CN104271118A - 合成脂质体肺表面活性物质的冷冻干燥 - Google Patents
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Abstract
对具有增加的比表面积和孔隙率的冷冻干燥肺表面活性物质进行了描述。使用所述冷冻干燥的肺表面活性物质的方法也被描述。
Description
本发明的背景
1.发明领域
本发明涉及一种固体合成的肺表面活性物质及其制造方法。
2.相关领域描述
肺表面活性物质(也称为“肺表面活性物质”)是脂质和蛋白质的复杂混合物，其促进在肺泡的气-水界面的单层形成，并且，通过降低表面张力，可以防止呼气时肺泡的崩溃。肺表面活性物质分布于成熟哺乳动物肺部的肺泡上皮细胞。天然肺表面活性物质已被描述为“脂蛋白复合物”，因为它同时包含磷脂和脱辅基蛋白，其相互作用，以减少在肺气-液界面的表面张力。四种蛋白质已被发现与肺表面活性物质相关联，即SP-A，SP-B，SP-C和SP-D。具体地说，SP-B似乎是对肺表面活性物质的生物物理作用而言是必不可少的。它被接受的治疗，其用于各种呼吸障碍的治疗，以施用肺表面活性物质至病人的肺。
从药理学角度来看，治疗中使用的最佳的外源性肺表面活性物质完全是在实验室中合成的。在这点上，已发现有用的SP-B的一个模拟物是KL4，这是一种21个氨基酸的阳离子多肽。
用于以商业规模制造医疗用途的肺表面活性物质的一种方法是通过利用薄膜蒸发器(TFE)单元的操作的方法。适用于生产KL4肺表面活性物质的方法，由以下步骤组成：1)在乙醇中增溶四个主要制剂组分，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸(PA)和KL4；2)利用TFE除去乙醇；和3)将最终分散体分配到小瓶中。TFE单元的操作本身是复杂的，并具有规模限制。具体而言，1平方英尺TFE产生40升的批次，和最大的可获得单位是10平方英尺TFE。这限制了批量大小，这是不可取的，因为被证明与KL4表面活性物质相关的其它适应症，需要不断增加的量的表面活性物质。此外，在无菌条件下进行所述方法，这对成本，调度的灵活性，以及产品的复杂性作出显著贡献。
除了使用TFE的成本和复杂性，由于该组合物被储存在液体状态，存在进一步的复杂化。因为所述组合物的多肽和脂质组分受到降解，溶液必须保持冷藏以延缓任何降解和实现长期稳定性。
冻干或冷冻干燥是在制造固体药物制剂中的重要过程。固体制剂具有比液体制剂更长的稳定性和易于运输和存储。在冷冻干燥过程中，药物制剂可被干燥到2％的残余水分含量或以下而不升高温度高于30℃。因此，这个方法与高温过程，例如喷雾干燥相比，更不可能导致配制剂的热降解。
冷冻干燥过程涉及冷冻液体制剂，和通过从固相直接升华到气相，除去与所述制剂关联的溶剂，而不通过中间的液相。一般来说，冷冻干燥过程由以下三个阶段组成，冷冻阶段，第一干燥和第二干燥。
冷冻是通过将材料冷却在小于或等于0℃的给定温度以下而固化起始液体的过程。第一干燥是冷冻干燥循环的一部分，其中大部分的冷冻溶剂的升华被除去，同时将材料保持在低于阈值温度，以保持在冷冻期间建立的结构。第二干燥是残留水分的部分的解吸过程，通常是在25℃以上的温度进行。与这三个步骤中每个相关联的关键方法参数是搁板温度(shelf time)，腔室压力和时间。
冷冻干燥方法通过几十年不断发展。尽管在该领域发展了充分的知识，依然存在以合理的成本和时间商业规模产生均匀分布的块状物的挑战，所述块状物具有机械稳定结构。
伯恩斯坦的美国专利号5952303描述了冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，其通过冷冻干燥磷脂，棕榈酸和肽的组合的水性悬浮液而获得。
约翰逊的美国专利号7582312描述了通过冷冻干燥磷脂，棕榈酸和肽在含有20％或更多的有机溶剂的溶剂体系中的液体制剂而制备冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的方法。
使用在这些以上专利中描述的冷冻干燥方法，以用于冷冻干燥具有范围为5％或以上至小于20％的有机溶剂的液体合成的肺表面活性物质，产生了商业分配不可接受的易碎的和崩溃的物质。使用先前描述的冷冻干燥循环的合成肺表面活性物质的制造，导致物质从小瓶底上升(“悬浮”)，这将导致降低的热转移，不均匀的热分布和产生具有不同质量属性，例如物理形态和残留水分的产品。
因此，需要制备肺表面活化剂组合物的改进的方法和改进的肺表面活性物质组合物。本发明提出了针对制造干式合成的肺表面活性物质的问题的技术方案，所述肺表面活性物质在冷冻干燥过程中在化学上和机械上是稳定的，而不损害其生物活性。
本文引用的所有参考文献都通过引用以其整体并入本文。
发明内容概要
本发明的一个方面特征是，一种制备冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的方法，所述肺表面活性物质具有在方法中减少或消除的块状物悬浮(cake levitation)。该方法包括：将预冷冻干燥混合物提供至冷冻干燥室，所述预冷冻干燥混合物包含至少一种磷脂和合成肽，所述磷脂和合成肽分散在溶剂中，所述溶剂具有有机溶剂，并且其余的是水和/或缓冲剂，所述有机溶剂为范围为预冷冻干燥混合物的3％(v/v)至20％以下(v/v)的有机溶剂，其中，所述预冷冻干燥混合物填充到容器中，并且其中，所述合成肽具有至少10个氨基酸残基，并且由下式表示：
(ZaUb)cZd
其中Z表示亲水性氨基酸残基，U表示疏水性氨基酸残基；其中每个Z独立地为R，D，E或K；每个U独立地是V，I，L，C，Y或F；而其中a是整数，其具有约1至约5的平均值；b为整数，其具有约3至约20的平均值；c是约1至约10的整数；d是约1至约3的整数；降低冷冻干燥室中的温度，开始冷却，并在冷冻阶段固化预冷冻干燥混合物；和在第一干燥阶段前进行退火阶段，从而减少或消除在冷冻干燥的合成的肺表面活性物质中的块状物悬浮。
在一个实施方案中，还包括在冷冻干燥室中在降低温度的过程中进行冷冻干燥阶段，其中采用0.1至1.0℃/分钟的速率将所述预冷冻干燥混合物冷却到低于-45℃的第一温度，并在所述第一温度保持预冷冻干燥混合物第一时间期间，所述时间期间足以固化至少76％的溶剂，以形成第一固化混合物；进行退火阶段，由此减少或消除第一固化混合物的块状物悬浮，其中，所述第一固化混合物是(ⅰ)加热至第二温度，所述第二温度被选定以减少或消除第一固化混合物的悬浮，(ⅱ)在第二温度保持第二时间期间，所述第二时间期间足以减少或消除所述第一固化混合物的悬浮，以及(iii)以0.1至1.0℃/分钟的速率冷却至-45℃以下的第三温度，以形成第二固化混合物，其中所述第二固化混合物在所述第三温度被保持第三时间期间，所述第三时间期间足以促进未冷冻的有机溶剂从所述第二固化混合物分离，从而使得未冷冻的有机溶剂迁移到容器和第二固化混合物之间的界面；在30mT或更高的降低的压力进行第一干燥阶段，其中，所述第二固化混合物在第四温度保持第四时间期间，所述第四时间期间足以除去至少5％的有机溶剂，随后加热到第四温度，所述第四温度足以保持所述第二固化混合物不在容器中悬浮，并保持在退火阶段建立的结构，并在第四温度下保持第五时间期间，所述时间期间足以除去至少70％的溶剂，并由此形成第三固化混合物；并在降低的压力进行第二干燥阶段，持续第六时间期间，所述第六时间期间足以产生冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有至多2％的残余溶剂含量。
在该方法的某些实施方案中，预冷冻干燥混合物在容器中的体积与容器的体积的比率为约28％至约68％。
在该方法的某些实施方案中，预冷冻干燥混合物在容器中的高度与容器的直径的比例是在约0.3至约0.8的范围内。
在某些实施方案中，该方法包括：提供预冷冻干燥混合物，其中所述有机溶剂在约3％至约15％的范围内。更具体地，有机溶剂是在约5％至约10％的范围内。甚至更具体地，所述有机溶剂在约7％至约10％的范围内。
对方法的任何上述的变化可以通过以下实践：(1)进行冷冻阶段，使得预冷冻干燥混合物以0.1至和1.0℃/分钟的速率被冷却至-50℃±5℃的第一温度；(2)进行退火阶段，使得所述第一固化混合物是(ⅰ)以0.1至1.0℃/分钟的速率加热至-22℃±5℃的第二温度，(ⅱ)在第二温度保持4小时至8小时的第二时间期间，(ⅲ)以0.1至1.0℃/分钟的速率冷却至-50℃±5℃的第三温度；及(iv)在所述第三温度保持约3至8小时的第三时间期间；(3)在选自约30mT至大约200mT的压力和选自约-25℃至0℃的从-50℃±5℃倾斜升温(ramped up)的第一干燥温度，进行第一干燥阶段，并在第一干燥温度进一步保持至少10小时。
