬酸抑制关节炎小鼠模型疾病的发生发展
实施方法
(1)构建胶原诱导性关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型(二次免疫后对照组小鼠会出现关节炎的症状)：研究对象：小鼠品系：DBA/1小鼠(雄性、6-8周)，购自华阜康实验动物公司。
1)溶解及乳化胶原：将牛Ⅱ型胶原溶于0.1mol的冰醋酸(浓度为4mg/mL)，在4℃条件下，避光静置14h。将已经溶解的胶原与等体积弗氏完全佐剂(CFA)混合，用1mL注射器抽吸，充分乳化，最终制成胶原乳剂(浓度为2mg/mL)。
2)初次免疫：用脱毛机给小鼠尾根部去毛发，于尾根部多点皮内注射胶原乳剂(每只小鼠的总量为200μg)。
3)加强免疫：小鼠初次免疫后第21天，将Ⅱ型胶原溶于0.1mol的冰醋酸浓度，终浓度为4mg/mL，在4℃条件下，避光静置14h；后在完全溶解的胶原内加入等体积弗氏不完全佐剂IFA制成胶原乳剂(浓度2mg/mL)；将胶原乳剂(总量为100μg)于尾根部进行多点皮内注射。
(2)柠檬酸干预：饲料添加2wt％柠檬酸，在小鼠第一次免疫后给予饲料喂养，10g/只/天，共喂养6周。
(3)临床指标检测：
1)小鼠发病率记录：初次免疫后第22天(即加强免疫后)开始，每天观察每组小鼠的关节炎发病情况，对小鼠的发病时间及每组小鼠的发病率进行记录。
2)关节炎评分：从加强免疫后，每日均观察关节的肿胀情况并评分。由2名实验人员独立评分，取两名人员的平均值作为最终的评分。发病小鼠的4个足关节均须进行评分，每个关节的评分标准为：脚趾肿胀≤2即为1分，>2即为2分；脚掌出现肿胀即为1分；脚踝出现肿胀即为1分。每个关节的最高分为4分，每只小鼠的最高分数为16分。
实验结果
在柠檬酸干预模型中，对照组(CIA)小鼠的关节炎发生率为100％，而柠檬酸干预组关节炎的发生率为0％(图3中的A，P<0.01)(详细数据见附表6)，结果提示柠檬酸可显著降低实验性关节炎的发生率。同时，对照组(CIA)小鼠的关节炎评分平均为6.01，柠檬酸干预组的关节评分为0分(图3中的B，P<0.01)(详细数据见附表7)，说明柠檬酸均可显著降低关节炎评分，抑制关节炎发展。可见，柠檬酸可显著抑制类风湿关节炎动物模型的关节炎的发生发展。
实施例4
柠檬酸调控关节炎小鼠脾脏及关节引流淋巴结免疫细胞亚群比例
实施方法
(1)取材对象：脾脏、关节淋巴结(腋窝和腘窝)。
(2)处理步骤：将淋巴结置于无血清1640培养基中，滤网研磨，制成单细胞悬液，全部用于流式检测。脾：将脾置于无血清1640培养基中，用滤网研磨，制成单细胞悬液；加红细胞裂解液6mL，室温放置10min。1800rpm，离心5min，弃上清。PBS缓冲液洗涤2次，离心去上清，PBS冲悬后细胞计数，调整细胞数量为2×106/100μl，待用。上机前进行过滤。
(3)流式检测细胞亚群：
采用流式细胞术检测Th1/Treg/Th17细胞在各组小鼠中的变化。标记方式如下所示：Th1细胞(CD4+IFN-γ+)，Th17细胞(CD4+IL-17A+)，Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)。
实验结果
淋巴细胞亚群分析结果显示，在脾脏中，柠檬酸下调Th17细胞的比例(图4中的A，CIA组Th17 1.32±0.45vs Citric acid组Th17 0.87±0.06，P＝0.04)(详细数据见附表8)，同时上调Treg细胞的比例(图4中的B，CIA组Treg 9.17±2.44vs Citric acid组Treg15.23±3.73，P＝0.03)(详细数据见附表9)，对Th1细胞无显著影响(图4中的C，CIA组Th15.88±1.28vs Citric acid组Th1 4.84±1.06，P＝0.27)(详细数据见附表10)。在关节引流淋巴结(DLN)中，柠檬酸下调T辅助细胞Th17的比例(图4中的D，CIA组Th17 1.66±0.52vsCitric acid组Th17 1.03±0.06，P＝0.004)(详细数据见附表11)，而调节性T细胞Treg细胞(图4中的E，CIA组Treg 10.08±1.34vs Citric acid组Treg 10.32±1.04，P＝0.80)(详细数据见附表12)和Th1细胞的比例无明显变化(图4中的F，CIA组Th1 1.73±1.16vsCitric acid组Th1 1.62±0.76，P＝0.90)(详细数据见附表13)。结果显示，柠檬酸可下调脾脏和关节引流淋巴结中促炎细胞Th17的比例，上调脾脏抑炎细胞Treg细胞的比例，对脾脏和关节引流淋巴结中的Th1细胞无显著影响。
