CN104297354A - 一种高效液相色谱法测定盐酸戊乙奎醚中杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸戊乙奎醚中两个杂质的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，以乙腈与20mmol/L磷酸二氢钾(含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH=3.0)作流动相，梯度洗脱测定杂质的含量。在测定时，以初始流动相比例作溶剂，即乙腈：20mmol/L磷酸二氢钾(含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH=3.0)=32：68，将盐酸戊乙奎醚用溶剂配制成供试品溶液；杂质对照品同法处理，配制成杂质对照品溶液。分别取供试品溶液、杂质对照品溶液直接进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算杂质含量。本发明的方法具有操作简便、灵敏度高、可定量测定、准确度高、重现性好的特点，以有效控制盐酸戊乙奎醚的产品质量，保证临床用药的安全有效。

Description

一种高效液相色谱法测定盐酸戊乙奎醚中杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物中杂质的检测方法，具体涉及盐酸戊乙奎醚中3[2-环戊基-2-苯基-2（2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基）乙氧基]奎宁环烷盐酸盐、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇的检测方法。

背景技术

盐酸戊乙奎醚，化学名：3-(2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基)奎宁环烷盐酸盐。化学式为：

本品系新型选择性抗胆碱药，能通过血脑屏障进入脑内。它能阻断乙酰胆碱对脑内毒蕈碱受体和烟碱受体的激动作用；因此，能较好地拮抗有机磷毒物中毒引起的中枢中毒症状，如惊厥、中枢呼吸循环衰竭和烦躁不安等。同时，在外周也有较强的阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用；因而，能较好地拮抗有机磷毒物（农药）中毒引起的毒蕈碱样中毒症状，如支气管平滑肌痉挛和分泌物增多、出汗、流延、缩瞳和胃肠道平滑肌痉挛或收缩等。它还能增加呼吸频率和呼吸流量，由于本品对M₂受体无明显作用，故对心率无明显影响；对外周N受体无明显拮抗作用。

盐酸戊乙奎醚临床用于麻醉前给药以抑制唾液腺和气道腺体分泌和有机磷毒物（农药）中毒急救治疗和中毒后期或胆碱酯酶（ChE）老化后维持阿托品化。由于盐酸戊乙奎醚确切的疗效，该药在临床中己得到广泛的运用，市场前景甚是广阔。

在盐酸戊乙奎醚的制备过程中，3[2-环戊基-2-苯基-2（2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基）乙氧基]奎宁环烷盐酸盐（以下简称杂质A）及α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇（以下简称杂质B）是其合成中的副反应产物。为确保临床用药的安全有效，有必要对盐酸戊乙奎醚制备工艺中生成的杂质进行严格的控制。

在盐酸戊乙奎醚国家药品标准（WS1-(X-026)-2004Z）中，杂质的控制方法为薄层色谱法。该标准用薄层色谱法控制杂质A的限度为0.25%，而对杂质B未进行检测。薄层色谱法存在受温度、湿度、试剂种类、点样技术等环境影响较多、重现性差、灵敏度低、重现性差、显色不明显的缺点，同时对检测结果只能达到半定量，且操作误差较大。针对药品质量要求越来越高，杂质控制亦日益严格的现状，该标准已无法满足杂质检测要求。因此，迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、可定量测定、准确度高、重现性好的盐酸戊乙奎醚中的杂质A、B的检测方法。目前，药物杂质的常用检测方法首选高效液相色谱法（HPLC）。通过反复试验，本发明人建立了一种盐酸戊乙奎醚中杂质A和杂质B的高效液相色谱（HPLC）检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种盐酸戊乙奎醚中杂质A、B的HPLC检测方法，以有效控制盐酸戊乙奎醚的质量，保证临床用药的安全有效。

本发明采用HPLC法检测杂质A、B的含量，用乙腈和磷酸二氢钾溶液(含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH至2.0-6.0)的混合溶液作为流动相，梯度洗脱，可通过一次测定同时检测2种杂质的含量，操作简便、灵敏度高、准确度高、重现性好，并且主峰、原料、中间体、杂质均能很好分离，可定量测得杂质A、B含量，弥补了现有技术的不足。

本发明所述技术方案如下：

本发明所述盐酸戊乙奎醚中杂质A、B的高效液相色谱检测方法，其具体色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂的色谱柱，如Atlantis® T3，4.6x250mm，5μm。

流动相：流动相A：乙腈；流动相B：1-35mmol/L磷酸二氢钾溶液(含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH至2.0-6.0，优选3.0)，浓度优选20mmol/L。照下表进行梯度洗脱：

