CN104257713A - 紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用 - Google Patents

紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明植物药制品领域，公开了一种紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用。制备按照步骤：将1000～3000g紫锥菊根药材粉碎过筛得紫锥菊根粉末；将紫锥菊根粉末与重量百分比浓度为50～80％的乙醇溶液混合，浸泡，超声提取两次，过滤并收集滤液和残渣；将残渣与重量百分比浓度为10～30％的乙醇溶液混合，超声波提取1次，过滤并收集滤液，合并上述滤液；将滤液减压回收乙醇，浓缩；将浓缩液加山梨酸钾溶解，调节pH值至4.0～6.0；静置过夜，过滤；加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，得紫锥菊根口服液。该紫锥菊根颗粒剂可显著增强鸡新城疫疫苗和猪蓝耳病疫苗的免疫效果。

Description

紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用
技术领域
本发明属于植物药制品领域，具体涉及一种紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用。
背景技术
现代规模化养殖由于各种管理原因导致动物免疫力低下，使养殖生产性能下降，容易感染疾病，给养殖业带来巨大的经济利益损失，免疫增强剂可以提高动物机体的免疫力，提高抗病能力、与疫苗同用，可以增强机体对疫苗的免疫应答，保护性免疫水平提前达到，抗体滴度明显提高，与抗病毒药物抗菌药物同用，可以增强抗病毒药物抗菌药物杀灭病原体的能力。
紫锥菊根为菊科紫锥菊属多年生草本植物紫锥菊(Echinacea pupurea(L.)Moench)的根和根茎，具有较强的免疫强化及抗炎作用，可通过刺激机体的免疫系统而增强机体对细菌和病毒感染的抵抗力。研究结果表明，其根中含有大量咖啡酸衍生物、烷基酰胺类、多糖类、生物碱类等物质，其中菊苣酸、烷基酰胺为主要的生理活性成分。在饲料中添加推荐剂量紫锥菊根末能够提高猪PRRSV抗体水平，能够维持猪机体免疫内环境的稳定。明显提高肉鸡新城疫抗体水平，提高血浆球蛋白含量；紫锥菊根末喂肉鸡能增强肉鸡红细胞免疫功能，提高肉鸡NK细胞活性；紫锥菊根末有提高肉鸡免疫器官指数的作用，紫锥菊根是一种良好的动物免疫增强药物。
目前兽药上紫锥菊根剂型有紫锥菊根末，为散剂，散剂仅用于混饲，不能饮水给药，使用不方便，其中有效成分在植物细胞内，需经过消化、溶出才能被动物吸收，而动物的消化道短，部分药物未被吸收就被排出体外，造成浪费，紫锥菊根末的生物利用率相对较低，使用不方便，起效慢。
尚未有文献报道紫锥菊根原药材的提取加工方法，一般的中药材提取方法乙醇加热回流提取，存在提取时间长，溶剂使用量大，提取温度相对较高，有效成分咖啡酸衍生物、烷基酰胺类有效成分对热不稳定，容易降解，生产效率较低等缺点。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种紫锥菊根口服液的制备方法。该方法克服了现有技术提取有效成分收率低，提取时间长，溶剂使用量大，提取温度较高，有效成分降解多、操作复杂的问题。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。口服液使用方便，提高药物的利用率。
本发明的再一目的在于提供上述紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用。可以解决现有产品吸收慢、生物利用度低、使用不方便的问题。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种紫锥菊根口服液的制备方法，按照以下操作步骤：
(1)将紫锥菊根药材粉碎，过筛得到紫锥菊根粉末；
(2)将1000～3000g紫锥菊根粉末以质量比1：8～1：15的料液比与重量百分比浓度为50～80％的乙醇溶液混合，浸泡20～50分钟，超声提取两次，每次超声时间20～30分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比l：5～1:10的料液比与重量百分比浓度为10～30％的乙醇溶液混合，超声波提取1次，提取时间为10～50分钟，过滤并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将上述所得滤液在40～60℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.02～1.10的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至4.0～6.0；
