CN104245921A - 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生L-赖氨酸的方法。更具体地，本发明涉及改良的棒状杆菌微生物，其中导入编码作为木糖合酶的木糖异构酶和木酮糖激酶的基因以表达木糖合酶。本发明还涉及产生L-赖氨酸的方法，包括利用木糖作为碳源而培养改良的棒状杆菌微生物和从所述培养物回收L-赖氨酸的步骤。

Description

可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生L-赖氨酸的方法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及经改良利用木糖的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物和利用其产生L-赖氨酸的方法。
2.相关技术的描述
工业微生物利用糖如葡萄糖、果糖和蔗糖作为碳源。通常将农产品用作原料来获得这些碳源，但是它们花费大，并且作为食物更有价值。最近，代替利用农产品作为传统原料，包括农业废物或木质废物、工业废物等的纤维素生物质已作为用于发酵的理想糖原料而吸引注意，因为它具有低成本和充足供应的优势。
它们之中，木糖是自然界中第二最丰富的木质纤维素碳水化合物，并且是代表性的纤维素生物质。有用的材料已利用工业微生物从木糖产生。例如，通过在含有包括葡萄糖和木糖的戊糖混合物的培养基中培养埃希氏菌属(Escherichia sp.)菌株并且然后从培养基回收L-氨基酸而产生L-氨基酸的方法是已知的，其中将该菌株(stain)改良以增加编码水解木糖苷的酶(木糖苷酶)的xylABFGHR基因簇的表达，木糖苷是源自木糖的糖苷(日本专利号4665567)。
另一方面，棒状杆菌(Coryneform bacteria)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)被称作用于多种L-氨基酸产生的革兰氏阳性菌株。如上面所描述的，因为木糖是自然界中第二最丰富的木质纤维素碳水化合物，所以期望L-氨基酸如L-赖氨酸可更经济地通过利用木糖从谷氨酸棒状杆菌产生。然而，谷氨酸棒状杆菌不具有木糖——其是戊糖——代谢途径中涉及的重要基因，因此存在这样的问题：L-氨基酸不能通过利用木糖而从谷氨酸棒状杆菌产生。为了解决该问题，已有这样的报道：通过导入源自大肠杆菌(Escherichia coli)的木糖异构酶(XylA)和木酮糖激酶(XylB)而将谷氨酸棒状杆菌改良以能够利用木糖(Kawaguchi等,AEM 72:3418-3428,2006)。
本发明人已做出了多方面努力来以更经济的方式产生L-氨基酸，因此，他们发现当将源自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的XylA和XylB-编码基因导入谷氨酸棒状杆菌时，该变体能利用木糖产生L-赖氨酸，并还显示较先前已知的导入有源自大肠杆菌的xylA和xylB的棒状杆菌微生物更提高的木糖利用能力，由此完成本发明。
发明概述
本发明的一个目的是提供改良的棒状杆菌属微生物，其能通过利用木糖产生L-赖氨酸。
本发明的另一个目的是提供利用改良的棒状杆菌属微生物产生L-赖氨酸的方法。
附图简述
图1显示本发明的表达载体pECCG122-pcj7-xylAB(Er)的切割图；
图2显示根据培养基中含有的碳源表示亲株和导入有表达载体的转化体的生长特性的图；和
图3显示根据培养基中含有的碳源表示亲株和将pcj7-xylAB(Er)插入染色体上的转化体的生长特性的图。
优选实施方式的详细描述
一方面，本发明提供能通过利用木糖产生L-赖氨酸的改良的棒状杆菌属微生物，其特征在于将源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木糖异构酶和木酮糖激酶的活性导入其中。
如本文所用，术语“木糖异构酶(XylA)”指催化从木糖到木酮糖异构化反应的酶，其参与木糖代谢途径，关于本发明的目的，它可以是源自胡萝卜软腐欧文氏菌的酶。
XylA是源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木糖异构酶，并可没有限制地包括能通过将其活性连同源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木酮糖激酶活性导入没有木糖异构酶活性的棒状杆菌属微生物而提供木糖-利用能力的序列。此外，显然，具有与上述序列的活性等同的活性的任何序列，虽然它不是源自胡萝卜软腐欧文氏菌，也包括在本发明的范围内。
例如，可包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置一个氨基酸或几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型而变化，具体地2至20，具体地2至10，更具体地2至5个氨基酸)置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列。只要它能保持或提高XylA活性，可包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，更具体地97％或更多同源性的氨基酸序列，并且氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有XylA活性的微生物中的突变序列或人工修饰的序列。
如本文所用，术语“同源性”指两个不同氨基酸序列或两个不同核苷酸序列之间的同一性，并可通过本领域技术人员熟知的方法测定，例如，BLAST 2.0，其计算参数如分数、同一性和相似性，但是不特别限于此。
如本文所用，术语“木酮糖激酶”指催化从木酮糖到木酮糖5-磷酸盐的产生反应的酶，其参与木糖代谢途径，关于本发明的目的，它可以是源自胡萝卜软腐欧文氏菌的酶。
XylB是源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木酮糖激酶，并可没有限制地包括能通过将其活性连同源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木糖异构酶活性导入没有木酮糖激酶活性的棒状杆菌属微生物而提供木糖-利用能力的序列。此外，显然，具有与上述序列的活性等同的活性的任何序列，虽然它不是源自胡萝卜软腐欧文氏菌，也包括在本发明的范围内。
例如，可包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置一个氨基酸或几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型而变化，具体地2至20，具体地2至10，更具体地2至5个氨基酸)置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列。只要它能保持或提高XylB活性，可包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，更具体地97％或更多同源性的氨基酸序列，并且氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有XylB活性的微生物中的突变序列或人工修饰的序列。
如本文所用，术语“木糖异构酶(XylA)-编码基因(在下文中，xylA)”指编码上述XylA的多核苷酸。