在上述的概括方法的某些实施方案中，在选自约30mT至大约200mT的范围的压力和至多46℃±5℃的温度进行第二干燥阶段。
在上述方法的各种实施方案中，预冷冻干燥混合物包含具有SEQID NO：1的肽(KL4多肽)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸，并且该方法产生冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，其具有至少2.2m2/g的比表面积。在具体的实施方案中，比表面积是在约3.7m2/g至约2.2m2/g的范围内。在某些实施方案中，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的孔隙率在冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的总面积的40％体积以上。
本发明的另一个方面的特征是，冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的组合物，它包括一种或多种磷脂和具有至少10个氨基酸残基和由下式表示的合成多肽：
(ZaUb)cZd
其中Z表示亲水性氨基酸残基，U表示疏水性氨基酸残基；其中每个Z独立地为R，D，E或K；每个U独立地是V，I，L，C，Y或F；而其中a是整数，其具有约1至约5的平均值；b为整数，其具有约3至约20的平均值；c是约1至约10的整数；d是约1至约3的整数，其中，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质组合物具有的比表面积为至少2.7m2/g。
在某些实施方案中，冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的比表面积的范围是从约3.7m2/g至约2.7m2/g。
在某些实施方案中，冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的孔隙率在冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的总面积的40％体积以上。
在某些实施方案中，冷冻干燥的合成的肺表面活性物质包括：具有SEQ ID NO：1的肽(KL4多肽)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸。
附图的多个视图的简要说明
图1是条形图，其显示在倒置后小瓶中的冷冻干燥物质的移动或缺乏运动，包含倒置后移动的冷冻干燥物质的小瓶的数量(被示为黑色条)和含有在倒置后不移动的冷冻干燥物质的小瓶的数量(被示为阴影条)(见实施例5)。
图2是图，其显示在冷冻干燥过程中物质的悬浮(见实施例5)。
图3A和3B是本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质在30毫升的小瓶产生的扫描电子显微镜(SEM)图像，采用X20的放大率，分别为表面A和表面B。
图4A和4B是冷冻干燥的肺表面活性物质制剂II的SEM图像，所述制剂II在30毫升的小瓶中由Bornstein Lyo Cycle制成，如实施例3中所述，采用X20的放大率，分别为表面A和表面B。
图5A和5B是在30ml小瓶中制成的本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质的SEM图像，采用X100的放大率，分别为表面A和表面B。
图6A和6B是冷冻干燥的肺表面活性物质制剂II的SEM图像，所述制剂II在30毫升的小瓶中由Bornstein Lyo Cycle制成，如实施例3中所述，采用X100的放大率，分别为表面A和表面B。
本发明优选实施方式的详细说明
已经发现，可以通过一种改进的冷冻干燥循环来制造干燥的合成肺表面活性物质，其具有均匀分布的固体，所述肺表面活性物质设置在机械稳定的，刚性的制剂中，所述制剂能够承受通过空气运送和处理。
一种冷冻干燥的药物制剂，被预期在结构和纹理方面具有均匀外观的和良好的物理强度(例如，能够承受运输和处理)以适合于商业分配。均匀外观已与改进的稳定性和药物活性较小的变异，药物外观优美性，残留的水分和重构时间相关联。
冷冻干燥含有脂质体组合物和有机溶剂的悬浮液的药物制剂是一种复杂的任务，因为有机溶剂被捕获作为非冷冻液体和以不同于其它冷冻的液体例如冰的速率汽化，因此，产生溶剂组合物的变化，从而导致丧失过程控制，难以维持腔室压力的关键过程参数，以及难以控制在干燥的产物中残留溶剂的存在。
尝试使用在美国专利号5952303和7582312中描述的冷冻干燥循环从包含3％至20％范围内的有机溶剂的预冷冻干燥混合物产生干燥合成的肺表面活性物质，该尝试没有提供商业上可接受的产物。所得到的产物具有沿冷冻干燥小瓶的表面非均匀地分布的固体；所述固体在过程中似乎已在小瓶中悬浮，并有塌陷的粉状表面。
搁板温度，压力和时间的常规修改并没有得到期望的产物，其具有在结构和纹理方面均匀的外观和良好的物理强度(例如，在小瓶(在其中冷冻干燥产物被冷冻干燥)倒置后能够保持其形状和保持在合适的位置的冷冻干燥产物)。在开发本发明的冷冻干燥方法中的初始步骤是确定与物质相关的热分析数据，所述数据是那些包含在制剂中含有的具体成分和成分的比例所固有的(大部分无定形的赋形剂也含在缓冲剂和有机溶剂中的盐)。通过进行冷冻干燥显微术(FDM)，电阻(ER)和低温差示扫描量热法(LT-DSC)测量，进行此热分析。热分析提供了重要的信息，例如足够的固化温度与阈值温度数据，在其中在第一干燥过程中冰的存在下同时安全地干燥该物质，以确保保留在冷冻步骤期间建立的结构。基于方法过程中有机组分的性质和行为的知识，预期该完全固化不能在用于常规的冷冻干燥方法中的条件来实现。这个事实提出进一步显著处理挑战，因为本体溶液(即，预冷冻干燥混合物)包括溶剂体系，其具有在3％至20％以下的，优选3％至15％，更优选5％至10％，更优选为7％到10％(v/v)范围内的预冷冻干燥混合物总体积的挥发性组分，如有机溶剂，所述溶剂体系其余为水和/或缓冲剂。挥发性组分有低于冷凝器可以达到的温度的熔点。因此，有机溶剂不能由冷凝器固化，在整个干燥过程中通常不能有效通过冷凝器收集，这正是常规方法中的情况。在这个过程中，在冷冻干燥的干燥阶段，由于产物中的溶剂和冷凝器之间的温差，采用降低的腔室压力从物质除去的有机蒸气，被暂时收集在冷凝器表面上。这些蒸气，当在冷凝器的表面上时，存在于液体状态。与降低到所述冷凝器的温度时收集的作为液体的各有机溶剂相关的蒸气压，比所述腔室的压力足够高，从而导致后续的有机液体转换回到蒸气状态。这一系列事件被称为回流(蒸气>液体>蒸气)和在整个过程中连续重复，直到随着时间的推移，使有机蒸气摆脱冷凝器的束缚，和由真空泵从腔室被移除。同时，在回流状态下的物质是不断释放热能(蒸气到液体)，和消耗热能(液体到蒸气)，以从一个相转移到另一个相。收集在冷凝器中的物质，作为结果，经受回流相关的热的吸收和释放，并且不再能够保持稳定状态的条件。如果冰的升华是在有机溶剂的回流过程中，以较高的水平发生，那么冷凝器的恒定的温度波动和自由表面积的量，在没有回流的有机溶剂的情况下，都会对以下产生影响：水蒸气的冷凝至冰，控制的腔室压力，并最终对来自产物的冰升华产生影响。冷冻干燥的传统方法是冰的升华，以形成水蒸气和在冷凝器收集时水蒸气转换回冰，并且被认为是本领域现有技术。基于存在的有机溶剂所引起的挑战，并且结合在处理期间块状物悬浮的惯例，为成功地克服这些影响，实施具体的两步第一干燥应用。两个第一干燥段的目的是为了从冷冻水的升华分离出来自基质/小瓶界面的任何外围有机溶剂的蒸发。质谱仪被用来测量冷冻干燥室中残余气体的含量。这些数据表明，在第一干燥的初始段有机溶剂被去除，和该特定段的目标循环参数导致有机溶剂的下降水平，这表明该过程可以前进到第一干燥的第二部分。使用这种技术，通过实现专用于通过蒸发除去游离的溶剂的段，导致第一次消除在目标呈现中的块状物悬浮。然后详尽论述的是，在此初始段除去未冷冻的有机溶剂能够降低块状物悬浮的现象，如果第一干燥相关段的参数，如冷冻，退火和升温速率，可进一步被控制，以规避与在小瓶中悬浮有关的产物的移动性。
