CN104257656A

CN104257656A - 一种协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物

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Publication number: CN104257656A
Application number: CN201410570568.7A
Authority: CN
Inventors: 李文化; 刘鑫; 梅柳锋; 梅运军; 万佳丽
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: CN104257656B

Abstract

本发明涉及一种能够协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物，所述组合物含有汉防己甲素及氯喹。研究证明，一定浓度的汉防己甲素和氯喹联合用药能有效诱导肿瘤细胞的死亡；通过给BALB/c裸鼠接种人肿瘤细胞并出瘤，建立裸鼠异种移植模型，肿瘤的生长曲线和肿瘤重量监测表明，联合用药有明显的抑制肿瘤生长作用。本发明证实，含汉防己甲素和氯喹药物组合所取得的抗肿瘤作用显著优于单一的汉防己甲素或氯喹，具有明显协同增效作用，为临床联合应用汉防己甲素和氯喹抗肿瘤提供了依据，是一种潜在的高效低毒的肿瘤药物。

Description

一种协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物

技术领域

本发明涉及一种联合用药物，具体涉及一种能够协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物的应用。

背景技术

恶性肿瘤（亦称癌症）主要由于细胞生长增殖机制失控，进而局部浸入正常组织，甚至经由淋巴系统、体内循环系统转移到其他部位而引起的疾病。具有如下特点：对抑制生长的信号不敏感，不受生长信号的控制而无限增殖；具有抵抗凋亡和促进血管生成的能力；具有侵袭和迁移能力。目前，常见的癌症主要有肺癌、肝癌、肠癌、宫颈癌、胶质瘤和宫颈癌等。其中肺癌在全球范围内的发病率和致死率最高，分别约占13%和18%；肝癌是源发于肝脏的恶性肿瘤，是全球致死率高居第三的恶性肿瘤，据统计2008年将近七十多万患者死于肝癌。

癌症的治疗方法主要有手术治疗、化药疗法、放射治疗、免疫疗法、靶向治疗和单克隆抗体疗法等。临床上常根据肿瘤的位置、级别和病人处于的身体状态而采取相应的治疗。此外，还有很多实验性癌症疗法正在不断发展中。虽然单药的靶向治疗疗效远胜于传统化疗，然而，多数人类恶性肿瘤存在遗传复杂性，下调肿瘤细胞中单一通路的靶点不可能产生持久的生长抑制[1]。因此，将生长抑制机制不同的药物进行联合是必要的，以优化分子靶向抗癌药物(molecularly targeted anticancer agent，MTA)。近年来，大量的临床和实验研究证明，中医药和联合药物疗法在肿瘤的防治和康复方面有特效。相对于单药治疗，联合治疗可降低治疗失败率和死亡率，减轻高浓度单药对身体的伤害，延长疗效，已渐成为人们关注的焦点。然而，靶向药物进入常规临床应用仅仅10年，有效联合每个MTA还存在许多挑战和困难[2]。

汉防己甲素(Tetrandrine，分子式C₃₈H₄₂N₂O₆，分子量622.75，CAS 号518-34-3，以下简写Tet)，又称粉防己碱，是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱。早期研究表明Tet 具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用，近年研究还证实，Tet 对多种肿瘤细胞如人白血病细胞株HL-60、人白血病U937 细胞、人肝癌细胞Mahlavu、人恶性淋巴瘤BM13674 细胞、人神经胶质瘤细胞U138MG、鼠神经母细胞瘤Neuro 2a 有抑制肿瘤细胞增生和诱导凋亡的作用[3-4]。Tet 不仅能直接抑制肿瘤生长，并且具有放疗增敏[5-7]、逆转耐药[8-9]、减轻放化疗毒副反应的作用[10]，表明Tet 在抗肿瘤治疗中有着良好的临床应用前景。但目前研究多局限于基础实验阶段,尚未见系统临床研究报道, 因此, Tet 的药理学、药代动力学及药效学还有待进一步研究, 以进一步探索和评估其临床抗肿瘤治疗的给药途径、剂量、毒副作用以及疗效, 充分发掘其

潜在抗肿瘤机理及临床应用价值。

氯喹（Chloroquine，以下简写CQ）是一个古老而应用广泛的抗疟疾药物。研究表明CQ 通过提高溶酶体PH值，抑制自噬体与溶酶体的融合，以及自噬溶酶体内蛋白的降解[11]。Amaravadi等[12]研究发现CQ（5μM）可以抑制自噬降解机制，促进p53介导的肿瘤细胞凋亡，而Maclean等[13]则认为CQ（50μM）可以直接导致肿瘤细胞死亡，且既有凋亡的特征又有自噬性死亡的特征。由此可见，CQ 在低浓度时对肿瘤细胞的抑制作用较弱，尽管大剂量CQ 能直接导致肿瘤细胞死亡，然而大剂量使用CQ 可能造成肝功能的损害。而肝癌患者通常伴有肝硬化，肝功能常处于正常临界状态。因此，利用大剂量CQ 抑制自噬，诱导肿瘤细胞直接死亡，可能很难应用于肝癌的临床治疗。