所述基因可包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列，可与源自SEQ ID NO:3的核苷酸序列的探针在“严格条件”下杂交的核苷酸序列，或其中一个核苷酸或几个核苷酸在SEQ ID NO:3的核苷酸序列的一个或多个位置被置换、缺失、插入或添加的核苷酸序列。只要它能保持或提高XylA活性，所述基因可包括与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有80％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，更具体地97％或更多同源性的核苷酸序列，由宿主细胞偏爱的密码子置换的核苷酸序列，其N-端或C-端被延伸或除去的核苷酸序列，或其起始密码子被修饰以控制表达水平的核苷酸序列，因此所述基因不具体限于此。
如本文所用，术语“木酮糖激酶(XylB)-编码基因(在下文中，xylB)”指编码上述XylB的多核苷酸。
所述基因可包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列，可与源自SEQ ID NO:4的核苷酸序列的探针在“严格条件”下杂交的核苷酸序列，或一个核苷酸或几个核苷酸在SEQID NO:4的核苷酸序列的一个或多个位置被置换、缺失、插入或添加的核苷酸序列。只要它能保持或提高XylB活性，所述基因可包括与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有80％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，更具体地97％或更多同源性的核苷酸序列，由宿主细胞偏爱的密码子置换的核苷酸序列，其N-端或C-端被延伸或除去的核苷酸序列，或其起始密码子被修饰以控制表达水平的核苷酸序列，因此所述基因不具体限于此。
如本文所用，术语“严格条件”指这样的条件，其允许多核苷酸之间的特异杂交，例如，在65℃在杂交缓冲液(3.5×SSC(0.15M NaCl/0.15M柠檬酸钠，pH7.0)、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、0.5％SDS、2mM EDTA、2.5mMNaH2PO4，pH7)中的杂交，详细描述公开在相关技术中(Molecular Cloning(ALaboratory Manual,J.Sambrook等编辑者,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989)或Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑者,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
如上所述，XylA和XylB活性导入棒状杆菌属微生物可通过本领域众所周知的多种方法进行。例如，存在将包括编码XylA和XylB的核苷酸序列的多核苷酸插入进染色体的方法，将包括多核苷酸的载体系统导入微生物的方法，将有效的启动子导入编码XylA和XylB的核苷酸序列上游的方法，使xylA和xylB导入有修饰的启动子的方法，或导入修饰的编码XylA和XylB的核苷酸序列的方法等等。更具体地，如果导入编码XylA和XylB的核苷酸序列，则来自产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)的pcj7启动子(韩国专利号10-0620092)可用作控制其表达的启动子。在本发明的一个实施方式中，木糖-利用能力的获得被证实，因为通过表达载体的导入或染色体插入观察到亲株中不存在的外来基因的活性。
如本文所用，术语“载体”指具有编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA产物，其可操作地连接至合适的调控序列以在合适的宿主中表达靶蛋白。调控序列包括能启动转录的启动子、用于调控转录的任意操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录终止和翻译的序列。一旦转化进合适的宿主，载体就可不依赖宿主基因组复制或起作用，或可整合进自身基因组。
用于本发明的载体没有具体限制并可以是本领域已知的任何载体，只要它可在宿主中复制。通常使用的载体的实例可以是天然或重组的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可利用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等。作为质粒载体，可利用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。
用于本发明的载体没有具体限制，并可利用已知的表达载体。具体地，可利用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
此外，用于本发明的载体可以是能转化宿主细胞的载体以将编码靶蛋白的多核苷酸插入宿主细胞的染色体。载体的具体实例包括，但不限于，可以在大肠杆菌(E.coli)和或棒型细菌中以两个方向自我复制的穿梭载体pECCG112(韩国专利号10-0057684)。
如本文所用，术语“转化”指用于将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞以在宿主细胞中表达多核苷酸编码的蛋白质的一系列操作。将被导入宿主细胞的多核苷酸可具有任何形式，只要它被导入宿主细胞和在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式导入宿主细胞，该表达盒是包括自我表达需要的所有元件(可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译终止信号等)的结构。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，可将多核苷酸自身导入宿主细胞以可操作地连接至在宿主细胞中表达需要的序列。
宿主细胞可以是原核微生物中的任何一种，只要它能产生L-赖氨酸。宿主细胞的实例可包括普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属和短杆菌属(Brevibacterium sp.)微生物，具体地，棒状杆菌属微生物，更具体地谷氨酸棒状杆菌。在本发明的一个实施方式中，当作为没有木糖-利用能力的棒状杆菌属微生物的KCCM11016P、KCCM10770P、KFCC10750和CJ3P导入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的XlyA和XlyB时，它们拥有木糖-利用能力，所以，L-氨基酸如L-赖氨酸可通过利用木糖作为碳源而被产生(表1至6)。
具有产生L-赖氨酸能力的棒状杆菌属微生物可以是抵抗L-赖氨酸类似物的变体。L-赖氨酸类似物抑制棒状杆菌微生物的生长，但是当L-赖氨酸在培养基中共存时，该抑制被完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，氧杂-L-赖氨酸、L-赖氨酸氧肟酸盐、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基L-赖氨酸、α-氯己内酰胺(chlorocaprolactam)等。对这些L-赖氨酸类似物具有抗性的变体可通过对棒状杆菌微生物的常规人工诱变处理而获得。此外，当进行遗传操作以诱导产生L-赖氨酸的微生物时，可通过提高编码参与L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因中一个或多个的表达来实现。这些基因的实例可包括二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)和天冬氨酸酶基因(aspA)，但是不限于此。