本发明人确定悬浮的原因之一是通过以前采用冷冻温度-30℃和-40℃达到固化不足。通过降低搁板温度到-45℃，并提高第一干燥步骤期间腔室压力以减少悬浮的各种尝试没有产生显著改进。在冷冻干燥混合物中存在醇创造了“润滑”作用；当块状物被置于更温暖的温度下，沿所述小瓶的侧面的醇的存在使块状物悬浮起来。通过在冷冻阶段降低最终冷冻温度至-45℃或更低，包括在第一干燥阶段以前，退火的热处理，以使更多的有机溶剂从混合物中分离出来，消除悬浮。冷冻阶段的优选参数如下：逐步冷却到搁板温度-45℃或更低，优选-50℃至-40℃(“最终冷冻温度”)，随后是在搁板温度保持1-10小时，优选2-8小时，更优选3-5小时，前述所有均在大气压下进行。在预冷冻干燥混合物在2-8℃在搁板上进行平衡数小时后，开始逐渐冷却，然后开始以0.1到1℃/分钟的近似速率将温度降低。
进一步地，为了改善处理时间并仍然保持所需的均匀性和外观，本发明人分析样品的体积和小瓶的尺寸之间的比率。因为块状物悬浮是一种罕见的现象，新的是，仅仅基于产生冷冻块状物附着的更大的表面积，以评估在不同小瓶尺寸情况下的处理行为，而不是基于获得针对小瓶比例的最小填充高度而评估各个小瓶尺寸的常规方法。出人意料的是，发现的是，使小瓶大小在20毫升容量至50ml容量之间变化，同时具有相同的初始填充量(13.7毫升)，没有针对从较小的小瓶到最大尺寸的小瓶，提供冷冻干燥块状物外观的相关改善。虽然30mL小瓶样品具有比20ml小瓶样品更均匀分布的块状物，50ml的小瓶样品比20ml小瓶样品更不均匀。在50毫升容量的小瓶中处理的物质缺乏改进，很可能与在该容器中观察到的块状物悬浮的升高水平相关，所述水平与所得到的块状物高度相关，前述块状物悬浮的升高水平是比20立方厘米和30立方厘米的小瓶的块状物高度更高的水平。在扩大规模的填充时，填充体积(预冷冻干燥混合物的体积)和小瓶(或用于保存填充物的其它类型容器)体积和/或预冷冻干燥混合物在小瓶中的预冷冻干燥混合物填充高度与小瓶直径之间的比率，应被观察以消除小瓶中填充物质的悬浮。小瓶中填充高度与小瓶直径之比应在以下范围中：约0.3至约0.8，优选约0.4至约0.7，并且更优选为约0.5至约0.6。填充体积与小瓶体积之比应为约28％至约68％，优选的范围是从约35％至约55％。但是应当理解的是，在这些计算中所用的小瓶的体积的“列出的”体积(即在目录和贸易的小册子中列出的体积)，而不是实际的内部体积，其中，所列出的量可以与实际体积相差大约10％。
本发明人确定，冷冻阶段后增加退火阶段，或将退火阶段作为达到最终冷冻温度之前的中间步骤，有助于创造更刚性的块状物，所述块状物具有膨胀骨架，所述骨架将附着于靠近小瓶侧面和底部，并因此消除了固体悬浮。通过增加退火阶段取得的另一个目标是获得升华速率的增加，从而，减少总的处理时间，而不会危害块状物外观。
退火阶段将在下面详细说明。术语“退火阶段”是指热处理条件，其促进混合物的组分分离和/或组分的结晶。该热处理可能涉及(A)冷却至中间温度，随后进一步冷却到最终的低温(“最终冷冻温度”)，或(B)冷却到低的温度，然后加热至中间温度，然后再冷却到最终的低温，或(C)冷却到低温，然后升温至中间温度。“退火阶段”发生在冷冻干燥方法的冷冻阶段。退火的实施通过产生刚性的冷冻基质增加了，防止加工过程中块状物从小瓶的底部悬浮起来的可能性。此外，退火促进了未冷冻的溶剂迁移到小瓶/基质界面，并在用于第一干燥的初始条件期间进一步促进溶剂从产物的后续分离，从而有效地降低溶剂的量，并且使溶质，即，API和缓冲盐，更具有刚性，而任何未冻的水转化成冰。中间温度是基于物质的低温热分析和视觉表征而选择，在所述表征中，确定玻璃化转变温度(Tg')或与观察到的物理变化相应的温度。低温是基于物质的热分析和视觉表征而选择，在所述表征中，测量完全固化的温度。Tg'或其他观察到的物理变化，如在不透明性或液体状运动的变化决定了中间温度，在所述中间温度产物应该被退火，并且完全固化的温度决定了，何种低温设定点应该被用来促进理想的冷冻物质的属性，所述属性用于进行第一干燥。具体地，该物质应在高于Tg'几度的温度进行退火，或观察到的物理变化，和在最低限度，该物质应该被冷却到等于或低于完全固化的温度的温度。对于本文件中描述为制剂I的物质，在热分析期间，观察到的液体状运动物理变化是在-28℃的温度(在冷冻干燥显微镜下观察到液体状运动的温度)被观察到的。在某些实施方案中，在-45℃观察到完全的固化温度。必须在中间或低保持前首先确认成核。每个A，B和C的变体的温度是相同的或相似的，但是，所述温度被执行的顺序将发生变化。温度的选择可基于制剂组分或阈值温度。该阈值温度被定义为如下温度：该产物的温度需要在第一干燥期间必须保持低于前述阈值温度，而在冰的存在下，以避免崩溃，熔融，或在某些情况下避免块状物悬浮。
在某些实施方案中，如在上述变化(B)中所述进行退火步骤。在这些实施例中，退火阶段包括以下步骤：将冷冻块状物以选自约0.1℃/分钟至约1℃/分钟(加温步骤)的速率从-45℃+/-5℃(最终的冷冻温度)升温至-22℃+/-5℃(中间温度)，和在-22℃+/-5℃保持足以促进有机溶剂从溶质混合物中分离的一段时间，和造成更为刚性的固体以减少或消除悬浮，优选3-8小时(保持步骤)，然后以约0.1℃/分钟至约1℃/分钟的速率再冷却至-45℃+/-5℃(冷却步骤)和在-45℃+/-5℃保持确保充分固化的一段时间，例如，3-8小时，优选4小时，其中，在大气压下进行所有的四个步骤。在某些实施方案中，所述退火步骤是如在实施例2中，和9-13中所述进行。
可选地，充分固化可以如下实现：通过以选自约0.1℃/分至约1℃/分钟的范围的恒定速率将小瓶冷却至最终的低温直到达到所需的温度，直接冷却到最终的低温，无最后保持步骤。在另一个实施方案中(上述变体(A))，进行退火阶段，所述退火阶段作为在冷冻阶段达到最终低温之前的中间步骤。在本实施例中，退火阶段在搁板的温度达到液体产物(约-15℃+/-5℃)(一种“成核温度”)成核的温度时开始，和包括在成核温度保持一段时间，所述一段时间足以使水转化为冰和分离混合物中的溶质，所述一段时间在45分钟和4小时之间(中间保持步骤)，然后继续以0.1℃/分钟至1.0℃/分钟的速率将混合物冷却，直至达到所需的最终冷冻温度(-50℃+/-5℃)并在此温度进行保持步骤，直至冷冻阶段完成。
在一个实施方案中，退火阶段包括以0.1为1℃/分钟的速率将冷冻块状物从-50℃+/-5℃升温至-22℃+/-5℃和在-22℃+/-5℃保持3-8小时，然后以0.1至1℃/min的速率再次冷却到-50℃+/-5℃，并在-50℃下+/-5℃保持3-8小时，优选4小时，其中均在大气压下进行所有的四个步骤。
在某些实施方案中，如上述变化(A)中所述进行退火步骤。中间温度可选自-10℃至-35℃。在中间温度下的保持是持续一段时间，所述一段时间足以将水转换为冰和分离混合物中溶质，所述一段时间在45分钟至4小时之间。以0.1至1℃/分钟的近似速率倾斜升温至最终冷冻温度，随后在该温度下保持约0.5至5小时，直到固化阶段进行完毕。然后如所描述的进行第一干燥步骤。这种方法的一个实施例在实施例14中进行了描述，见表16。
第一干燥阶段在降低的压力(真空)进行，并包括以下步骤：前一步骤的温度任选地保持足以汽化至少5％，优选为，5至10％的有机溶剂的一段时间，以0.1℃/分钟至2℃/分钟的速度和30mT至200mT，优选40mT的+/-10mT的压力，从前面步骤的温度-50℃+/-5℃逐渐倾斜升温至约-25℃至约0℃(第一干燥温度)的范围内的温度(加热步骤)，之后是第一干燥温度的保持步骤，其持续一段时间，所述一段时间足以升华溶剂的至少70％，优选至少80％，优选有机溶剂的5至10％，或如果任选的保持步骤不进行，那么持续足以升华至少80％的溶剂的一段时间。保持步骤可以持续10小时或更久。在某些实施方案中，所述保持步骤是18至140小时，优选18-100小时。将第一干燥的温度选择为0℃至-25℃是基于保持小瓶中的样品不悬浮，干燥并保留冷冻过程中建立的结构的愿望。由退火阶段的设计增强优化第一干燥阶段的持续时间的能力。