(5)药液静置过夜，过滤；
(6)加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，即得紫锥菊根口服液。
步骤(1)所述紫锥菊根药材为紫锥菊药材地下部分，即紫锥菊的根和根茎；所述紫锥菊为紫花紫锥菊；所述过筛为过10～40目筛。
步骤(6)所述灭菌是采用辐射灭菌、高压灭菌或超声波灭菌。
一种由上述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。
上述紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用，所述应用是采用以下步骤：每100mL紫锥菊根口服液兑水20L～60L饮水使用，连用7天。
本发明通过分析紫锥菊根中有效成分的理化性质差异，针对成分采取了不同的提取方案，以获得尽可能多的有效成分，从而使得成品有效成分得到尽可能多的提取、药效稳定。利用超声波振动方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地进入固体物质中，将其所含的有效成分尽可能完全地溶于溶剂之中，得到多成分混合提取液。成品紫锥菊根口服液为棕红色澄清液体，相对密度不低于1.02，PH值为4.0～6.0，味甜、微苦。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
l、提取温度低，有效成分降解少，得率高：超声波提取紫锥菊根药材的温度可控制在常温，最佳提取时间为20～30分钟，有效避免菊苣酸、单咖啡酰酒石酸等对热不稳定、易水解或氧化等成分的破坏，有效成分的收率比加热回流提取法得率高5％～15％，且大大降低能耗。
2、缩短提取时间：超声波提取紫锥菊根在20～30分钟即可获得最佳提取率，提取时间较常规方法缩短50％～90％，提高了提取效率。
3、溶剂用量少：超声波提取溶剂使用量是常规方法的40～70％，节省了溶剂的使用量和浓缩时的耗能、耗时，减轻环境污染。
4、本发明所得制剂，增强免疫活性和临床疗效可靠。
5、采用口服或混水饮用的给药方式，使用方便，操作简单，药物水溶性好，易吸收，生物利用度高，奏效快，药效好，适合在养殖生产中应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例l
(1)先将紫锥菊根药材粉碎，过10目筛，得到紫锥菊根粉末；
(2)称取l000g紫锥菊根粉末，加8000m1重量百分比浓度为50％的乙醇溶液与紫锥菊根粉末混合，浸泡30分钟，超声提取2次，每次提取时间为20分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1:5的料液比与重量百分比浓度为10％的乙醇溶液混合，超声提取1次，提取时间为20分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将滤液在40℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.04的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至5.4；
(5)药液静置过夜，用微孔滤膜过滤；
(6)加蒸馏水适量至l000ml，灌装，超声波灭菌，即得紫锥菊根口服液。
本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥菊根lg，50℃下相对密度为1.04，经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为5.82mg/ml。
实施例2
(1)先将紫锥菊根药材粉碎，过40目筛，得到紫锥菊根粉末；
(2)称取3000g紫锥菊根粉末，加30000m1重量百分比浓度为70％的乙醇溶液与紫锥菊根粉末混合，浸泡50分钟，超声提取2次，每次提取时间为25分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1：8的料液比与重量百分比浓度为20％的乙醇溶液混合，超声提取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将滤液在45℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.03的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的对山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至4.8；
(5)药液静置过夜，取上清液，过滤；
(6)加蒸馏水至l000ml，灌装，辐射灭菌，即得紫锥菊根口服液。