如本文所用，术语“L-赖氨酸”是碱性α-氨基酸的一种，是不在身体中合成的必需氨基酸，是L-氨基酸的一种，并具有NH2(CH2)4CH(NH2)COOH的化学式。L-赖氨酸通过L-赖氨酸生物合成途径从草乙酸盐合成，并且NADPH依赖性还原酶催化L-赖氨酸生物合成的中间过程。在1分子L-赖氨酸的生物合成过程期间，3分子NADPH由相应的酶直接消耗，并且1分子NADPH被间接使用。
如本文所用，术语“能产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物”指经改良从木糖产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物，其通过导入编码参与木糖代谢且棒状杆菌属微生物中未发现的酶的基因进行制备。棒状杆菌属微生物可以是，但不具体限于，谷氨酸棒状杆菌，并且参与木糖代谢的酶的可以是，但不具体限于，XylA和XylB。
从这一点上，宿主细胞可以是棒状杆菌属微生物，其中编码参与L-赖氨酸生物合成系统的酶的一个或多个基因的表达得以提高，并且编码参与L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因可以是，但不限于，二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)和天冬氨酸酶基因(aspA)等。
此外，宿主细胞可以是抵抗L-赖氨酸类似物的突变株。突变株可通过突变棒状杆菌属微生物而获得。L-赖氨酸类似物抑制棒状杆菌微生物的生长，但是当L-赖氨酸在培养基中共存时，该抑制被完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例可以是，但不具体限于，氧杂-L-赖氨酸、L-赖氨酸氧肟酸盐、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基L-赖氨酸、α-氯己内酰胺等。
同时，在本发明中，参与L-赖氨酸生物合成的已知酶的活性可被另外控制以进一步提高L-赖氨酸产生。具体地，在本发明中，将asd、dapB和ddh基因——每个编码天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱氢酶——过量表达以另外控制酶活性，由此提高L-赖氨酸产生。
根据本发明的一个实施方式，本发明人选择源自胡萝卜软腐欧文氏菌(SCRI1043)的ECA0097(xylA)(SEQ ID NO:1)和ECA0096(xylB)(SEQ ID NO:2)作为编码XylA和XylB的合适基因以导入棒状杆菌属微生物(实施例1)，并且他们克隆了选择的编码XylA和XylB的基因以构建同时表达xylA和xylB(在下文中，xylAB(Er))的表达载体pECCG122-pcj7-xylA-xylB(在下文中，pECCG122-pcj7-xylAB(Er))。将所述表达载体导入谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(该微生物被公开为KFCC10881，并重新保存到布达佩斯条约规定的国际保藏管理局(International Depositary Authority)，登记号KCCM11016P，韩国专利号10-0159812和10-0397322)以制备过量表达xylAB(Er)的转化体。据证实，制备的转化体通过利用木糖作为碳源而生长(图2)，并通过利用葡萄糖和木糖中的每一种，或通过同时利用葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸(表1)。此外，为了表达染色体上的xylAB(Er)，构建用于染色体插入的重组载体，pDZTn-pcj7-xylAB(Er)，并转化进KCCM11016P，通过第二交换，构建具有xylAB(Er)的转化体KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)，xylAB(Er)可操作地连接至染色体上转座子内的pcj7启动子。还证实，转化体通过利用木糖作为碳源而生长(图3)，并通过利用葡萄糖和木糖中的每一种，或通过同时利用葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸(表2)。此外，为了比较先前报道的源自大肠杆菌的xylAB(在下文中，xylAB(Ec))的导入和本发明的源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB(Er)导入之间提高木糖-利用能力的效果，菌株(KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec))通过将xylAB(Ec)导入KCCM11016P来制备，并与制备的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)比较其木糖-利用能力和L-赖氨酸产生特性。因此，发现与KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)相比，KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)的木糖消耗率显著增加，这表明L-赖氨酸的发酵产生的提高(表3)。此外，为了证实是否多种棒状杆菌属微生物显示相同的结果，将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入L-赖氨酸-产生菌株KCCM10770P，制备转化体KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er)，并证实所述转化体能通过利用葡萄糖和木糖中每一种，或通过同时利用葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸(表4)。还将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入另一个L-赖氨酸-产生菌株KFCC10750(该微生物被公开为KFCC10750，并重新保存到布达佩斯条约规定的国际保藏管理局，登记号KCCM11347P，韩国专利号10-0073610)以制备转化体KFCC10750-pcj7-xylAB(Er)。据证实，该转化体能通过利用葡萄糖和木糖中每一种，或通过同时利用葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸(表5)。进一步，还将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入其它L-赖氨酸-产生菌株CJ3P，以制备转化体CJ3P-pcj7-xylAB(Er)。还证实该转化体能通过利用葡萄糖和木糖中每一种，或通过同时利用葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸(表6)。
