CN104288222A - 一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物，由质量百分比为牛至油0.4％～10％、液体石蜡0.2％～5％、表面活性剂1.8％～45％、助表面活性剂0.6％～15％、醋酸洗必泰0.1％～5%、蒸馏水20％～96.9％组成。采用本发明的药物治疗奶牛子宫内膜炎，通过子宫灌注给药，疗效显著，具有消炎杀菌、缩宫排脓、促进奶牛子宫机能的恢复。本发明无抗、无残留，安全可靠。

Description

一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药领域，涉及一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物，能抑杀奶牛子宫内膜炎致病菌，促进奶牛子宫机能的恢复，无抗无残留，绿色、安全、高效。具体涉及一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物及其制备方法。

背景技术

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后多发的繁殖障碍性疾病，世界各国的发病率都很高。据报道，我国的发病率为20％～50％，严重影响养殖效率，经济损失巨大。

引发奶牛子宫内膜炎的病原微生物主要为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌，现阶段兽医临床普遍采用抗生素类药物对其治疗有效，但此类药物的大量使用，容易产生耐药性及形成抗生素奶，对人类健康造成潜在危害。因此，研制奶牛子宫内膜炎防治药物应从绿色、健康食品角度出发，未来奶牛药品无药残、不含抗生素的绿色制剂更受行业和奶农欢迎和青睐。

牛至油(Oregano oil)是从植物牛至中提取的一种挥发性香精油，其主要成分有香芹酚、麝香草酚、百里酚、石里醌、双戊烯、伽罗木醇以及香荆芥酚等。牛至油是我国农业部(农牧发[2001120号])批准的可长期在饲料中添加使用的一种药物饲料添加剂。牛至油中的香芹酚等酚类化合物有较强的抗菌活性，能迅速穿透病原微生物的细胞膜，改变其结构，破坏其正常代谢机能；并能有效地阻止线粒体内的呼吸氧化过程，使病原微生物丧失能量而死亡，具有较强的抑制和杀灭多种病原微生物的功能，并且不会产生耐药性，曾被取名“植物抗生素”、“绿色抗生素”。美国农业部的“植物化学和植物物种学”资料表明，牛至油含有30多种抗菌化合物。1996年Sivropoulou等报道，牛至油对8种G⁺菌具有高度抑菌作用，即使在稀释4000倍甚至5000倍时仍可显著抑制菌株的生长。牛至油还具有抗疟疾原虫活性，对埃希氏大肠杆菌、鼠沙门氏杆菌、李斯特菌属、金黄色葡萄球菌等都有高度的抗菌活性。1997年林清华报道，牛至油对31株肠炎常见菌均有不同程度的杀菌和抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，其次是大肠杆菌。

醋酸洗必泰又名醋酸氯已定，由对氯苯胺经重氮化，缩合、消除脱氮、缩合、中和成盐制得，是一种白色或类白色结晶粉末，微溶于水，易溶于乙醇。为动物性食品允许使用，但不需要制定残留限量的药物。目前，药厂生产的醋酸洗必泰栓是治疗人的子宫颈糜烂，化脓性阴道炎的良药。此药没有畜用的。近几年来，在临床实践中，有人曾应用醋酸洗必泰栓治疗奶牛子宫内膜炎185例，治愈率达98％以上，特别对化脓性子宫内膜炎的治疗效果更佳。醋酸洗必泰栓是人用的药物，不能直接投入到奶牛的子宫内，其原因是奶牛的子宫颈发达，长6～10cm，直径2.5～4cm，壁厚而硬、子宫颈收缩很紧，只有在发情期才稍微开放不足1cm。而洗必泰栓的规格一般长3.6cm，宽3cm，厚0.8cm，由于洗必泰栓大于奶牛的子宫颈口，加之发情期分泌出大量液体，特别粘滑，所以不能直接投入到子宫内，也达不到治疗效果。经过多次试验，只有把醋酸洗必泰栓溶解为液体，在奶牛发情时，注入到子宫内。随着我国兽医药法规的不断完善，我国《兽药管理条例》其中第41条命令禁止将人用药品用于动物。所以，兽医临床急需开发兽用醋酸洗必泰制剂。