接着，对第二干燥阶段进行说明。第二干燥阶段的目的是，通过提高在第一干燥阶段获得的产物的温度，典型地，至超环境温度，以除去任何残留的水并在选定的温度保持一段时间，以降低在第一干燥阶段获得的产物中的残余水分含量，所述一段时间足以产生冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有至多2％的残余溶剂含量。第二干燥温度的典型范围是20℃至30℃。然而，在第二干燥温度范围可低至-7℃到高达+60℃。第二干燥温度设定点应该基于以下来选择：1)通过实施搁板温度在第二干燥阶段保持产物稳定，所述搁板温度保持产物温度低于所观察到的Tg至少5℃，和2)通过实现温度促进解吸，所述温度是温暖的，足以将残留水分有效地减少至规范之内，所述规范采用商业上合理的速度。所观察到的制剂I的Tg是在45℃～51℃，所以在第二干燥期间的温度可高达46℃。残留水分的结果表明，在25℃的第二干燥温度设定点有效实现残留水分的结果。接着，在所选择的第二干燥温度保持所述产物一段时间，所述一段时间足以产生最终产物，所述最终产物具有至多2％的残余溶剂含量。评估干燥是否完成的方式之一是执行压力上升测试(奖赏测试)，其中10微米的压力指示残留水分是在规范内。在某些实施方案中，通过以0.1至1℃/分钟的速率，优选以0.2至0.5℃/分钟的速率，将上一步骤中的搁板温度加热至25℃+/-3℃，从而进行第二干燥阶段。此阶段也作为前一阶段(previous phase)在真空中进行。优选的压力范围是从30mT至500mT，更优选地，从40mT到150mT。产物达到所选择的搁板温度后，在25℃+/-3℃进行保持步骤4～10小时，优选6小时。
然后在最终完全插入塞子和密封以贮存前，用0.5巴惰性气体例如，氮吹扫冷冻干燥的物质。
为了确定目标循环参数的再现性，用相同的冷冻干燥循环加工后，比较重要的产物属性，如温度分布剖面图(temperature profile)，升华中断温度(break temperature)和成品特征。升华“中断”温度是恰在时间点之前的温度，在所述时间点在第一干燥期间产物温度极度接近搁板温度。产物温度“中断”表示，在给定的容器中升华完成，同时考虑测量热电偶的放置被定位在位置中(底部中心)，在所述位置中冰可能最后被发现。对于方法中的每一个有意义的步骤(如退火，冷冻，第一干燥，升华中断和第二干燥)，这两项研究的产物温度范围，对于退火和冷冻而言，均在0.5℃之内，对于第一干燥和升华中断而言，在1℃之内，并且对于第二干燥而言，在1.5℃之内。基于这种标称变化，在加工过程中的热行为被认为是可重现的。升华结束时间范围的评估显示，在不同研究中，在6小时内已经完成了升华，也暗示充足的重现性。最后，成品的评估，如物理外观，残余水分，重构时间，溶液的澄清度，重构的pH，热失重法(thermogravimetric massloss)(TGA)和高温差示扫描量热法(HT-DSC)都得到类似的结果，这进一步支持了在规模较大的不同研究中重现一致的产物质量的能力。从这些研究评估得出的结论是，被实施以冷冻干燥合成的肺表面活性物质的冷冻干燥循环参数是稳定的并且足以获得一致的物质，所述一致的物质具有可接受的产物质量属性而没有块状物悬浮的现象，所述合成的肺表面活性物质含有的有机溶剂为预冷冻干燥混合物的总体积的3至20％以下，优选3％至15％，更优选从5％至10％，并且更优选从7％到10％(v/v)。
冷冻干燥是在四搁板冷冻干燥机设备中进行，所述四搁板冷冻干燥机设备提供8平方英尺的搁板空间，具有15公斤内部冰冷凝器容量。该设备是由类型304L不锈钢构造的，所述不锈钢被认定为在高达20psig操作以用于蒸气灭菌的压力容器。典型的冷冻干燥设备包括额定压力室，冷凝器，具有压力控制特征的真空系统，和能实现约-55℃至50℃的温度范围的循环传热流体循环。
冷冻干燥物质呈白色，在小瓶中均匀分散，形状为圆筒形(即，模仿小瓶的形状)，紧致外观，相比于初始填充物具有最小的收缩，具有刚性的结构，使得它在小瓶的倒置时没有移动，并且上述物质的顶面没有痕量所述物质或边缘。该物质具有沿块状物的顶部，侧面和底部的不光滑的面。冷冻干燥的物质达到了残留水分，DSC，重构，pH和粘度的规范。
预冷冻干燥混合物及其制备将在下面作详细描述。主组分-活性药物组分(API)是磷脂类(例如，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG))，棕榈酸(PA)和合成的肺肽(优选KL4)。
在某些实施方案中，肺表面活性物质的多肽模拟物是指具有氨基酸残基序列的多肽，所述氨基酸残基序列具有小于零，优选小于或等于-1，更优选小于或等于-2的复合疏水性(composite hydrophobicity)。通过如Hopp等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3829，1981(其公开内容通过引用并入本文)中所描述，将相应的亲水性值分配给肽的每个氨基酸残基，从而确定肽的复合疏水性值。对于给定的肽，对疏水性值进行求和，所述和表示复合疏水性值。
在某些实施方案中，肺表面活性物质的多肽模拟物氨基酸序列，模拟SP18的疏水性和亲水性残基的模式，并且执行SP18的疏水区域的功能，如US专利号3789381(其全部内容并入本文)中描述的。在某些实施例中，可用于本文的SP-B模拟物包括具有交替的疏水性和亲水性氨基酸残基区域的多肽，其特征为具有由下式表示的至少10个氨基酸残基：
(ZaUb)cZd
Z和U是氨基酸残基，使得在每次出现的Z和U是独立选择的。Z为亲水性氨基酸残基，优选选自R，D，E和K组成的组。U是疏水性氨基酸残基，其优选选自V，I，L，C，Y和F组成的组。字母“a”，“b”，“c”和“d”是数目，其表示亲水性或疏水性残基的数目。字母“a”为约1至约5的平均值，优选约1至约3。字母“b”为约3至约20的平均值，优选为约3至约12，最优选约3至约10。字母“c”为1至10，优选2至10，最优选3至6。字母“d”为1至3，优选1至2。
通过规定由Z和U表示的氨基酸残基是被独立选择的，这是意味着，每次出现时，从指定的组中选择残基。也就是说，当“a”为2，例如，每一个由Z表示的亲水性残基将被独立选择，因此可以包括RR，RD，RE，RK，DR，DD，DE，DK等。通过规定“a”和“b”具有平均值，这是意味着，虽然重复序列(ZaUb)内的残基的数目可以在肽序列中有些变化，但是“a”和“b”的平均值分别是约1至约5至和约3至约20。
在某些实施方案中，可以在本发明中可以使用的示例性SP-B多肽模拟物包括但不限于，肺表面活性物模拟肽的表中所示的那些。
肺表面活性物模拟肽的表
1该名称是指定的氨基酸残基序列的缩写。
在通过本发明递送的组合物中有用的磷脂的实施例包括天然和/或合成的磷脂。可以使用的磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，磷脂酰肌醇，鞘脂，二酰基甘油酯，心磷脂，神经酰胺，脑苷脂等。示例性的磷脂包括，但不限于，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二月桂基磷脂酰胆碱(DLPC)(C12：0)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)(C14：0)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二植烷酰磷脂酰胆碱，十九烷酰磷脂酰胆碱，花生酰基磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)(C18：1)，二棕榈油酰基磷脂酰胆碱(C16：1)，亚油酰磷脂酰胆碱(C18：2)，肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)，硬脂酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(SMPC)，硬脂酰棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰棕榈酰油酰基(palmitooleoyl)磷脂酰胆碱(PPoPC)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)，棕榈酰基油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)，大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，鞘磷脂，磷脂酰肌醇，二磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，和卵磷脂酰胆碱(EPC)。