因此，本发明人将所述转化体称作“CA01-2195”，其通过利用培养基中的木糖而生长并还通过利用培养基中的木糖和葡萄糖来产生L-赖氨酸，并于2011年12月29日根据布达佩斯条约将它保藏在韩国微生物培养中心(KCCM,其位于Hongjae1-Dong,Seodaemun-Gu,Seoul,Korea)，登记号KCCM11242P。即，该保藏被布达佩斯条约规定的国际保藏管理局认可。
另一方面，本发明提供产生L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：(i)培养改良的能通过利用含有木糖的培养基中的木糖作为碳源而产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物，以获得培养肉汤；和(ii)从培养肉汤回收L-赖氨酸。
如本文所用，术语“培养”指将微生物在人工控制的环境条件下培养。在本发明中，培养棒状杆菌属微生物的方法可利用本领域广泛已知的方法来进行。具体地，培养方法的实例包括分批法、连续方式的补料分批或重复的补料分批法，但是不限于此。
用于培养的培养基必需以适当方式满足特定微生物的要求同时在需氧条件下在含有适当碳源、氮源、氨基酸、维生素等的典型培养基中控制温度、pH等。用于棒状杆菌菌株的培养基被公开(例如，Manual of Methods for General Bacteriology,American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。可能的碳源可包括糖和碳水化合物如蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，除了作为主要碳源的葡萄糖和木糖的混合物以外，油和脂肪如大豆油、葵花子油、蓖麻油和椰子脂，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，以及有机酸如乙酸。这些物质可单独或作为混合物使用。可能的氮源可包括无机氮源如铵、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源如蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸出液体、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、以及脱脂大豆饼或其分解产物。这些氮源可单独或组合使用。培养基可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。可能的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。进一步，可利用无机化合物如氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和碳酸钙。除了以上的物质以外，可包括必要的生长物质，如氨基酸和维生素。
还可将适当的前体加入培养基。培养期间可将上面提到的物质适当地以分批、补料分批或连续方式加入培养基，但是不具体限于此。培养基的pH可通过适当地加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和铵，或酸性化合物如磷酸和硫酸来调节。
消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可用于抑制泡沫发展。为了保持需氧条件，可将氧或含氧气体(例如，空气)导入培养肉汤。培养肉汤温度通常是27℃至37℃，具体地30℃至35℃。培养可持续直到L-赖氨酸的产生达到期望的水平。该目的可通常在10至100小时内达到。L-赖氨酸可被释放进培养基或包括在细胞内。
此外，从培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤可通过本领域已知的方法进行。具体地，已知回收L-赖氨酸方法是，但不具体限于，具体地离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、差别性溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水和大小排阻)等。
在下文中，本发明的组成和效果将参考实施例被更详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明的范围不意欲受这些实施例限制。
实施例1：外来基因的选择
选择源自胡萝卜软腐欧文氏菌(SCRI1043)的ECA0097(xylA)(氨基酸:SEQ ID NO:1，核苷酸:SEQ ID NO:3)和ECA0096(xylB)(氨基酸:SEQ ID NO:2,核苷酸:SEQ IDNO:4)作为外来基因来制备改良的拥有木糖-利用能力的棒状杆菌属微生物。
实施例2：源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB表达载体的构建
将实施例1中选择的源自胡萝卜软腐欧文氏菌的XylA和XylB-编码基因彼此接近地定位。关于xylA和xylB(Er)以及周围核苷酸序列的信息(登记号BX950851)获自US NIH GenBank，并且基于获得的核苷酸序列，合成用于扩增源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB(Er)的引物。
SEQ ID NO:5:5’-ACACATATGCAAGCCTATTTTGAACAGATC-3’
SEQ ID NO:6:5’-AGAACTAGTGCCTTTTGGTGGTGTTTAAGT-3’
为了获得xylAB(Er)片段，利用胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCRI1043的染色体DNA作为模板和一对引物(SEQ ID NOs:5和6)进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，如下进行PCR：在94℃变性5分钟，之后重复包括在94℃变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃聚合3分钟的循环30次，然后在72℃聚合7分钟。因此，获得含有2844bp的xylAB(Er)(SEQ ID NO:17)的3122bp的基因片段(SEQ ID NO:18)。为了获得源自产氨棒状杆菌的pcj7启动子(KR0620092)，利用产氨棒状杆菌CJHB100(KR0620092)的基因组DNA作为模板和一对引物(SEQ IDNOs:15和16)进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，如下进行PCR:在94℃变性5分钟，之后重复包括在94℃变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃聚合1分钟的循环30次，然后在72℃聚合7分钟。因此，获得318bp的多核苷酸(SEQ ID NO:14)。
SEQ ID NO:15:5’-AATCTAGAAACATCCCAGCGCTA-3’
SEQ ID NO:16:5’-AAACTAGTCATATGTGTTTCCTTTCGTTG-3’
利用限制酶XbaI和SpeI将pcj7克隆进大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体pECCG122，然后利用NdeI和SpeI克隆xylAB(Er)片段，由此获得pECCG122-pcj7-xylAB(Er)载体(图1)。图1是本发明的表达载体pECCG122-pcj7-xylAB(Er)的切割图。