本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥菊根3g，50℃下相对密度为1.03，经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为16.30mg/ml。
实施例3
(1)先将紫锥菊根药材粉碎，过20目筛，得到紫锥菊根粉末；
(2)称取2000g紫锥菊根粉末，加30000m1重量百分比浓度为80％的乙醇溶液与紫锥菊根粉末混合，浸泡20分钟，超声提取2次，每次提取时间为30分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1：10的料液比与重量百分比浓度为30％的乙醇溶液混合，超声提取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将滤液在60℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.10的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至4.3；
(5)药液静置过夜，用微孔滤膜过滤；
(6)加蒸馏水适量至l000ml，灌装，高压灭菌，即得紫锥菊根口服液。
本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥菊根2g，50℃下相对密度为1.07，经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为10.92mg/ml。
实施例4(对比实施例)：
(1)先将紫锥菊根药材粉碎，过40目筛，得到紫锥菊根粉末；
(2)称取3000g紫锥菊根粉末，加30000m1重量百分比浓度为95％的乙醇溶液与紫锥菊根粉末混合，浸泡50分钟，超声提取2次，每次提取时间为25分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1：8的料液比与重量百分比浓度为20％的乙醇溶液混合，超声提取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将滤液在45℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.03的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的对山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至4.8；
(5)药液静置过夜，取上清液，过滤；
(6)加蒸馏水至l000ml，灌装，辐射灭菌，即得紫锥菊根口服液。
本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥菊根3g，50℃下相对密度为1.03，经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为6.30mg/ml。
实施例5
采用上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4所得紫锥菊根口服液增强猪免疫功能试验。
紫锥菊口服液对猪PRRSV抗体的影响
35日龄杜长大三元杂断奶仔猪70只，体重为(10±0.5)kg，ELISA检测PRRSV抗体阴性。随机分成7组，每组10只。第1、2、3、6、7组分别为实施例1紫锥菊口服液的高、中、低剂量(高、中、低剂量分别为在饮水中的添加剂量0.5ml/L、1.5ml/L、2.5ml/L)试验组和实施例2(推荐剂量：饮水中的添加剂量0.17ml/L)、实施例3推荐剂量组(推荐剂量：饮水中的添加剂量0.25ml/L)，对照组实施例4推荐剂量组(推荐剂量：饮水中的添加剂量0.17ml/L)，第1天注射PRRSV灭活疫苗，2mL/头，全部肌肉注射，同时每组分别按2倍、1倍和1/2倍的紫锥菊口服液推荐剂量拌料给药，连续用药7天。第4组为疫苗对照组，疫苗免疫同试验组。第5组为药物对照组，免疫同试验组，黄芪多糖拌料给药，使用方法和剂量按照产品说明书进行，注射疫苗后7、14、24、34d，于前腔静脉采血，4mL，其中一份(2mL)不加抗凝剂，分离血清，-20℃冻存备用，另2mL加EDTAK盐作抗凝剂用于T细胞亚群检测。
血清ELISA抗体检测按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书进行，S/P值≤0.149为阴性，S/P值≥0.200为阳性。