在这些混合物中有用的脂肪酸和脂肪醇的例子包括，但不限于，甾醇，棕榈酸，鲸蜡醇，月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，植烷酸，二棕榈酸(dipamlitic acid)，等。优选地，所述脂肪酸是棕榈酸和优选的脂肪醇是鲸蜡醇。
这些混合物中适用的脂肪酸酯的例子包括，但不限于，棕榈酸甲酯，棕榈酸乙酯，棕榈酸异丙酯，胆甾醇棕榈酸酯，棕榈酸棕榈酯棕榈酸钠，棕榈酸钾，三棕榈酸甘油酯等。
半合成的或改性的天然脂质的例子是如上所述的已被化学修饰的脂质中的任一项。化学修饰可以包括若干修饰；然而，优选的修饰是一个或多个聚乙二醇(PEG)基团与脂质的所需部分的缀合。聚乙二醇(PEG)已被广泛应用于生物物质，生物技术和医药，主要是因为PEG是一种生物相容的，无毒的，非免疫原性和水溶性聚合物。在药物输送领域，PEG衍生物已广泛用于与蛋白质的共价连接(即“聚乙二醇化”)，以减少免疫原性，蛋白水解和肾清除率，并提高溶解性。
已与PEG缀合的脂质，在此统称为“PEG-脂质”。优选地，当PEG-脂质在本发明的方法和组合物中使用时，它们存在于醇类和/或醛中。
在冷冻干燥前，其它赋形剂可与肺表面活性物质多肽，一种或多种脂质，和有机溶剂体系组合，包含但不限于，各种糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，蔗糖，山梨糖醇，海藻糖，等，表面活性物质如，例如，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，脱水山梨醇三油酸酯，四丁酚醛等，聚合物，如聚乙二醇，葡聚糖等，盐类，如NaCl，CaCl2等，醇如鲸蜡醇，和缓冲剂。
优选地，所述的肺表面活性肽结合磷脂和游离脂肪酸或脂肪醇，例如，DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，POPG(棕榈酰油酰磷脂酰甘油)和棕榈酸(PA)。参见，例如，美国专利号5789381，为了所有目的将其公开内容通过引用以其全部内容并入本文。
在制备预冷冻干燥混合物中的第一步骤是获得肺表面活性物质肽，一种或多种脂质在有机溶剂系统中的基本上均匀的液体混合物，所述有机溶剂系统含有93-100％的有机溶剂，优选95％乙醇。通过术语“基本上均匀的”是指该组分在彼此中均匀地分散，例如，如在溶液中分散。该API是在被加热到45℃±5℃的有机溶剂系统中混合，直至获得溶液。然后将所得的溶液通过无菌过滤器(0.22微米)过滤到缓冲剂中，所述缓冲剂优选加热至45℃±5℃的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液，并且被搅拌以产生脂质体悬浮液形式的的预冷冻干燥混合物，其具有的有机溶剂浓度范围为预冷冻干燥混合物的总体积的3％至20％以下(v/v)，优选3％至15％，更优选从5％至10％，还更优选为7％～10％，剩余部分为水和/或缓冲剂。
在某些优选的实施方案中，肺表面活性物质肽，磷脂和游离脂肪酸或脂肪醇，例如，DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)和POPG(棕榈酰油酰磷脂酰甘油)和棕榈酸(PA)的混合物，与有机溶剂体系混合，以形成基本上均匀的液体混合物。各个成分可以以任何浓度存在于混合物中。磷脂在分散液中的总浓度的范围可为，例如，从约1至超过约80mg-总磷脂含量/毫升。合适的缓冲剂包括，但不限于，乙酸三羟甲基氨基甲烷，盐酸三羟甲基氨基甲烷，磷酸钠，磷酸钾，等。缓冲剂通常是可商购的。
在优选的实施方案中，用在本发明的方法中的脂质体悬浮液包括生理上可接受的溶剂中的DPPC，POPG，PA和KL4(重量比为约7.5：2.5：1.35：0.267)，所述溶剂具有的有机溶剂浓度的范围为预冷冻干燥混合物总体积的3％至20％以下(v/v)，优选3％至15％，更优选从5％至10％，并且更优选从7％至10％，剩余部分为水和/或缓冲剂。
在某些实施方案中，有机溶剂系统进一步包括另外的赋形剂，包括，但不限于，各种糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，蔗糖，山梨糖醇，海藻糖，等，表面活性物质如例如，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，脱水山梨醇三油酸酯，四丁酚醛等，聚合物如聚乙二醇，葡聚糖等，盐类，如NaCl，CaCl2，和缓冲剂。在某些优选的实施方案中，所述有机溶剂体系基本上不含盐。在某些优选的实施方案中，所述有机溶剂体系基本不含NaCl。
在某些实施方案中，可以通过组合所有的系统成分制备有机溶剂体系。例如，在某些实施方案中，其中有机溶剂包括在室温的有机溶剂和水性介质，该水性介质和有机溶剂可以被组合，以补足该有机溶剂体系。优选地，所述有机溶剂体系是乳液或可混溶的溶液。
所选择的有机溶剂优选与无菌过滤和冷冻干燥兼容。优选地，本发明的有机溶剂选自低级氧基烃(oxy hydro carbon)，低级卤代烃，低级卤代氧基烃(haloxyhydrocarbons)，低级磺酰基烃(亚磺酰，次硫酸根烃(sulfoxyhydrocarbon)，低级环烃以及它们的组合组成的组。
本发明中使用的适合有机溶剂，包括但不限于，异丙醇，甲醇，乙醇，丙酮，乙腈，环己烷，氯丁醇，二甲基亚砜，叔丁醇，己醇，苄醇，乙酸，戊醇(1-戊醇)，正丁醇，正丙醇，乙酸甲酯，碳酸二甲酯，甲基乙基酮，甲基异丁基酮，四氯化碳，六氟丙酮，三氯叔丁醇，二甲基砜，环己烷，以及它们的组合。优选的溶剂包括低级链烷醇，如叔丁醇，乙醇，异丙醇，等。本发明的特别优选的溶剂是乙醇。
在某些优选的实施方案中，肺表面活性物质组合物是lucinactant或其他肺表面活性物质制剂，其中含有合成的表面活性物质肽KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(KL 4；SEQ ID NO：1)。在某些优选的实施方案中，本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质重构时，会产生API的组合：重量比约7.5：2.5：1.35：0.267的DPPC，POPG，PA和KL4肽)，或者与Discovery Laboratories,Inc.(Warrington，PA，USA)的(lucinactant)液体合成肺表面活性物质中重量比相同的重量比的DPPC，POPG，PA和KL4肽。在某些实施方案中，所述的肺表面活性物质组合物被配制为浓度是，例如，10，20，和30毫克/毫升的磷脂含量。在某些其它实施例中，肺表面活性物质的组合物被配制为较高浓度，如60，90，120或更多毫克/毫升的磷脂含量，并伴随KL4浓度增加。
在本发明的某些示例性实施方案中，肺表面活性物质肽，磷脂和游离脂肪酸或脂肪醇的相对量是约1份重量的合成表面活性物质的肽；每份重量的合成表面活性物质肽约20至约150份重量的磷脂；每份重量的合成表面活性物质肽约0至约25份重量的游离脂肪酸或脂肪酸醇。在某些实施方案中，有机溶剂系统的相对量是在每份重量的肺表面活性物质肽的大于62.5及小于250份重量的范围内。在某些实施方案中，所述有机溶剂体系存在的范围是每份重量的肺表面活性物质肽的80至125份重量。在某些示例性实施方案中，肺表面活性物质肽，磷脂和游离脂肪酸或脂肪醇的相对量是约1份重量的肺表面活性物质肽，如，例如，KL4；约20约100份重量的DPPC；0至约50重量份的POPG；以及约0至约25份重量的棕榈酸。
本发明的冷冻干燥物质呈白色，在小瓶中均匀分散，形状为圆筒形(即，模仿小瓶的形状)，致密，相比于初始填充物，具有最小收缩，具有刚性结构，使得其在小瓶的倒置时没有移动，并上述物质的顶面没有痕量物质或边缘。与其它冷冻干燥方法制备的肺表面活性物质相比，由上述方法制备的本发明的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有较大的比表面积(至少至少为2.2m2/g)，以及较大的总孔面积(至少40％)。优选地，本发明的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的比表面积的范围是从约3.7m2/g至约2.2m2/g。同时还发现，除了使用退火以用于产生更加刚性的块状物结构，在第一干燥期间，真空中的变化影响比表面积。实施例15中所表示的BET数据表明，与在150微米制备的样品的比表面积相比，在40微米，比表面积为最大的。这一发现将进一步有助于改进冷冻干燥的合成的肺表面活性物质块状物结构的设计。