纳米乳(nanoemulsion)是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等按一定比例自发形成的、粒径为1～100nm的热力学稳定的、各向同性的透明或半透明的均相分散体系。纳米乳分为水包油型(O/W)和油包水型(W/O)两种。其中水包油(O/W)型纳米乳粒度小、亲水性好、单位液体含颗粒数多、分散均匀，稳定性高；吸收利用度高，药物释放迅速，可通过上皮细胞间质直接进入血液循环；能提高水难溶性药物的溶解度，实现不溶和难溶于水的药物可以溶水给药，同时掩盖了药物的不良气味；能够防止某些维生素被氧化；解决了微量添加的药物混合不均匀等难题。

随着奶牛业养殖的规模化、集中化发展以及奶牛业养殖业水平的不断提高和管理的不断规范，奶牛饲养中传染性、烈性疾病就逐步得到控制和减少，如布病、结核杆菌、流行热、蹄炎等疾病将不再是奶牛业的主要疾病。但子宫内膜炎、乳腺炎、蹄病仍是世界范围的奶牛三大疾病。据报道，我国的奶牛子宫内膜炎发病率为20％～50％，严重影响养殖效率，经济损失巨大。兽医临床普遍采用抗生素类药物对其治疗有效，但此类药物的大量使用，容易产生耐药性及形成抗生素奶，对人类健康造成潜在危害。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种适宜于临床治疗奶牛子宫内膜炎的无抗、无残留的纳米药物。该药物主要用于防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等引起的奶牛生殖系统道菌性疾病，抗菌消炎，促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实现上述发明的技术方案是一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物，其原料及其质量百分比为：

上述原料的总重量百分比为100％；

上述原料均为医药级、食品级或饲料级原料；

所述的表面活性剂是聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯醚(40)蓖麻油(EL40)和吐温-80中的任意一种；

所述的助表面活性剂是乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇中的任意一种。

本发明中所述的药物依据《兽药质量标准》包括牛至油、醋酸洗必泰。所述的表面活性剂为聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯醚(40)蓖麻油(EL40)和吐温-80中的任意一种。所述的助表面活性剂为乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇中的任意一种。

本发明的另一目的提供一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

1)在常温常压下，将配方量的牛至油、液体石蜡、表面活性剂混合均匀；

2)将配方量的蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)将配方量的助表面活性剂、醋酸洗必泰加入上述牛至油纳米乳初乳中，搅拌均匀，即得本发明。

本发明的液滴直径大小在1～100nm之间，外观为淡黄色透明液体。

本发明的药物主要用于防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，主要通过灌注给药，连用3～5天，具有抗菌消炎，促进子宫机能恢复，提高经济效益的作用。

本发明的创新之处在于通过纳米技术将新型植物抗生素牛至油、醋酸洗必泰制成了一种缓释纳米药物。该药物解决了牛至油不能与水混溶，醋酸洗必泰溶水性差等问题。本发明的具体特性：制备方法简单，贮存稳定，加水稀释水/油相不分离；液滴粒度小，为透明液体可无限稀释，子宫灌注方便用药；亲水性好，分散均匀，稳定性高，生物利用度比传统剂型可提高60％，个体利用差异减小；扩散性好，冷水中能瞬间分散均匀，微粒接近水分子，与水的耦合力极强，可产生极高的溶解扩散性；与传统药物比较，本发明生物利用率高，无抗无残留，毒副作用少或无，使用方便，安全，高效。

附图说明

图1本发明治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的电镜照片；

图2本发明治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的粒径分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本发明的产品的制备方法。