实施例3：导入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB的L-赖氨酸-产生菌株的生 长和木糖-利用能力的考查
将实施例2中获得的每个表达载体pECCG122-pcj7-xylAB(Er)导入谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国专利号10-0159812和10-0397322)以制备xylAB(Er)-表达转化体，谷氨酸棒状杆菌CA01-2195。
为了比较KCCM11016P和CA01-2195之间的木糖-利用能力，将所述菌株在含有葡萄糖或木糖作为碳源的种子培养基中培养，并比较它们的生长特性。还将它们在含有葡萄糖或木糖作为碳源的生产培养基中培养并且比较它们的L-赖氨酸产生特性。
首先，为了比较生长特性，将菌株分别接种在25ml种子培养基[碳源(葡萄糖或木糖)10g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物10g/l、尿素5g/l、KH2PO44g/l、K2HPO48g/l、MgSO47H2O0.5g/l、生物素100μg/l、硫胺素-HCl 1mg/l、pH7.0]中。当在30℃培养菌株32小时时测量培养肉汤的吸光度(OD600)，并互相比较(图2)。图2是根据培养基中含有的碳源显示KCCM11016P和CA01-2195的生长特性的图，其中(◆)表示在含有葡萄糖的培养基中培养的KCCM11016P，(■)表示在含有木糖的培养基中培养的KCCM11016P，(▲)表示在含有葡萄糖的培养基中培养的CA01-2195，和(×)表示在含有木糖的培养基中培养的CA01-2195。
如图2所示，在含有葡萄糖作为碳源的种子培养基中KCCM11016P和CA01-2195之间的生长特性没有差异。然而，在含有木糖作为碳源的种子培养基中，CA01-2195生长到某个水平，而KCCM11016P几乎不生长。因此，可见CA01-2195能通过利用培养基中含有的木糖作为唯一碳源而生长。
接下来，为了比较KCCM11016P和CA01-2195之间的L-赖氨酸产生特性，将1ml种子培养肉汤接种在24ml生产培养基[碳源、(NH4)2SO440g/l、大豆蛋白质2.5g/l、玉米浸出固体(corn steep solids)5g/l、尿素3g/l、KH2PO41g/l、MgSO47H2O 0.5g/l、生物素100μg/l、硫胺素-HCl 1mg/l、CaCO330g/l，pH7.0]中，并在35℃和200rpm培养72小时。这时，测定葡萄糖100g/l、葡萄糖50g/l+木糖50g/l和葡萄糖70g/l+木糖30g/l以用作碳源。接下来，测量和比较每个培养肉汤中L-赖氨酸浓度、剩余木糖的浓度和剩余葡萄糖的浓度(表1)。
[表1]
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
R.G:剩余葡萄糖(反应终止后剩余葡萄糖的浓度)
如表1所示，当利用不含有木糖(葡萄糖100g/l)的培养基时，亲株中产生的L-赖氨酸浓度与CA01-2195等同。然而，当利用含有木糖(葡萄糖50g/l+木糖50g/l和葡萄糖70g/l+木糖30g/l)的培养基时，CA01-2195通过消耗葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸，而亲株通过不消耗木糖但是只消耗葡萄糖而产生L-赖氨酸。
该结果表明没有木糖-利用能力的棒状杆菌属微生物能够通过导入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB而消耗木糖。
实施例4：用于源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB(pDZTn-pcj7-xylAB(Er))的染 色体插入的重组载体和用于源自大肠杆菌的xylAB(pDZTn-pcj7-xylAB(Ec))的染色 体插入的重组载体的构建
为了在染色体上表达xylAB(Er)，构建用于染色体插入的重组载体pDZTn-pcj7-xylAB(Er)。为了获得pcj7-xylAB(Er)片段，利用实施例中获得的pECCG122-pcj7-xylAB(Er)作为模板和一对引物(SEQ ID NOs:7和8)进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，如下进行PCR：在94℃变性5分钟，之后重复包括在94℃变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃聚合3分钟的循环30次，然后在72℃聚合7分钟。因此，获得3440bp的基因片段(SEQ ID NO:9)。因此，利用BD In-Fusion试剂盒将3440bp的pcj7-xylAB(Er)克隆进用限制酶SpeI处理的pDZTn载体(韩国专利号10-1126041)，由此获得pDZTn-pcj7-xylAB(Er)重组载体。
SEQ ID NO:7:5’-GAGTTCCTCGAGACTAGTAGAAACATCCCAGCGCTA-3’
SEQ ID NO:8:5’-GATGTCGGGCCCACTAGGCCTTTTTGGTGGTGTTTA-3’
接下来，为了在染色体上表达源自大肠杆菌的xylAB，构建用于染色体插入的重组pDZTn-pcj7-xylAB(Ec)。为了获得pcj7启动子，利用实施例2中获得的pcj7片段作为模板和一对引物(SEQ ID NOs:7和10)进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，如下进行PCR：在94℃变性5分钟，之后重复包括在94℃变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃聚合1分钟的循环30次，然后在72℃聚合7分钟。因此，获得318bp的基因片段。为了获得xylAB(Ec)片段，利用大肠杆菌K12的染色体DNA作为模板和一对引物(SEQ ID NOs:11和12)进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，如下进行PCR：在94℃变性5分钟，之后重复包括在94℃变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃聚合3分钟的循环30次，然后在72℃聚合7分钟。因此，获得3145bp的xylAB(Ec)片段(SEQ ID NO:13)。因此，利用BD In-Fusion试剂盒将318bp的pcj7区和3145bp的xylAB(Ec)的PCR产物克隆进用限制酶SpeI处理的pDZTn载体，由此获得最终的pDZTn-pcj7-xylAB(Ec)重组载体。
SEQ ID NO:10:5’-TCAAAATAGGCTTGCATGAGTGTTTCCTTTCGTTG-3’
SEQ ID NO:11:5’-CAACGAAAGGAAACACATGCAAGCCTATTTTGAC-3’
SEQ ID NO:12:5’-GATGTCGGGCCCACTAGTGCTGTCATTAACACGCCA-3’
实施例5：插入有源自欧文氏菌属的xylAB的L-赖氨酸–产生菌株的生长和木糖- 利用能力的考查
将制备的pDZTn-pcj7-xylAB(Er)载体转化进KCCM11016P，并通过第二交换，获得具有xylAB(Er)的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)菌株，其中置换染色体上转座子内的一个拷贝的pcj7启动子。