流速：0.8-1.2ml／min，优选1.0ml/min。

柱温：20℃-40℃，优选35℃。

检测波长：210nm±10nm，优选210nm。

进样量：20μl。

供试品溶液的配制：精密称取盐酸戊乙奎醚适量，用溶剂溶解配制成每1ml中含盐酸戊乙奎醚1mg的溶液。

对照品溶液的配制：分别精密称取杂质A和杂质B对照品适量，用溶剂溶解配制成每1ml中各含杂质A和杂质B 1μg的溶液。

配制供试品溶液及对照品溶液的溶剂为流动相A和流动相B的混合溶液，其配比为流动相A∶流动相B=32∶68。

测量：分别取供试品溶液与对照品溶液进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算杂质A、B的含量；

式中A_杂为供试品中杂质的峰面积；C_对为对照品溶液的浓度；A_对为对照品溶液中主峰峰面积；C_供为供试品溶液的浓度。

采用本发明的方法测定盐酸戊乙奎醚中杂质A、B的含量，具有以下优势：

1、可定量测定A、B杂质的含量：盐酸戊乙奎醚国家药品标准（WS1-(X-026)-2004Z）中只检测了杂质A的含量，没有检测杂质B含量，且杂质A也只能进行半定量检测。而采用本发明的方法，可同时、方便地检测杂质A、B的含量，且可测得盐酸戊乙奎醚中杂质A、B的具体含量，增加了药品质量的可控性；

2、准确度高、灵敏度高：通过多次实验证实，本发明提供的检测方法，杂质A、B的检测限均为2ng(0.1μg/ml)，定量限均为6ng(0.3μg/ml)，大大提高了检测灵敏度，为严格控制盐酸戊乙奎醚的质量，提高质量标准提供了可靠的检验基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中溶剂的HPLC图；

图2为本发明实施例2中杂质A对照品溶液的HPLC图；

图3为本发明实施例2中杂质B对照品溶液的HPLC图；

图4为本发明实施例2中盐酸戊乙奎醚供试品的HPLC图；

图5为本发明实施例3中杂质A线性关系图；

图6为本发明实施例3中杂质B线性关系图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

主要仪器及色谱条件：

Ultimate3000液相色谱仪，紫外检测器，自动进样器，Chromeleon色谱工作站。

色谱柱：Atlantis® T3，4.6x250mm，5μm。

以下实施例中检测所用盐酸戊乙奎醚由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号：110900。

杂质A对照品由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110601。

杂质B对照品由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110601。

实施例1 波长的选择

分别取杂质A 、杂质B、盐酸戊乙奎醚各适量，用甲醇溶解，在190~400nm的波长范围内进行紫外全波长扫描，结果表明：盐酸戊乙奎醚、杂质A、杂质B在200nm~220nm范围内有较大吸收。其中，杂质A在208nm有最大吸收，杂质B在209nm有最大吸收，盐酸戊乙奎醚在208nm有最大吸收。由于乙腈的截止波长为190nm，为保证杂质尽可能分离检出，且避免低波段的干扰，因此选择210nm±10nm为检测波长。

实施例2 样品的测定

主要色谱条件：

流动相：流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L磷酸二氢钾(含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH=3.0)。照下表进行梯度洗脱：

流速： 1.0ml/min。

柱温： 35℃。

检测波长： 210nm。

进样量：20μl

供试品溶液的配制：精密称取盐酸戊乙奎醚供试品10mg，加溶剂（流动相A：流动相B=32:68）溶解并定容至10ml，得供试品溶液（1mg/ml）。

对照品溶液的配制：各精密称取杂质对照品10mg，加溶剂（流动相A：流动相B=32:68）溶解并定容至100ml，精密移取1ml，加溶剂溶解并定容至100ml，得对照品溶液（1μg/ml）。

分别取溶剂、供试品溶液与对照品溶液直接进样，采集色谱图（如图1~4），以外标法按峰面积计算结果。

其中图1为溶剂色谱图；图2、图3为杂质A、B对照品溶液色谱图，如图可见杂质A、B的保留时间分别为42.187min 、26.543min。根据供试品溶液色谱图中杂质峰的保留时间确定杂质存在；根据杂质的出峰面积计算供试品中杂质的含量（图4）。

实施例3 方法学验证试验

按照实施例2的色谱条件，分别从专属性、精密度、线性、检测限与定量限、稳定性方面进行了方法学验证，结果如下：

(1)专属性：

分别取溶剂、供试品溶液（盐酸戊乙奎醚溶液）、杂质A、B对照品混合溶液、盐酸戊乙奎醚与杂质对照品A、B混合溶液，依次进样。检测结果，溶剂出峰时间段在2min-5min之间，盐酸戊乙奎醚保留时间为11.633min、12.420min，杂质A保留时间为42.035min，杂质B保留时间为25.577min。结果表明，溶剂与对照品溶液分离度良好，盐酸戊乙奎醚与对照品不产生干扰，此方法专属性强。