由于以上存在的问题使这些物质无法获得令人满意的治疗效果，因此，需要提高上述物质对肿瘤细胞生长抑制活性的效果，以及/ 或提供一种方法以降低治疗的剂量从而减少用药时间及/ 或减少对患者潜在或有害的副作用。尽管有这种需要，但在治疗癌症的过程中增效并不常被发现。本发明的药物组合物满足了这一需要。

参考文献

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3、Dong Y，Yang M，Kwan C. In vitro inhibition of proliferation of HL-60 cells by tetrandrine and coriolusverisicolor peptide derived from Chinese medicinal herbs ［J］. Life Sci, 1997, 60（8）: 135- 140.

4、Chang K, Chen M, Chen H. Enhancement of radioseusitivity in human glioblastoma U138MG cells by tetrandrine［J］. Neiplasma, 1999, 46（3）：196- 200.

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8、许文林，钱军，费霞，等. 汉防己甲素逆转血液系统肿瘤细胞多药耐药的临床观察［J］. 中华血液杂志，1999，20（7）：383- 384。

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12、Amaravadi RK, Yu D, Lum J J, et al. Autophagy inhibition enhances therapy-induced Apoptosis in a Myc-induced model of lymphone [J]. J Clin Invest,2007,117:326-336.

13、Maclean KH, Dorsey FC,Cleveland JL, et al. Targeting lysosomal degradation induces p53-dependent cell death and prevents cancer in mouse models of lymphomagenesis [J]. J Clin Invest,2008,118:79-88。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种治疗癌症的药物的新组合物。

本发明的体内和体外实验研究发现，一定浓度的汉防己甲素和氯喹联合用药能有效诱导肿瘤细胞的死亡，对肿瘤治疗具有显著疗效，所取得的抗肿瘤作用显著优于单一用药，具有显著的协同和增效作用，是一种高效低毒的肿瘤药物。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种治疗恶性肿瘤的药物组合物，含有汉防己甲素和氯喹。

作为一种优选，本发明的治疗恶性肿瘤的药物组合物，含有汉防己甲素和氯喹，汉防己甲素的浓度为5μM，氯喹的浓度为20μM。

所述的恶性肿瘤为肝癌、肺癌、宫颈癌、直肠癌、人神经胶质瘤。

本发明的另一个目的在于提供了上述组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

根据临床需要，可将汉防己甲素和氯喹组合与药物赋形剂或载体( 包括助溶剂、缓冲剂和稳定剂) 制成药物，主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。所以本发明还提供了一种治疗恶性肿瘤的制剂，其中包含有效剂量的组合物和辅料。

本发明通过汉防己甲素和氯喹联合使用与单药使用的比较实验，研究了汉防己甲素和氯喹联合使用对多种人肿瘤细胞如肝癌细胞Huh7、FHCC98，肺癌细胞A549，人神经胶质瘤细胞U87、U251，直肠癌细胞HCT116，宫颈癌细胞Hela等细胞株生长的影响。本发明的实验研究发现，5μM的汉防己甲素和20μM的氯喹单独作用于各种癌细胞时，对其存活影响较小；5μM汉防己甲素和20μM 氯喹联合使用对各种癌细胞具有良好的诱导癌细胞死亡的效果，而对正常肝细胞L02、正常乳腺上皮细胞HBL-100影响不明显。

本发明通过给BALB/c裸鼠接种A549细胞或Huh7细胞并出瘤，建立裸鼠异种移植模型。A549细胞或Huh7细胞异种移植模型中，肿瘤的生长曲线和肿瘤重量监测表明，联合用药有明显的抑制肿瘤生长作用。

本发明证实，含汉防己甲素和氯喹药物组合所取得的抗肿瘤作用显著优于单一的汉防己甲素或氯喹，具有明显协同增效作用，为临床联合应用汉防己甲素和氯喹抗肿瘤提供了依据，是一种潜在的高效低毒的肿瘤药物。