实施例1

1)在常温常压下，将6.5g牛至油、3.5g液体石蜡、35g吐温-80、混合后，搅拌均匀；

2)将45g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入7.5g乙醇，2.5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释5～10倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例2

1)在常温常压下，将10g牛至油、5g液体石蜡、45g吐温-80、混合后，搅拌均匀；

2)将22.5g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入15g丙二醇和5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释10～20倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例3

1)在常温常压下，将0.4g牛至油、0.2g液体石蜡、1.8g吐温-80、混合后，搅拌均匀；

2)将96.9g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入0.6g乙醇和0.1g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明直接给奶牛子宫灌注，可有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例4

1)在常温常压下，将6.5g牛至油、3.5g液体石蜡、35g聚氧乙烯醚(40)蓖麻油(EL40)混合后，搅拌均匀；

2)将45g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入7.5g丙二醇和2.5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释5～10倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例5

1)在常温常压下，将6.5g牛至油、3.5g液体石蜡、35g聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油(RH40)、混合后，搅拌均匀；

2)将45g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入7.5g乙醇和2.5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释5～10倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例6

1)在常温常压下，将10g牛至油、5g液体石蜡、35g聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油(RH40)混合后，搅拌均匀；

2)将20g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入15g丙二醇和5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释10～20倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例7

1)在常温常压下，将6.5g牛至油、3.5g液体石蜡、35g聚氧乙烯醚(40)蓖麻油(EL40)混合后，搅拌均匀；

2)将45g蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3)再向上述牛至油纳米乳初乳中加入7.5g 1,3-丁二醇和2.5g醋酸洗必泰，搅拌均匀，即得。

将本发明用蒸馏水稀释5～10倍后，可给奶牛子宫灌注，有效防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌菌等引起的奶牛生殖系统细菌性疾病，抗菌消炎、促进子宫机能恢复，减少不孕症，提高养殖效益。

实施例8

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物体外抑菌试验、安全性试验和临床药效试验。

图1本发明治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的电镜照片；图2本发明治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的粒径分布图。

试验例1 体外抑菌试验

1.试验材料

受试药物：本发明实施例1中制备的样品、青链霉素溶液(8万单位/mL，自制)、醋酸洗必泰栓(批准文号：国药准字H21020749，锦州九泰药业有限责任公司)、牛至油纳米乳(西北农林科技大学动物医学院提供)。

试验菌种及培养基：普通琼脂培养板(自制)、普通营养肉汤(自制)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌(均由本校动物疫病分子检测实验室提供)。

2.试验方法

(1)药敏片的制备

选用定性滤纸，用打孔器制成直径为8mm的圆形滤纸片，然后进行高压蒸汽灭菌121℃30min，再用恒温干燥箱进行干燥备用。

取6个灭菌平皿，分别向其中加入本发明原液、5倍稀释液、10倍稀释液、青链霉素溶液(8万单位/mL)、醋酸洗必泰栓溶液、牛至油纳米乳5倍稀释液，然后用眼科镊子将灭菌干燥过的滤纸片一张一张的浸入各个平皿中，以免滤纸片叠在一起，使药液难以完全浸入。置4℃冰箱中24h后，小心将滤纸片移入另外的灭菌平皿中，置60℃恒温干燥箱中干燥备用。

(2)体外抑菌试验

取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌，分别接种于普通营养肉汤中，置37℃恒温培养箱中进行24h培养。分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌的24h肉汤培养物，用灭菌棉签均匀涂布于普通琼脂平板上，各涂6张平板，然后将由本发明原液、5倍稀释液、10倍稀释液、青链霉素溶液(8万单位/mL)、醋酸洗必泰栓溶液、牛至油纳米乳5倍稀释液制备的药敏片贴在不同的平板上，每个平板贴4张相同的药敏片，置37℃恒温培养箱中培养24h。观察抑菌情况并测定抑菌圈的大小。