冷冻干燥物质通过了残留水分，重构时间，pH，粘度，以及其生物学活性的检查。冷冻干燥的物质用10ml无菌注射用水(WFI)重构，并且将固体在20～30秒内分散。pH在7.6-7.9的范围内。用Brookfield粘度计，Model LVDV–II，在37℃(Brookfield EngineeringLaboratories,Inc.，Middleboro，MA)测定的粘度是在77-105厘泊的范围内(0.077-0.105Pa s)。通过Pulsating Bubble Surfactormeter(PBS)Model EC-PBS-B(Electronetics Corporation，美国，nowGeneral Transco Inc.，Largo,FL)在37℃下分析样品降低表面张力(例如，生物活性)的能力；平均表面张力的测量值是2至7达因/厘米(2×10-3至7x10-3N/m)。有效的肺表面活性物质的可接受的值低于10达因/厘米(0.01N/m)。
表征冷冻干燥物质的一种方法是测量其比表面积。比表面积是在分子尺度的固体样品的暴露的表面的一种度量。BET(BrunauerEmmet和Teller)表面积分析法是已建立的模型，其用于通过气体分子的物理吸附确定固体的比表面积(见美国药典标题：<846>比表面积(Http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c846.html))。样品通常如下制备：加热的同时抽真空或使气体流过样品之上以除去游离的杂质。然后用液氮或氪气冷却所制备的样品，并通过测量在特定压力吸附的气体体积进行分析。由Micromeritics PharmaceuticalServices(Norcross，GA)使用2420加速表面积和孔隙率系统(Accelerated Surface Area and Porosimetry System)(麦克仪器公司，乔治亚州诺克罗斯市(Micromeritics Instruments Co.,Norcross,GA))，对选定的样本进行BET11点测试。在25℃下在真空下,样品进行脱气16小时。100％氪被用作吸附物。分析浴温度大约为77K。下面的参数被测量：样品质量(克)，冷自由空间(立方厘米)，暖自由空间(毫升)，饱和压力(Po)(毫米汞柱)，绝对压力(P)(毫米汞柱)，和经过的时间。对于每个样品计算出等温线的线性曲线，其中，Y轴是吸附的量(立方厘米/克STP)和X轴为相对压力(P/Po)。STP被称为标准温度和压力，即，273.15K的温度和大气压(1.013×105帕)。数据列于下面的实例。
冷冻干燥物质的形态学表征中有用的另一个参数是它的孔隙率，其定义为物质中全部孔的体积与物质整体的体积的比。用扫描电子显微镜(SEM)JEOL6480扫描电子显微镜(JEOL，日本)测定冷冻干燥的物质的孔隙率。通过用金刚石锯切割小瓶顶部，从小瓶除去样品，并将其跨其宽度切成两半。切割样品的横切切片被放置在扫描电镜设备上和以20和100的放大率(X)可视化。在室温在真空进行分析。放大率X20的表面积约为6.4毫米x5.1毫米。放大率X100的表面积约为1200微米×965微米。
被横切的骨架的SEM显微照片揭示了每个样品的整个横截面的微通道或多孔结构。两个优良的点被选定以成像：块状物的顶部(未切割面积)为“表面A”，块状物的内部为“表面B”。图3A和3B示出，在30毫升小瓶中制备的本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质的放大图像，采用X20的放大率，分别为表面A和表面B。图4A和4B示出了，在30毫升的小瓶中如实施例3中所述由Bornstein Lyo Cycle制成的冷冻干燥的肺表面活性物质制剂II的放大图像，采用X20的放大率，分别为表面A和表面B。图5A和5B显示，在30毫升小瓶中制备的发明的冷冻干燥的肺表面活性物质的放大图像，采用X100的放大率，分别为表面A和表面B。图6A和6B示出了，如实施例3中在30毫升的小瓶中由Bornstein Lyo Cycle制成的冷冻干燥的肺表面活性物质制剂II的放大图像，采用X100的放大率，分别为表面A和表面B。
值得注意的是，如实施例4中所述使用“Johnson Lyo Cycle”制备的制剂III(A0490-62)，由于其脆性，描述不能用扫描电镜进行分析。块状物甚至不耐受锯的轻微压力，并且土崩瓦解。比较实施例2中所述的由使用Novel Lyo Cycle制成的制剂I(A0490-55)的总孔面积与如实施例3中所描述使用“Bornstein Lyo Cycle”制备的制剂Ⅱ(A0490-58)的总孔面积，观察到的是，制剂I是更加多孔的，具有至少11％的绝对差。
使用显微镜的Images Plus 2.0软件(麦克奥迪集团有限公司，中国厦门)计算选定图像的开放区域。施用浮雕滤波器(relieffilter)以突出开放区域，然后使用自动分段和自动计算功能，对开放表面积进行计算。该方法最小化数据的手工操作和去除比较图像之间的偏倚。对于制剂I，孔区域构成样品顶部(表面A)的实测面积的49.1％，而构成块状物内部(B面)的所测量的面积的50.5％。对于制剂Ⅱ，孔区域构成样品顶部(表面A)的实测面积的37.3％，而构成块状物内部(B面)的所测量的面积的36.7％。相应的差异是11.8％和13.8％。
进行手动孔径计算，以测试上述方法对样品的准确度，其示于图5A(制剂I，表面A，X100)和图6A中(制剂Ⅱ，表面A，X100)。每个显微照片修整到为6.4毫米(宽度)和3.9毫米(高)的尺寸，和每个图像中的20个“孔”被测其高度和宽度，并且进行比较。
本发明的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质组合物具有以下的独特组合：较大的表面积(至少2.7m2/g)，较大的孔隙率(40体积％以上)，并表现出刚性，例如，观察到当倒置时对运动的抗性和当包含物质的小瓶被轻敲时也对运动有抗性。更刚性的质量会关联到减少的分子流动性，化学反应的前体，和因此更稳定的产物。
以前观察到的是，在四种API中，西那普肽或KL4肽降在液体环境中比在作为冷冻干燥物质的固态降解更快(见美国专利号5952303，Bornstein的)。因为相信该冷冻干燥制剂的均匀外观也是更稳定的产物的体现，本发明人预期，通过本文中所描述的本发明方法获得的冷冻干燥制剂将在25℃储存至少3个月内展示出至少KL4肽的稳定性提高。预期的是，在更长的贮存期限内，例如，6个月和9个月，在25℃和如果在较高温度，如30℃和40℃存储，通过本发明方法制备的冷冻干燥制剂的KL4和其它API的稳定性将是在统计学上优于通过其他冷冻干燥方法获得的冷冻干燥制剂。预计稳定性提高至少在2％以上，至少5％以上，或至少10％以上。
本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质可用水或其他药学上可接受的稀释剂重构。之前已经描述了使用液体或冷冻干燥的肺表面活性物质。新冷冻干燥肺表面活性物质展示出优良的块状物和抵御移动和运输的能力，这是药物产品的必要的属性。
将参照下面的实施例更详细地说明本发明，但应该理解的是，本发明不视为限于此。
实施例
实施例1
使用本发明新方法和先前公布的美国专利号5952303和7582312中所述方法进行冷冻干燥，以证明每个方法对所得冷冻干燥产物赋予的不同。
材料：在由这三个方法的冷冻干燥的制剂中的组分归纳在下面的表1。针对原料的纯度调整实际量。
表1.制剂I，II和III的原料(3000g批次规格)
程序：为三个方法各自准备两个3000克批次。用注射器向每小瓶加入13.7克标准填充重量。预冷冻干燥混合物的制备：在46℃±1℃将API溶于95％乙醇，以得到溶液。在45℃±2℃，通过0.22微米33毫米过滤器使用压力将所得溶液无菌过滤到搅拌的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液中，以产生脂质体制剂，其具有最终乙醇浓度为10％(w/w)。在冷却至30℃以下的温度后，将所得脂质体制剂，即，预冷冻干燥混合物，转移到20，30和50mL的硼硅玻璃冷冻干燥小瓶中，填充体积为13.7克/小瓶。将所得冷冻干燥物贮存于5℃。