为了比较KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)和KCCM11016P之间的木糖-利用能力，将它们在含有葡萄糖或木糖作为碳源的种子培养基中培养，比较它们的生长特性，并将它们在含有葡萄糖或木糖作为碳源的生产培养基中培养，比较它们的L-赖氨酸产生特性，其方式与实施例3中的相同。
图3是根据培养基中含有的碳源显示菌株生长特性的图，其中(◆)表示含有葡萄糖的培养基中培养的KCCM11016P，(■)表示含有木糖的培养基中培养的KCCM11016P，(▲)表示含有葡萄糖的培养基中培养的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)，和(×)表示含有木糖的培养基中培养的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)。
在含有葡萄糖作为碳源的种子培养基中KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)和KCCM11016P之间的生长特性没有差异。然而，在含有木糖作为碳源的种子培养基中，KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)生长到某个水平，而KCCM11016P几乎不生长。因此，可见当将xylAB(Er)插入染色体时，菌株能通过利用培养基中含有的木糖而生长。
接下来，考查KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)和KCCM11016P的L-赖氨酸产生特性并互相比较(表2)。
[表2]
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
R.G:剩余葡萄糖(反应终止后剩余葡萄糖的浓度)
如表2所示，当利用不含有木糖(葡萄糖100g/l)的培养基时，KCCM11016P中产生的L-赖氨酸浓度与KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)等同。然而，当利用含有木糖(葡萄糖50g/l+木糖50g/l和葡萄糖70g/l+木糖30g/l)的培养基时，KCCM11016P通过只消耗葡萄糖而产生L-赖氨酸，而KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)通过消耗葡萄糖和木糖而产生L-赖氨酸。
实施例6：插入有源自大肠杆菌的xylAB的L-赖氨酸-产生菌株的制备和其木糖- 利用能力与KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)菌株的比较
为了比较先前报道的源自大肠杆菌的xylAB的导入和本发明的源自胡萝卜软腐欧文氏菌的XylAB的导入之间提高木糖-利用能力的效果，通过将xylAB(Ec)导入KCCM11016P来制备菌株，并与制备的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)比较其木糖-利用能力和L-赖氨酸产生特性。
为了制备xylAB(Ec)-导入的菌株，将实施例4中制备的pDZTn-pcj7-xylAB(Ec)重组载体转化进KCCM11016P，并通过第二交换，获得xylAB(Ec)可操作地连接至染色体上转座子内pcj7启动子的KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)菌株。
以与实施例3相同的方式，为了比较KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)和KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)之间的木糖-利用能力，将它们在含有葡萄糖50g/l+木糖50g/l作为碳源的生产培养基中培养，并且比较它们的L-赖氨酸产生特性，以及为了考查木糖-利用能力，在15小时测量培养肉汤中剩余木糖的浓度(表3)。
[表3]
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
如表3所示，两个菌株显示等同的L-赖氨酸生产率。KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)的木糖消耗速度较KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)快，这表明发酵生产率的改进。即，该结果表明，本发明的源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB(Er)的导入显示较先前源自大肠杆菌的xylAB(Ec)的导入更优良的提高L-赖氨酸发酵生产率的效果。
实施例7：插入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB的源自KCCM10770P的菌 株的生长和木糖-利用能力的考查
为了考查是否xylAB(Er)导入显示与除KCCM11016P外的其它L-赖氨酸-产生菌株中相同的效果，将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入L-赖氨酸-产生菌株KCCM 10770P(韩国专利号10-0924065)——其被保藏到布达佩斯条约规定的国际保藏管理局。通过电脉冲方法导入之后，通过第二交换获得具有xylAB(Er)的菌株，其中置换染色体上转座子内一个拷贝的pcj7启动子，并将所述菌株命名为谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er)。
以与实施例3中相同的方式测量谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P和本发明的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-pcj7-xylAB(Er)的木糖-利用能力和L-赖氨酸生产率(表4)。
[表4]
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
R.G:剩余葡萄糖(反应终止后剩余葡萄糖的浓度)
如表4所示，当L-赖氨酸-产生菌株KCCM10770P导入有xylAB(Er)时，它完全消耗木糖，与不能利用木糖的亲株不同，并且其L-赖氨酸生产率也增加了。
该结果支持，当将来自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB导入多种棒状杆菌属微生物以及某个登记号指定的棒状杆菌属微生物时，它们完全消耗作为碳源的木糖，由此有效地产生氨基酸如L-赖氨酸。
实施例8：插入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB的源自KFCC10750的菌株 的生长和木糖-利用能力的考查
为了考查是否xylAB(Er)导入显示与除KCCM11016P外其它L-赖氨酸-产生菌株中相同的效果，将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入L-赖氨酸-产生菌株KFCC10750(韩国专利号10-0073610)。通过电脉冲方法导入之后，通过第二交换获得具有xylAB(Er)的菌株，其中置换染色体上转座子内一个拷贝的pcj7启动子，并将所述菌株命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10750-pcj7-xylAB(Er)。