T细胞亚群检测每管加入经过预试验确定体积的鼠抗猪淋巴细胞CD4+、CD8+单克隆抗体10mL，相应对照管加入抗小鼠IgG单克隆抗体10mL，分别加入全血50mL，混匀，室温避光作用20min，加入opticycle C溶血素250mL，室温避光作用10min，加入PBS溶液500mL，混匀，室温避光作用10min，1500r/min离心10min，弃去上清，再加入PBS溶液500mL，重悬细胞，流式细胞仪分析细胞亚群数量。
试验数据以表示，统计学处理采用SPSS11.5软件进行方差分析结果见表下表1：
表1猪PRRSV抗体检测结果(n＝4)
注：同行中字母不相同表示与其它组差异显著P<0.05或差异极显著P<0.01。
由表1可知，免疫前各组抗体水平差异不显著，免疫后抗体的动态变化呈先升高后降低。给药后14天(Day14)的检测结果发现紫锥菊口服液高、中剂量组、黄芪多糖组与疫苗组差及低剂量组异显著(P<0.05)，这表明紫锥菊口服液高、中剂量组和黄芪多糖组的抗体水平明显高于疫苗组；给药后24天(Day24)的检测结果发现紫锥菊高、中、低剂量组以及黄芪多糖组与疫苗组差组异显著(P<0.05)；其他时间(Day7，Day34)的抗体水平与疫苗组相比也有一定的提高，但差异不显著。
结果可见，紫锥菊口服液按照推荐剂量使用能够提高猪PRRSV抗体水平。
紫锥菊口服液对免疫猪外周血T细胞亚群的影响
表2免疫后猪外周血CD4+细胞百分比(n＝4)
注：同列中字母相同的表示差异不显著；字母不相同的表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出，各试验组CD4+细胞百分比呈先升高后降低的趋势，24d达到峰值；实施例1中剂量组、实施例1高剂量组、实施例2推荐剂量、实施例3推荐剂量、对照组实施例4以及黄芪多糖组与疫苗对照组比较差异显著(P<0.05)，实施例1中剂量组、实施例1高剂量组与黄芪多糖组比较差异不显著。
表3免疫后猪外周血CD8+细胞百分比(n＝4)
同列中字母相同的表示差异不显著；字母不相同的表示差异显著(P<0.05)。
由表3可以看出，各试验组CD8+细胞百分比呈先升高后降低的趋势，24d达到峰值；实施例1中剂量组、实施例1高剂量组以及黄芪多糖组与疫苗对照组比较差异显著(P<0.05)，实施例1中剂量组、实施例1高剂量组与黄芪多糖组比较差异不显著。
表4免疫后猪外周血CD4+/CD8+细胞百分比(n＝4)
由表4看出，各试验组CD4+/CD8+细胞百分比差异不显著，表明各试验组体内免疫环境相对稳定。
以上试验结果表明，采用本发明方法制备紫锥菊根口服液在饮水中添加推荐剂量能够提高猪PRRSV抗体水平，提高猪外周血中的CD4+、CD8+百分比，能够维持机体免疫内环境的稳定。
实施例6
采用实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制得的紫锥菊根口服液对猪促免疫效果的影响试验：
7日龄试验肉鸡150只，随机分为10个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J组，药物添加及处理情况具体见表5，分别在10、11、12日龄按环磷酰胺80mg/Kg的剂量给D、E组的鸡连续注射3d，每天1次，造成雏鸡机体中度免疫抑制。饲喂方法采用笼养群饲，每日喂料两次，换水两次。试验期：21d，给药期为7d。
所有肉鸡采用如下免疫程序
6日龄：NDIV     滴鼻、点眼；
7日龄：IBD     双倍饮水。
表5紫锥菊根末对鸡免疫功能的试验
紫锥菊根口服液对肉鸡新城疫抗体效价的影响
结果显示，B、C、F、H、I组抗体效价显著高于A、G、J、E个试验组(P﹤0.05)，E组抗体效价显著低于其它6个试验组(P﹤0.05)。试验结果表明，环磷酰胺显著抑制抗体效价(P﹤0.05)，D组紫锥菊根口服液能显著提高由于环磷酰胺所引起的的抗体效价的下降(P﹤0.05)，结果见下表6。
表6紫锥菊根口服液对肉鸡新城疫抗体效价的影响(n＝5)
组别 0d 7d 14d 21d
A 2.8±0.17 5.4±0.23a 8.0±0.21a 10.2±0.31a
B 2.8±0.16 6.6±0.35c 9.2±0.45c 10.4±0.51c
C 3.0±0.20 6.8±0.42c 9.4±0.21c 10.8±0.45c
D 3.0±0.18 4.6±0.18a 7.2±0.24a 9.4±0.23a
E 3.0±0.19 3.0±0.21b 5.0±0.23b 7.2±0.20b
F 2.8±0.20 6.6±0.43c 9.2±0.60c 10.6±0.35c
G 3.0±0.20 5.0±0.23a 7.6±0.23a 9.4±0.20a
H 2.8±0.14 6.8±0.30c 9.4±0.41c 10.2±0.51c
I 3.0±0.16 6.6±0.35c 9.2±0.45c 10.4±0.51c
J 2.6±0.20 5.0±0.28a 7.8±0.21a 9.8±0.36a