实施例2
制剂I.来自表1的预冷冻干燥混合物用作在20，30和50mL的玻璃瓶中的填充物，并使用上述的新冷冻干燥法进行冷冻干燥。表2总结了冷冻干燥方法的参数。
表2.新冷冻干燥方法的参数
*阶段是在大气压下进行。**阶段是在真空进行的。
实施例3
制剂Ⅱ.来自表1的预冷冻干燥混合物用作在20，30和50mL的玻璃瓶中的填充物，和使用在Bornstein的美国专利5952303中描述的方法(“Bornstein Lyo Cycle”)进行冷冻干燥。表3总结了该方法的参数。
表3.Bornstein Lyo Cycle的冷冻干燥参数
| 起始搁板温度*: | 25℃. |
| 冷却步骤* | -40℃采用1.0℃/min |
| 保持步骤* | -40℃，持续2小时 |
| 真空: | 100mT |
| 加热步骤** | 0℃采用0.5℃/min |
| 保持步骤** | 0℃，持续48小时 |
| 加热步骤** | 26℃采用0.5℃/min |
| 保持步骤** | 26℃，持续12小时 |
| 回洗**: | N2达1/2巴之后封闭小瓶 |
*阶段是在大气压下进行。**阶段是在真空进行的。
实施例4
制剂III.来自表1的预冷冻干燥混合物用作在20，30和50mL的玻璃瓶中的填充物，和使用在约翰逊的美国专利第7582312中描述的方法(“Johnson Lyo Cycle”)进行冷冻干燥。表4总结了该方法的参数。
表4.Johnson Lyo Cycle的冷冻干燥参数
| 起始搁板温度*: | 25℃. |
| 冷却步骤* | -30℃采用1.0℃/min |
| 保持步骤* | -30℃直到小瓶达到温度 |
| 真空**: | 500mT |
| 加热步骤** | 0℃采用1℃/min |
| 保持步骤** | 保持直到小瓶达到温度 |
| 回洗**: | N2达1/2巴之后封闭小瓶 |
*阶段是在大气压下进行。**阶段是在真空条件下进行的。
例5
评价冷冻干燥物质的物理外观。20个小瓶被随机地选择。生产批号55-20，55-30和55-50分别对应于20，30和50毫升小瓶中的制剂I。生产批号58-20，58-30和58-50分别对应于20，30和50毫升小瓶中的制剂Ⅱ。生产批号62-20，62-30和62-50分别对应于20，30和50毫升小瓶中的制剂III。使用频率，并在适当情况下，使用％总结了所有分类变量。使用平均值和标准偏差(SD)总结了所有连续变量，将中位数和范围(最小，最大)用于选定的评估。在20，30和50毫升小瓶中冷冻干燥的制剂I，II和III被目测，以确定悬浮的迹象，如初始填充高度以上的白环。针对20ml的小瓶，液体填充高度为25mm，针对30ml的小瓶，液体填充高度为20mm，而对于50毫升的小瓶，液体填充高度为15mm。
采集实际悬浮距离的测量值和从小瓶底部到初始填充高度以上的白环减去初始填充高度的测量值，并在表5和图2中给出所述测量值。
表5
制剂I(生产批号55-30和55-50)(本发明的冷冻干燥的肺表面活性物质)的样品在30和50毫升小瓶中没有悬浮的任何迹象，而在20ml小瓶的样品(生产批号55-20)中，20个样本有7个样本中有可达2毫米的一些轻微的悬浮。在所有三种尺寸中的制剂II样品(58-20，58-30和58-50)和制剂III样品(62-20，62-30和62-50)在冷冻干燥方法中都显示悬浮的迹象，其中在20毫升小瓶中的制剂III样品是最严重。显然，采用了新的冷冻干燥方法，已经显著减少或消除了悬浮的问题。
在20，30和50毫升小瓶中冷冻干燥的制剂I，II和III的20个随机选择小瓶被检查以检查确定通过倒置小瓶一次是否存在倒置导致的运动的迹象。图1是条形图，其显示了一些包含倒置后移动了的冷冻干燥物质的小瓶(示出为黑色条)和一些含有在倒置后不移动的冷冻干燥物质的小瓶(示出为阴影条)。制剂I样本(本发明的冷冻干燥肺表面活性物质)中没有一个在倒置后移动，而所有的制剂III样和大部分制剂Ⅱ样品发生移动。本试验表明，本发明的冷冻干燥肺表面活性物质相对于其他的样品在小瓶中具有优越位置。
实施例6
提出针对稳定性和API效力的研究。为了完整性，用HLPC，在25℃，30℃或40℃，在3至12个月储存内，在选定的时间间隔，对四个API，KL4(西那普肽)，DPPC，POPG和棕榈酸(PA)进行检测。HPLC参数列于表6。
表6色谱条件
包括各个4种API的标准被运行以确定洗脱的模式。样品在柱上装载，并且计算API的量。
实施例7
在20，30和50毫升小瓶中的制剂I，II和III同时经受BET测试。值得注意的是，当制剂I，II和III是通过FEDEX过夜送给Micromeritics，以进行为BET测试，制剂III没有完好地被送达，这导致块状物已经明显崩溃，因此，无法用于测试。用更安全的包装运送前述物质，但是，50毫升小瓶中的样品(62-50)依然出现了崩溃。因此，样品62-50的测试结果将不代表真实值。
BET测试如下进行：分析吸附剂：氪；热更正：存在；平衡间隔：10秒；环境温度：22.00℃；自动脱气：存在。该结果支持了本发明的冷冻干燥物质(制剂Ⅰ)在20ml，30毫升和50毫升小瓶中的结果被表示于表7中。制剂II和III的结果列于表8。
表7
表8
制剂I样本比表面积为约3.7m2/g至约2.7m2/g。制剂Ⅱ样品比表面积为约1.7m2/g。制剂III样品比表面积是在约0.6m2/g至约0.9m2/g的范围。清楚的是，制剂I样品比表面积比其它样品的比表面积显著更大。
实施例8
制剂IV.
当用10ml无菌注射用水重构时，冷冻干燥的制剂IV将提供API的如下浓度，如表9中所示：
表9
| API | (mg/mL) |
| 西那普肽(KL4) | 0.862 |
| 棕榈酸 | 4.05 |
| DPPC | 22.50 |
| API | (mg/mL) |
| POPG | 7.50 |
表10.制剂IV用原料(8000g批次规格)
按照表10制备几个批次。预冷冻干燥混合物的制备：在46℃±1℃API溶解在95％乙醇中，得到溶液。在45℃±2℃，将所得溶液在压力下通过0.22微米33毫米(PVDF)Millipore Millex GV cat.NoSLGV033NS过滤器滤入搅拌的TRIS缓冲剂，以产生脂质体制剂，其具有7％的最终乙醇浓度(w/w)。在冷却至30℃以下的温度后，使用蠕动泵，以13.7克/小瓶的填充体积，将所得脂质体制剂，即，预冷冻干燥混合物，转移到30毫升的硼硅玻璃冷冻干燥小瓶中，和如在实施例9-14中所述，进行冷冻干燥，运行1-6次。
实施例9
第2次运行
表11
实施例10
第3次运行
表12
实施例11
第4次运行
表13
实施例12
第5次运行
表14
实施例13
第6次运行
表15
实施例14
第1次运行
表16
实施例15
从第1-6次运行得到的冷冻干燥产物被同时地进行了BET测试。
采用与上述实施例7中所述相同的参数，进行BET测试。每次运行测试三个小瓶。结果示于表17。
表17
方法：重构。重构的溶液的要求是，没有可见的不溶物，在预先确定量的时间之后溶液不比稀释剂更不澄清。用于重构的体积可以使得产物返回到与起始产物相同的体积和浓度，以用于填充本体溶液(bulk solution)，并且可以是与在临床环境中用于患者传递的体积相同的体积。纯净水，USP作为稀释剂，以10ml的体积被吸进注射器。然后稀释剂被挤压入干燥的块状物的中心，和定时器启动。然后以约5秒的时间间隔在光盒中，检查产物，以验证不存在任何不溶性物质和溶液的澄清度。溶液，一旦完全重构，被表征为是澄清的，无色的，模糊的，不透明的和/或絮状的。颗粒，如果存在的话，被分类为微不溶物质至粗的纤维。不溶解的赋形剂或API都原样记录。
pH测量–测量重构的溶液(见上文)，以确定每USP<791>的pH值，在使用前，采用两种或三种pH缓冲剂(所述缓冲剂包括期望的样品范围)，进行pH值标准化。所选择的pH值缓冲剂为不大于3个pH单位，但是，不小于2个pH单位间隔(例如，4.01，7.00，和10.01)。ATC探头用于自动温度补偿。样品溶液的量足以覆盖pH探头传感器，和探针侧面上的任何参比接点分配到合适的容器中。使溶液轻轻成漩涡，然后静置，并在至少15秒的时间内稳定到恒定值，在这一点，记录所显示的pH值。