以与实施例3中相同的方式测量谷氨酸棒状杆菌KFCC10750和本发明的谷氨酸棒状杆菌KFCC10750-pcj7-xylAB(Er)的木糖-利用能力和L-赖氨酸生产率(表5)。
[表5]
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
R.G:剩余葡萄糖(反应终止后剩余葡萄糖的浓度)
如表5所示，当L-赖氨酸-产生菌株KFCC10750导入有xylAB(Er)时，它完全消耗木糖，与不能利用木糖的亲株不同，并且其L-赖氨酸生产率也增加了。
该结果支持，当将源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB导入多种棒状杆菌属微生物以及某个登记号指定的棒状杆菌属微生物时，它们完全消耗作为碳源的木糖，由此有效地产生氨基酸如L-赖氨酸。
实施例9：插入有源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB的源自CJ3P的菌株的生长 和木糖-利用能力的考查
为了考查是否xylAB(Er)导入显示与除KCCM11016P外其它L-赖氨酸-产生菌株中相同的效果，将pDZTn-pcj7-xylAB(Er)导入L-赖氨酸-产生菌株CJ3P。CJ3P菌株是一种谷氨酸棒状杆菌菌株，其具有基于Binder等(Genome Biology 2102,13:R40)报道的技术通过将P458S、V59A和T311I突变导入野生型菌株的3种基因pyc、hom和lysC而产生L-赖氨酸的能力。通过电脉冲方法导入之后，通过第二交换获得具有xylAB(Er)的菌株，其中置换染色体上转座子内一个拷贝的pcj7启动子，并将所述菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CJ3P-pcj7-xylAB(Er)。
以与实施例3中相同的方式测量谷氨酸棒状杆菌CJ3P和本发明的谷氨酸棒状杆菌CJ3P-pcj7-xylAB(Er)的木糖-利用能力和L-赖氨酸生产率(表6)。
[表6]
菌株 R.G R.X L-赖氨酸
CJ3P 0 50 4.0
0 50 4.5
CJ3P-pcj7-xylAB(Er) 0 0 8.5
0 0 9.0
R.X:剩余木糖(反应终止后剩余木糖的浓度)(单位：g/l)
R.G:剩余葡萄糖(反应终止后剩余葡萄糖的浓度)
如表6所示，当L-赖氨酸-产生菌株CJ3P导入有xylAB(Er)时，它完全消耗木糖，与不能利用木糖的亲株不同，并且其L-赖氨酸生产率也增加了。
该结果支持，当将源自胡萝卜软腐欧文氏菌的xylAB导入多种棒状杆菌属微生物以及某个登记号指定的棒状杆菌属微生物时，它们完全消耗作为碳源的木糖，由此有效地产生氨基酸如L-赖氨酸。
因此，表达xylAB(Er)的棒状杆菌属微生物能通过利用培养基中的木糖而生长，并且还能通过利用培养基中的木糖和葡萄糖而产生L-赖氨酸。
发明效果
当利用本发明的能通过利用木糖而产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物时，可通过利用作为自然界中第二最丰富的木质纤维素碳水化合物的木糖产生L-赖氨酸。因此，所述微生物可广泛用于L-赖氨酸的有效和经济生产。

Claims (6)

1.改良的能通过利用木糖而产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物，其中导入源自胡萝卜软腐欧文氏菌的木糖异构酶(XylA)和木酮糖激酶(XylB)的活性。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中XylA包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及XylB包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中XylA由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列编码，以及XylB由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述XylA和XylB活性的导入通过将包括编码XylA和XylB的核苷酸序列的多核苷酸插入染色体，将包括所述多核苷酸的载体系统导入所述微生物，将有效的启动子导入到所述编码XylA和XylB的核苷酸序列上游，使XylA和XylB导入有修饰的启动子，或导入修饰的编码XylA和XylB的核苷酸序列而实施。
6.产生L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
(i)在含有木糖作为碳源的培养基中培养根据权利要求1至5中任一项所述的改良的能通过利用木糖而产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物以获得培养肉汤；和
(ii)从所述培养肉汤回收L-赖氨酸。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017133040A1 (zh) * 2016-02-03 2017-08-10 程雪娇 一种甘蔗渣培养基及其制备方法
WO2018040469A1 (zh) 2016-09-01 2018-03-08 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵生产l-赖氨酸的棒杆菌
CN107922954A (zh) * 2015-07-03 2018-04-17 Cj第制糖株式会社 具有l‑赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l‑赖氨酸的方法
CN115038715A (zh) * 2021-01-29 2022-09-09 Cj第一制糖株式会社 新Co/Zn/Cd外排系统组件变体及使用其生产L-赖氨酸的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3061828B1 (en) 2013-10-23 2024-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
KR101755767B1 (ko) 2014-09-05 2017-07-10 씨제이제일제당 (주) L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
KR101694850B1 (ko) 2014-10-08 2017-01-10 씨제이제일제당 주식회사 L-글루타민을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산방법
KR102676949B1 (ko) 2015-07-13 2024-06-19 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션 크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법
KR101915433B1 (ko) * 2018-02-13 2018-11-05 씨제이제일제당 (주) 시트레이트 신타아제 (Citrate synthase)의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 L-아미노산 생산방법