注：1、A：实施例1低剂量组；B：实施例1推荐剂量组；C：实施例1高剂量组；D：推荐剂量加环磷酰胺组；E：环磷酰胺组；F：黄芪多糖组；G：空白对照组；H：实施例2推荐剂量组；I：实施例3推荐剂量组；J：实施例4推荐剂量组。2、同日龄各组相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
紫锥菊根口服液对肉鸡血浆球蛋白含量的影响：
结果显示，B、C、F、H、I组血清球蛋白含量显著高于A、G、J、E试验组(P﹤0.05)，E组血清球蛋白含量显著低于其它6个试验组(P﹤0.05)。试验结果表明，环磷酰胺显著抑制血清球蛋白的生成(P﹤0.05)，D组紫锥菊根口服液能显著提高由于环磷酰胺所引起的的血清球蛋白含量的下降(P﹤0.05)，结果见下表7：
表7紫锥菊根口服液对肉鸡血清球蛋白含量(g/L)的影响(n＝5)
组别 7d 14d 21d
A 7.64±0.23a 9.43±0.24a 10.50±0.32a
B 8.86±0.26c 11.03±0.33c 11.28±0.59c
C 8.97±0.37c 11.08±0.37c 11.49±0.74c
D 6.59±0.25a 8.69±0.34a 9.86±0.35a
E 5.31±0.22b 6.85±0.36b 7.88±0.23b
F 7.14±0.36c 10.84±0.30c 11.63±0.49c
G 6.80±0.30a 8.93±0.36a 9.89±0.20a
H 8.84±0.20c 11.00±0.30c 11.30±0.48c
I 8.90±0.24c 11.04±0.28c 11.26±0.54c
J 7.40±0.22a 9.24±0.28a 10.28±0.46a
注：1、A：实施例1低剂量组；B：实施例1推荐剂量组；C：实施例1高剂量组；D：推荐剂量加环磷酰胺组；E：环磷酰胺组；F：黄芪多糖组；G：空白对照组；H：实施例2推荐剂量组；I：实施例3推荐剂量组；J：实施例4推荐剂量组。2、同日龄各组相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
结果显示，B、F组红细胞RBC-C3bR百分率明显高于G组；A组和J组与G组差异不显著，同时试验结果表明，环磷酰胺显著抑制红细胞免疫功能(P﹤0.05)。
实施例1、2、3的推荐剂量组制备的紫锥菊根口服液能明显提高肉鸡新城疫抗体水平，提高血浆球蛋白含量，而实施例4和实施例1的低剂量组不能明显提高肉鸡新城疫抗体水平，提高血浆球蛋白含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种紫锥菊根口服液的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤：
(1)将紫锥菊根药材粉碎，过筛得到紫锥菊根粉末；
(2)将1000～3000g紫锥菊根粉末以质量比1：8～1：15的料液比与重量百分比浓度为50～80％的乙醇溶液混合，浸泡20～50分钟，超声提取两次，每次超声时间20～30分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比l：5～1:10的料液比与重量百分比浓度为10～30％的乙醇溶液混合，超声波提取1次，提取时间为10～50分钟，过滤并收集滤液，合并上述滤液；
(3)将上述所得滤液在40～60℃下减压回收乙醇，浓缩至50℃下相对密度为1.02～1.10的浓缩液；
(4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1～0.3％的山梨酸钾，充分溶解，调节药液的pH值至4.0～6.0；
(5)药液静置过夜，过滤；
(6)加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，即得紫锥菊根口服液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述紫锥菊根药材为紫锥菊药材地下部分，即紫锥菊的根和根茎；所述紫锥菊为紫花紫锥菊；所述过筛为过10～40目筛。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述灭菌是采用辐射灭菌、高压灭菌或超声波灭菌。
4.一种由权利要求1～3任一项所述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。
5.根据权利要求4所述的紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用，其特征在于：所述应用是采用以下步骤：每100mL紫锥菊根口服液兑水20L～60L饮水使用，连用7天。
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