电量卡尔·费歇尔滴定法-水分测试遵循美国药典<921>，水的测定中所概述的广泛接受的传统方法。初始干燥的样品和容器进行称重。溶剂萃取法用无水甲醇，特殊的试剂，A.C.S注入用于悬浮和溶解干燥的物质的容器。对于每个研究，用于覆盖干燥的物质的甲醇提取体积为13.0毫升到13.7毫升。然后让该样品浸泡预定的时间，以提取产物中的水分。然后取出等分试样，测定的体积，然后注入KF仪器的反应容器中。在到达滴定的终点后，报告结果。KF仪器将含水量解析为微克。然后称重空容器，针对初始容器含量计算百分比湿度。
高温差示扫描量热法(DSC HT)-用作测定固体物质的玻璃化转变的一种手段，这提供了用于评价制剂和评估在干燥状态下的行为的有用信息。HT DSC遵循现行美国药典(USP)<891>，热分析，并且用接口到TAC 7/7仪器控制器的Perkin Elmer DSC 7进行HTDSC。用PYRIS软件4.0版，在PC界面，进行测试参数和数据分析。大约10-15mg固体物质被放置在铝样品盘，其具有折绉通风式盖。氮，NF被用来以20ml/分钟的流速连续吹扫样品。冷冻干燥的物质被加热以评估在较高温度下的热行为。在升温期间，样品的热的演变或摄取反映了，样品进行热事件时在能源上的差异。扫描数据被记录下来，同时使用4.0软件绘图。一旦扫描完成，计算确定了热事件的起始和峰值的温度。基于扫描的结果，利用该方法测定，干燥成品的热事件的温度，例如玻璃化转变(Tg)，结晶，熔点(Tm)，和融合的相关联的热量，和/或比热。
结果.制剂I的冷冻干燥样品的平均残留水分值接近0％。平均重构时间为8秒至10秒。以每分钟2℃，对物质进行高温DSC扫描，所述扫描表明，在49.0℃至51.0℃的温度观察到一致的显著吸热峰。
尽管本发明已经详细地并参照其具体实施例进行了描述，但显然对本领域技术人员而言，可在不脱离本发明精神和范围的情况下，进行各种变化和修改。
Claims (16)
1.一种制备冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的方法，所述肺表面活性物质具有在方法中减少或消除块状物悬浮，该方法包括：
将预冷冻干燥混合物提供至冷冻干燥室，所述预冷冻干燥混合物包含至少一种磷脂和合成肽，所述磷脂和合成肽分散在溶剂中，所述溶剂具有有机溶剂，并且所述溶剂其余是水和/或缓冲剂，所述有机溶剂的范围为预冷冻干燥混合物总体积的3％(v/v)至20％以下(v/v)，其中，所述预冷冻干燥混合物填充到容器中，并且其中，所述合成肽具有至少10个氨基酸残基和由下式表示：
(ZaUb)cZd
其中Z表示亲水性氨基酸残基，U表示疏水性氨基酸残基；其中每个Z独立地为R，D，E或K；并且每个U独立地是V，I，L，C，Y或F；而其中a是整数，其具有约1至约5的平均值；b为整数，其具有约3至约20的平均值；c是约1至约10的整数；和d是约1至约3的整数；
降低冷冻干燥室中的温度，以开始冷却，并在冷冻阶段固化预冷冻干燥混合物；和
在第一干燥阶段前进行退火阶段，从而减少或消除在冷冻干燥的合成的肺表面活性物质中的块状物悬浮。
2.权利要求1的方法，该方法包括：
在冷冻干燥室中，在降低温度的过程中，进行冷冻阶段，其中将所述预冷冻干燥混合物以0.1至1.0℃/min的速率冷却到-45℃以下的第一温度，和在该第一温度保持预冷冻干燥混合物第一时间期间，所述第一时间期间足以固化至少76％的溶剂，以形成第一固化混合物；
进行退火阶段，由此减少或消除第一固化混合物的块状物悬浮，其中，所述第一固化混合物是(ⅰ)加热至第二温度，所述第二温度被选定以减少或消除第一固化混合物的悬浮，(ⅱ)在第二温度保持第二时间期间，所述第二时间期间足以减少或消除所述第一固化混合物的悬浮，以及(iii)以0.1至1.0℃/min的速率冷却至-45℃以下的第三温度，以形成第二固化混合物，其中所述第二固化混合物在所述第三温度被保持第三时间期间，所述第三时间期间足以促进未冷冻的有机溶剂从所述第二固化混合物分离，从而使得未冷冻的有机溶剂迁移到容器和第二固化混合物之间的界面；
在30mT或更高的降低的压力进行第一干燥阶段，其中，所述第二固化混合物在第四温度保持第四时间期间，所述第四时间期间足以除去至少5％的有机溶剂，随后加热到第四温度，所述第四温度足以保持所述第二固化混合物不在容器中悬浮，并保持在退火阶段建立的结构，并在第四温度下进一步保持第五时间期间，所述时间期间足以除去至少70％的溶剂，并由此形成第三固化混合物；和
在降低的压力进行第二干燥阶段第六时间期间，所述时间期间足以产生冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有至多2％的残余溶剂含量。
3.权利要求2的方法，其中容器中预冷冻干燥混合物的体积与容器的体积的比率为约28％至约68％。
4.权利要求2的方法，其中容器中所述预冷冻干燥混合物的高度与容器直径的比的范围是从约0.3至约0.8。
5.权利要求2的方法，该方法包括：提供预冷冻干燥混合物，其中所述有机溶剂在约3％至约15％的范围内。
6.利要求2的方法，该方法包括：提供预冷冻干燥混合物，其中有机溶剂在约5％至约10％的范围内。
7.权利要求2的方法，该方法包括：提供预冷冻干燥混合物，其中有机溶剂在约7％至约10％的范围中。
8.权利要求2-7中任一项的方法，该方法包括：
进行冷冻阶段，其中预冷冻干燥混合物以0.1至1.0℃/min的速率冷却至-50℃±5℃的第一温度；
进行退火阶段，其中所述第一固化混合物是(ⅰ)以0.1至1.0℃/min的速率加热至-22℃±5℃的第二温度，(ⅱ)在第二温度保持4小时至8小时的第二时间期间，(ⅲ)以0.1至1.0℃/min的速率冷却至-50℃±5℃的第三温度；及(iv)在所述第三温度保持约3至8小时的第三时间期间；
在选自约30mT至约200mT的范围的压力和第一干燥温度进行第一干燥阶段，所述第一干燥温度选自约-25℃至0℃的范围并且从-50℃±5℃倾斜升温，并在第一干燥进一步保持至少10小时。
9.权利要求2-8中任一项的方法，所述方法包括在选自约30mT至约200mT的范围的压力和至多46℃±5℃的温度进行第二干燥阶段。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中预冷冻干燥混合物包含SEQID NO：1(KL4多肽)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸，并且其中所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的比表面积至少为2.2m2/g。
11.权利要求10的方法，其中，比表面积是在约3.7m2/g至约2.2m2/g的范围内。
12.权利要求10的方法，其中所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的孔隙率为40％体积以上的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的总面积。
13.冷冻干燥合成肺表面活性物质组合物，包括：
至少一种磷脂和具有至少10个氨基酸残基和由下式表示的合成多肽：
(ZaUb)cZd
其中Z表示亲水性氨基酸残基，U表示疏水性氨基酸残基；其中每个Z独立地为R，D，E或K；每个U独立地是V，I，L，C，Y或F；而其中a是整数，其具有约1至约5的平均值；b为整数，其具有约3至约20的平均值；c是约1至约10的整数；d是约1至约3的整数，其中，所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的组合物具有比表面积至少为2.2m2/g。
14.如权利要求13所述的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质，其中，所述的比表面积是在约3.7m2/g至约2.2m2/g的范围内。
15.权利要求13的冷冻干燥合成肺表面活性物质，其中所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质具有的孔隙率为40％体积以上的冷冻干燥的合成的肺表面活性物质的总面积。
16.权利要求13-15任一项的冷冻干燥合成肺表面活性物质，其中所述冷冻干燥的合成的肺表面活性物质包括SEQ ID NO：1(KL4多肽)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸。
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