目前对恶性肿瘤的药物治疗以化学药品为主，开发费用昂贵，且高剂量下毒副作用大，病人常难以承受。中药治疗肿瘤已有两千年历史，从天然植物成分中分离出的抗肿瘤药物具有毒副作用小、作用独特等特点。另外，氯喹是一种传统的抗疟疾药，现在利用其抗肿瘤特性在临床使用，是对一种已获批准的药物进行“重新配置”。临床的研究表明，发展一种癌症药物的成本是十亿美元，并且从理论到被美国食品药品管理局批准的过程需要耗费15年的时间，因此，发现了旧药的新用途是一件十分值得庆幸的事，可利用这种药物已有的众多毒性和剂量数据，从而节约了大量的时间和财力。将“老药”与从中药中分离的抗癌药物以一定的比配联合利用，既可大大降低各自药物的用量，减小毒副作用，也可显著增强药效，克服肿瘤细胞的单药抗性。这种协同药物组合式的“鸡尾酒药物疗法”在肿瘤治疗中具有广阔的前景。本发明联合使用抗疟疾药物氯喹和中药汉防己甲素，从而降低了现有抗癌药物的临床用量，提高了抗癌效率，降低了毒副作用，克服了耐受性。

附图说明

图1：汉防己甲素和氯喹联合作用对肿瘤细胞存活率的影响 (*P<0.05)

图2：汉防己甲素和氯喹联合作用对正常细胞存活率的影响

图3：平板克隆形成实验，汉防己甲素和氯喹对肿瘤细胞的影响 (*P<0.05)

图4：A549裸鼠异种移植模型经汉防己甲素和氯喹处理，肿瘤体积和重量分析（*P<0.05）

图5：Huh7裸鼠异种移植模型经汉防己甲素和氯喹处理，肿瘤体积和重量分析（*P<0.05）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。所有实施例所用细胞的培养、药品的添加以及死亡率、生长抑制率的测定均按以下方法进行。

一、材料：

1. 细胞株：肝癌细胞Huh7，肺癌细胞A54肝癌细胞Huh7、FHCC98，肺癌细胞A549，人神经胶质瘤细胞U87、U251，直肠癌细胞HCT116，宫颈癌细胞Hela，鼠胶质瘤细胞C6等细胞株。对照：正常肝细胞L02、正常乳腺上皮细胞HBL-100。体外实验所用模型动物：五周龄BALB/c 雄性SPF（Specific pathogen free）级裸鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

2. 试剂：DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清和胰酶等药品来自GIBCO公司；EDTA、羧甲基纤维素钠、氯喹、汉防己甲素、青霉素、链霉素、DMSO、台盼蓝等为Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

3. 仪器：5% CO₂细胞培养箱（ThermoForma，美国），细胞培养超净工作台（苏净集团安泰公司），低温超速离心机（Haraeus公司，德国），倒置显微镜（Olympus，日本）。

二、药物制备：将汉防己甲素用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配制成10^-2M储备液，0.22μm滤膜过滤除菌备用，小量分装，－20 ℃贮存备用，临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。氯喹用PBS缓冲液配制终浓度为10^-1M储备液， 0.22μm滤膜过滤除菌，小量分装，－20 ℃贮存备用。羧甲基纤维素钠用PBS缓冲液配制终浓度为1%的储备液，0.22μm滤膜过滤除菌，小量分装，－20 ℃贮存备用。

三、药物处理

1.细胞培养：细胞按常规培养于含10 %小牛血清的RPMI-1640或DEME培养基(青霉素100 u/ mL，链霉素100 u/ mL) 中，置CO₂ 培养箱(37 ℃，5 % CO₂) 中培养。

2. 选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培养基配成1-5×10⁴个／mL的细胞悬液，接种在24孔培养板中，每孔接种1mL，37℃，5％CO₂ 培养箱中培养24h。

3. 实验组换新的含不同浓度被测药品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设5平行孔，每孔中药物溶剂（DMSO或水）的体积不超过1%总体积。37℃，5%CO₂ 培养3～5天。

四、台盼蓝排染法检测药物抗癌活性：药物作用后，0.025% 胰蛋白酶与0.5 mM EDTA(1:1)消化细胞，1000rpm 离心10min，弃上清，收集细胞,每孔加入500μL 2% 台盼蓝染液,普通光学显微镜下血球计数板计数,着色细胞为死亡细胞。选取任意视野中的500个细胞分别计数死亡细胞数和存活细胞数。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝死亡细胞数/总细胞数 ×100％

五、平板克隆形成

(1) 细胞预处理

将贴壁培养的细胞A549或Huh7，胰酶消化并吹打成细胞悬液。将细胞悬液稀释，以六孔板每孔2500个细胞的密度接种，摇匀后置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养过夜。待贴壁后加入药物处理48小时，吸去旧培养基，换回新鲜培养基，培养箱中静置培养12-14天。