由上述实施例可知，柠檬酸可通过抑制初始T细胞向促炎细胞Th17细胞分化，并促进初始T细胞向抗炎细胞调节性T细胞(T regulatory，Treg)分化，改变二者的比例，从而发挥抗炎和免疫抑制作用，纠正生物体内的免疫细胞失衡状态，为类风湿关节炎等自身免疫性疾病提供了新的治疗方案。
附表1气相色谱-质谱法对血清和尿液的代谢组学检测数据
Figure BDA0003091870970000101
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Figure BDA0003091870970000111
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Figure BDA0003091870970000121
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Figure BDA0003091870970000131
附表2气相色谱-质谱法对血清和尿液的代谢组学检测统计结果
尿柠檬酸 血清柠檬酸
HC 104.7±7.041 1.623±0.06106
RA 42.93±4.062 1.138±0.07014
P <0.001 <0.001
附表3与对照组相比，柠檬酸干预组明显下调
Figure BDA0003091870970000145
T细胞向Th17细胞分化
Figure BDA0003091870970000141
附表4柠檬酸干预组明显上调
Figure BDA0003091870970000142
T细胞向Treg细胞分化
Figure BDA0003091870970000143
附表5与对照组相比，柠檬酸干预组对Th1细胞分化无显著影响
Figure BDA0003091870970000144
Figure BDA0003091870970000151
附表6小鼠发病率
Figure BDA0003091870970000152
附表7小鼠发病分数
Figure BDA0003091870970000153
/>
Figure BDA0003091870970000161
附表8在脾脏中柠檬酸下调Th17细胞的比例
Figure BDA0003091870970000162
Figure BDA0003091870970000171
附表9在脾脏中柠檬酸上调Treg细胞的比例
Figure BDA0003091870970000172
附表10在脾脏中柠檬酸对Th1细胞无显著影响
Figure BDA0003091870970000173
附表11在关节引流淋巴结(DLN)中柠檬酸下调T辅助细胞Th17的比例
Figure BDA0003091870970000174
/>
Figure BDA0003091870970000181
附表12在关节引流淋巴结(DLN)中柠檬酸对Treg细胞无显著影响
Figure BDA0003091870970000182
附表13在关节引流淋巴结(DLN)中柠檬酸对Th1细胞无显著影响
Figure BDA0003091870970000183
/>
Figure BDA0003091870970000191
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.柠檬酸在制备促进关节炎动物模型脾脏中初始T细胞向抑炎细胞分化的试剂中的应用；所述试剂在应用时为液体制剂或固体制剂；
所述试剂的剂型为液体制剂时，所述柠檬酸在试剂制剂中的浓度为100～1000μM；所述试剂的剂型为固体制剂时，所述柠檬酸在所述试剂中的质量百分含量为99％～99.99％；
所述应用不用于疾病的治疗；
所述抑炎细胞为调节性T细胞；
所述调节性T细胞为CD4+CD25+Foxp3+。
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