CN110551648B (zh) * 2018-05-30 2022-03-15 天津大学 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途
KR102112240B1 (ko) * 2018-09-28 2020-05-18 씨제이제일제당 주식회사 알파-글루코시다제의 활성이 강화된 l-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
EP4083064A4 (en) * 2019-12-23 2024-06-05 CJ CheilJedang Corporation MICROORGANISM FOR PRODUCING L-AMINO ACID HAVING INCREASED CYTOCHROME C ACTIVITY, AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING SAME
CN112458108A (zh) * 2020-11-24 2021-03-09 华东理工大学 一种在谷氨酸棒状杆菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路径的构建方法
KR20220156323A (ko) * 2021-05-18 2022-11-25 씨제이제일제당 (주) Agl 단백질의 활성이 강화된, 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060216804A1 (en) * 2003-09-11 2006-09-28 Karhumaa Kaisa J Construction of new xylose utilizing saccharomyces cerevisiae strain
CN102037120A (zh) * 2008-03-27 2011-04-27 纳幕尔杜邦公司 具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY113040A (en) * 1994-02-24 2001-11-30 Ajinomoto Kk Novel gene derived from coryneform bacteria and use thereof
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
KR100397322B1 (ko) 2000-12-30 2003-09-06 씨제이 주식회사 엘-라이신의 제조방법
US8003367B2 (en) 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
RU2283346C1 (ru) * 2005-03-14 2006-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
RU2304615C2 (ru) * 2005-10-12 2007-08-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
KR100838035B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
WO2009154122A1 (ja) * 2008-06-17 2009-12-23 財団法人地球環境産業技術研究機構 Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体
KR101083136B1 (ko) * 2009-02-13 2011-11-11 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산용 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060216804A1 (en) * 2003-09-11 2006-09-28 Karhumaa Kaisa J Construction of new xylose utilizing saccharomyces cerevisiae strain
CN102037120A (zh) * 2008-03-27 2011-04-27 纳幕尔杜邦公司 具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMED ZAHOOR 等: ""Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum aimed at alternative carbon sources and new products"", 《COMPUTATIONGNAL AND STRUCTURAL BIOTECHNOLOGY JOURNAL》 *
BELL.K.S: ""BX950851.1"", 《GENBANK》 *
HIDEO KAWAGUCHI等: ""Engineering of a Xylose Metabolic Pathway in Corynebacterium glutamicum"", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922954A (zh) * 2015-07-03 2018-04-17 Cj第制糖株式会社 具有l‑赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l‑赖氨酸的方法
CN107922954B (zh) * 2015-07-03 2022-01-11 Cj第一制糖株式会社 具有l-赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l-赖氨酸的方法
WO2017133040A1 (zh) * 2016-02-03 2017-08-10 程雪娇 一种甘蔗渣培养基及其制备方法
WO2018040469A1 (zh) 2016-09-01 2018-03-08 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵生产l-赖氨酸的棒杆菌
US11242545B2 (en) 2016-09-01 2022-02-08 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Corynebacterium for producing L-lysine by fermentation
CN115038715A (zh) * 2021-01-29 2022-09-09 Cj第一制糖株式会社 新Co/Zn/Cd外排系统组件变体及使用其生产L-赖氨酸的方法

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US20160040200A1 (en) 2016-02-11
EP2803722B1 (en) 2017-09-27
KR101592140B1 (ko) 2016-02-22
CN104245921B (zh) 2018-09-14

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