(2)精密度：

取杂质A、B对照品溶液依法进样6次，计算精密度，结果见表1：

表1 精密度计算结果

结果表明，同一浓度下进样6次得各杂质峰的RSD均小于1%，符合要求，故该色谱条件下精密度良好。

(3)线性：

取杂质对照品A、B储备液依次稀释成0.3μg/ml，0.5μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml浓度的系列溶液，依法进样，测得浓度线性关系图（附图5、6）。

结论：

杂质A在0.3～1.4μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9998。

杂质B在0.3～1.4μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9992。

(4)检测限与定量限：

分别取杂质对照品溶液用溶剂依次稀释成系列浓度溶液，依法测试，得

杂质A检测限为2ng(0.1μg/ml)、定量限为6ng(0.3μg/ml)。

杂质B检测限为2ng(0.1μg/ml)、定量限为6ng(0.3μg/ml)。

(5)加样回收率：

在盐酸戊乙奎醚供试品溶液中，分别加入低、中、高三种浓度的杂质对照品，配制成含杂质0.08%、0.1%、0.12%的溶液，依法测定，结果见表2、3：

表2 杂质A回收率测定结果

表3 杂质B回收率测定结果

结果显示，三种浓度下测得加样回收率均在90%～110%之间，符合高效液相色谱回收率计算要求，证明了该方法准确可控。

(6)稳定性：

取杂质对照品A、B溶液放置24小时分别取不同时段内样品进样，结果见表4：

表4 溶液稳定性试验结果

由结果可知，各杂质对照品溶液稳定性RSD均小于1%，符合要求，杂质对照品溶液24小时稳定。

(7)样品的测定

用上述方法测定多批盐酸戊乙奎醚，结果见表5：

表5 样品中杂质A、B的含量测定结果

以上结果表明，本方法的专属性强、灵敏度高、精密度好，能准确快速地测定出杂质A、B的含量。

实施例4

参照实施例2的方法，改变流动相B的pH值，结果见表6：

表6 pH值考察结果

结果表明，在pH 2.0~6.0范围内，对杂质A、B的含量测定影响较小，杂质A、B峰型良好，能实现准确测定。

实施例5

参照实施例2的方法，改变流动相B的磷酸盐浓度，结果见表7：

表7 磷酸盐浓度考察结果

结果表明，流动相B中，磷酸盐浓度在1mmo/L-35 mmo/L范围内变化时，对杂质A、B的含量测定影响较小，杂质A、B峰型良好，能实现准确测定。

实施例6

参照实施例2的方法，改变柱温，结果见表8：

表8 柱温考察结果

结果表明，柱温在20-40℃范围内变化，对杂质A、B含量的测定基本没有影响，杂质A、B峰型良好，能实现准确测定。

实施例7

参照实施例2的方法，改变柱流速，结果见表9：

表9 柱流速考察结果

结果表明，柱流速在0.8~1.2ml/min范围内变化，对杂质A、B含量的测定基本没有影响，杂质A、B峰型良好，能实现准确测定。

Claims (6)

1.一种盐酸戊乙奎醚中杂质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；流动相A为乙腈；流动相B为1-35mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中所述磷酸二氢钾溶液中含0.5%三乙胺，稀磷酸调pH至2.0-6.0；照下表进行梯度洗脱：

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：20℃-40℃；

检测器：紫外检测器，波长210nm±10nm；

进样量：20μl；

供试品溶液的配制：精密称取盐酸戊乙奎醚适量，用溶剂溶解配制成每1ml中含盐酸戊乙奎醚1mg的溶液；

杂质对照品溶液的配制：分别精密称取3[2-环戊基-2-苯基-2（2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基）乙氧基]奎宁环烷盐酸盐和α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇杂质对照品适量，用溶剂溶解配制成每1ml中各含3[2-环戊基-2-苯基-2（2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基）乙氧基]奎宁环烷盐酸盐、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇1μg的溶液；

测定法：分别取供试品溶液与对照品溶液进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算盐酸戊乙奎醚中3[2-环戊基-2-苯基-2（2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基）乙氧基]奎宁环烷盐酸盐和α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇杂质的含量；

所述溶剂为流动相A和流动相B的混合溶液，流动相A∶流动相B=32∶68。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的色谱柱温度为35℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的柱流速为1.0ml／min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述波长为210nm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述磷酸二氢钾溶液的浓度为20mmol/L。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述磷酸二氢钾溶液的pH值为3.0。