3.试验结果

结果表明：由本发明原液、5倍稀释液、10倍稀释液制备的药敏片比由青链霉素溶液(8万单位/mL)、醋酸洗必泰栓溶液、牛至油纳米乳5倍稀释液制备的药敏片具有更高的抑菌作用。见表1

表1 体外抑菌试验结果

试验例2 安全性试验

1.试验材料

受试药物：本发明实施例1中制备的样品。

试验动物：小白鼠60只、雌雄各半、体重(18±2)g；家兔18只、雌雄各半、体重(2.5±0.5)Kg。

2.试验方法

(1)毒性试验

取小白鼠60只，随机分为3组，每组20只(雌雄各半)。第1组经口灌胃本发明原液。第2组经口灌胃本发明5倍稀释液。第3组经口灌胃本发明10倍稀释液。每天3次，每次灌胃1mL，连续灌胃3天。详细观察每组动物的表现，并记录死亡数。

(2)刺激性试验

取家兔18只，随机分为3组，每组6只。第1组家兔所用药物为本发明原液，第2组为5倍稀释液，第3组为10倍稀释液。

皮肤刺激试验：各组家兔，给药前24h，在家兔背部两侧用硫化钠各脱毛各5cm×10cm。采用同体自身左右对比，左侧脱毛区涂药，右侧脱毛区不涂药，给药24h后，用温水去除残留药物，分别于去除后1h、24h、48h、72h肉眼观察，并记录涂抹处有无红斑和水肿等情况。

眼刺激试验：各组家兔放在固定箱中，将眼睑拉成环形，并用手指压住鼻泪管，以防药液流入鼻泪管中。采用同体自身左右对比，左侧眼睛滴药，右侧眼睛不滴药。各组家兔在滴加不同浓度的药液时，每次滴加0.1m1，1min后放手任药液自然流出。在给药30min内，每隔5min检查1次眼泪分泌，在给药30min后，每隔1h轻轻翻开眼皮，观察结膜的反应，以及有无明显的充血、流汨、羞明、水肿等刺激性症状。

3.试验结果

(1)毒性试验

结果显示：试验1组的死亡率为15％，试验2组的死亡率为5％，两者差异显著；试验3组无死亡。见表2

表2 毒性试验结果

(2)刺激性试验

结果显示：所制备的本发明原液对家兔的皮肤表现为无刺激，对眼稍有刺激，属于弱刺激；本发明5倍稀释液和10倍稀释液表现为对皮肤和黏膜均为无刺激性。见表3

表3 家兔刺激性试验结果

(+++强刺激++中等刺激+弱刺激-无刺激)

试验例3 临床药效试验

1.试验材料

受试药物：本发明实施例1中制备的样品、青链霉素溶液(8万单位/mL，自制)、醋酸洗必泰栓(批准文号：国药准字H21020749，锦州九泰药业有限责任公司)、牛至油纳米乳(西北农林科技大学动物医学院提供)。

受试动物：挑选患有临床型子宫内膜炎的奶牛42头(分别来自泾阳县某奶牛场)，实验前奶牛均未给予其他任何药物。对试验奶牛逐一进行临床检查，包括体温、脉搏、呼吸及营养状况等，并对其胎次、病程和治疗次数进行统计，将病牛随机分为六组，每组7头。第1组为试验高剂量组(本发明原液)、第2组为试验中剂量组(本发明5倍稀释液)、第3组为试验低剂量组(本发明10倍稀释液)，第4组为对照组(青链霉素溶液8万单位/mL),第5组为对照组(人用醋酸洗必泰栓),第6组为对照组(牛至油纳米乳)。