(2) 结晶紫染色

吸去六孔板中上清培养基，用PBS轻轻清洗两次。六孔板中每孔加入200μL结晶紫液，避光染色20min，清水缓慢洗去染色液，室温干燥后扫描成像。

(3) 计算克隆相对形成数

将平板倒置并覆盖一张带网格的透明胶片，肉眼直接数相同大小网格内克隆数，记录每组数出的克隆数量。

六、肿瘤异种移植

1) 取对数生长期的细胞A549、Huh7，胰酶消化后，用冰冷的PBS清洗2次，以去除胎牛血清。用PBS调整细胞密度为5-8×10⁷个/mL。

2) 在32只BALB/c裸鼠右前肢腋部皮下注射A549细胞悬液0.1mL，另取32只BALB/c裸鼠右前肢腋部皮下注射Huh7细胞悬液0.1mL，建立裸鼠异种移植模型。

3) 将32只接种A549细胞并出瘤的裸鼠随机分为四组，分别按0.1%羧甲基纤维素钠，单药25mg/kg 汉防己甲素或50mg/kg氯喹，以及双药25mg/kg 汉防己甲素与50 mg/kg氯喹给裸鼠灌胃；接种Huh7细胞并出瘤的32只裸鼠随机分为四组，分别按0.1%羧甲基纤维素钠，单药25mg/kg 汉防己甲素或50mg/kg氯喹，以及双药25mg/kg 汉防己甲素与50 mg/kg氯喹给裸鼠灌胃。

4) 当肿瘤出现后（大小约1cm³），每两天灌胃给药一次。定时用游标卡尺测量肿瘤的直径，电子天平称量裸鼠的体重。肿瘤体积=a×b²/2(a：瘤体最长径，b：瘤体最短径)，并绘制肿瘤生长曲线。

实验例1：氯喹和防己甲素单独使用和联合使用对肺癌细胞、肝癌细胞、神经胶质瘤细胞、宫颈癌细胞、直肠癌细胞、鼠胶质瘤细胞的影响

用5μM的汉防己甲素或20μM的氯喹单独作用于多种癌细胞系48小时，细胞存活均未发生明显变化。但用5μM的汉防己甲素和20μM的氯喹联合处理以上癌细胞时，细胞死亡率显著升高，大部分细胞死亡率在50%以上，如图1。然而对于正常肝上皮细胞L02和乳腺上皮细胞HBL-100，5μM的汉防己甲素和20μM的氯喹联合处理并不显著影响其存活（图2），以上结果表明，此双药联合作用对正常细胞毒副作用较轻。

实验例2：平板克隆实验分析汉防己甲素和氯喹单独或联合对肿瘤细胞A549和Huh7的作用

通过平板克隆实验进一步证实较低浓度汉防己甲素和氯喹联合具有抗肿瘤作用。如图3所示，5μM汉防己甲素和20μM氯喹联合作用能显著抑制肿瘤细胞的生长，在克隆平板上90%的A549和Huh7细胞都已经失去活力，而单独用药的平板克隆上至多20%的细胞失去活力。

实验例3：汉防己甲素和氯喹联合作用对细胞A549移植瘤的影响

进一步探究汉防己甲素和氯喹双药在动物体内的抗肿瘤作用，实验建立了裸鼠肿瘤异种移植模型。将皮下注射A549细胞的32只裸鼠随机分为四组，分别作为对照组、汉防己甲素单药组、氯喹单药组及其双药联合组；当裸鼠成瘤后，按照裸鼠体重以汉防己甲素 25mg/kg，氯喹50mg/kg的浓度，对照组为0.1%的羧甲基纤维素钠，每周灌胃给药三次并测量瘤径、称量裸鼠体重。结果如图4所示，A549细胞异种移植模型中，肿瘤的生长曲线和肿瘤体重表明，双药有明显的抑制肿瘤生长作用。

实验例4：汉防己甲素和氯喹联合作用对细胞Huh7移植瘤的影响

为了进一步探究汉防己甲素和氯喹双药在动物体内的抗肝癌作用，实验建立了裸鼠肿瘤异种移植模型。将皮下注射Huh7细胞的32只裸鼠随机分为四组，分别作为对照组、汉防己甲素单药组、氯喹单药组及其双药联合组；当裸鼠成瘤后，按照裸鼠体重以汉防己甲素 25mg/kg，氯喹50mg/kg的浓度，对照组为0.1%的羧甲基纤维素钠，每周灌胃给药三次并测量瘤径、称量裸鼠体重。结果如图5所示，Huh7细胞异种移植模型中，肿瘤的生长曲线和肿瘤体重表明，双药有明显的抑制肿瘤生长作用。

Claims

1.一种能够协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物，其特征是，所述组合物含有汉防己甲素及氯喹。

2.如权利要求1所述组合物，其特征是，其中汉防己甲素的浓度为5μM，氯喹的浓度为20μM。

3.如权利要求1所述的组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。