2.试验方法

将药液温浴至接近体温温度，通过直肠把握法，用输精器将药液注入子宫，第1组试验高剂量组注入本发明原液100mL，第2组试验中剂量组注入本发明5倍稀释液100mL、第3组试验低剂量组注入本发明10倍稀释液100mL，第4组对照组注入青霉素溶液(8万单位/mL)100mL，第5组对照组注入醋酸洗必泰溶液100mL(将2枚人用醋酸洗必泰栓溶于100mL蒸馏水中)，第6组对照组注入自制牛至油纳米乳5倍稀释液100mL(自制)。3次为一个疗程，经3次未治愈者改用其他药物治疗。

3.试验结果

奶牛子宫内膜炎的疗效判定标准：

治愈：从阴门无粘性或粘脓性分泌物排出，用开腟器打开阴道检查，阴道、腟部及子宫颈口处均无炎性分泌物，非发情时，子宫颈口关闭，呈粉红色(无充血)；直肠检查，子宫的收缩、大小及质地恢复正常；停止治疗后30天内恢复正常发情，且黏液正常，可进行人工受精，各实验室检查均无异常。

显效：从阴门无粘性或粘脓性分泌物排出。用开腟器打开阴道检查，阴道、腟部及子宫颈口处均无炎性分泌物，非发情时，子宫颈口关闭，呈粉红色(无充血)；直肠检查，子宫的收缩、大小及质地基本恢复正常；停止治疗后30天内，未恢复正常发情，或虽然恢复发情但黏液仍不正常(混有脓絮或不够清亮或韧性差)，不能进行人工受精。实验室检查，各种指标接近正常。

有效：临床症状明显改善。阴门仍有炎性分泌物排出，但排出量明显减少，且脓性分泌物比例降低。用开腟器打开阴道检查，阴道、子宫颈口仍可见少量炎性分泌物存在；非发情时，子宫颈口仍开张且充血；直肠检查，子宫的收缩反应增加、子宫体和子宫角变小，质地改善。实验室检查，大多数指标接近正常。

无效：各种检查及临床症状未见好转或有所加重。实验室检查，各种指标无明显变化。

最后一次用药后第10天，依据疗效判定标准进行疗效判定，试验结果显示，本发明的高剂量组、中剂量组的治愈头数明显高于低剂量组和对照组，高剂量组与中剂量组之间无明显差异；用3次则可有效治疗奶牛子宫内膜炎。高、中、低剂量组的治愈率分别为86％、86％、和57％，对照组1、对照组2和对照组3分别为43％、57％和43％。经统计分析，高剂量组与中剂量组之间无显著差异(P＞0.05)，与低剂量组间显著差异(P＜0.05)，与3个对照组显著差异(P＜0.05)；中剂量组与低剂量组、3个对照组之间差异显著(P＜0.05)；低剂量组与3个对照组之间无显著差异(P＞0.05)。见表4

表4 患临床型子宫内膜炎奶牛临床治疗效果

Claims (2)

1.一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物，其特征在于，该药物为纳米乳剂型，其粒径在1～100nm之间，其原料及其质量百分比为：

牛至油           0.4％～10％     

液体石蜡         0.2％～5％   

表面活性剂       1.8％～45％  

助表面活性剂     0.6％～15％  

醋酸洗必泰       0.1％～5%

蒸馏水           20％～96.9％

上述原料的总重量百分比为100%；

上述原料均为医药级、食品级或饲料级原料；

所述的表面活性剂是聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油、聚氧乙烯醚40蓖麻油和吐温-80中的任意一种；

所述的助表面活性剂是乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇中的任意一种。

2.权利要求1所述的一种治疗奶牛子宫内膜炎的纳米药物的制备方法，其特征在于，它包括下列步骤：

1) 在常温常压下，将配方量的牛至油、液体石蜡、表面活性剂混合均匀；

2）将配方量的蒸馏水缓慢加入上述混合物中，边加边搅拌，开始时体系黏度较小，随着水的加入，体系会变黏稠，继续滴加并不断搅拌，直至形成牛至油纳米乳初乳；

3) 将配方量的助表面活性剂、醋酸洗必泰加入上述牛至油纳米乳初乳中，搅拌均匀，即得。