CN102037120A - 具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属 - Google Patents

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Abstract

通过导入嵌合木糖异构酶基因以工程化的发酵单胞菌属菌株，所述基因包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的突变型启动子。所述启动子引导木糖异构酶的提高表达，此外当所述菌株经工程化表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶时，获得木糖的改善利用。

Description

具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2008年3月27日的美国临时申请61/039878的优先权，该申请以引用方式并入本文。
政府权利声明
本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。此外美国政府拥有本发明的权利，受美国能源部与美国国家可再生能源实验室即美国中西部研究所的分支机构签署的合同号DE-AC36-99GO10337的约束。
发明领域
本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，描述了具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属(Zymomonas)菌株的基因工程化。
发明背景
通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。期望微生物能够利用木糖作为碳源来生产乙醇以及其它有用的产物，因为木糖是水解木质纤维质材料中的主要戊糖，因此能提供丰富可用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌和其它乙醇细菌天然不利用木糖，可通过导入基因将它们遗传工程化以利用木糖，导入的基因编码1)木糖异构酶，该酶催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。
已经成功地对运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株进行了工程化以用于木糖代谢(US 5514583、US 5712133、US 6566107、WO95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)，并且对棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)菌株进行了工程化以用于木糖代谢(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。然而工程化的菌株通常在木糖上生长和生产乙醇不如在葡萄糖上一样好。工程化以利用木糖的菌株已经适应在木糖培养基上连续传代，导致菌株具有如美国专利7,223,575以及共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870所述的改善的木糖利用率。然而仍未确定该改善的遗传基础。
需要具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属的遗传工程化菌株和其它乙醇细菌。申请人已经发现了工程化以利用木糖并具有改善的木糖利用率的运动发酵单胞菌菌株的遗传改变，并且使用该发现以工程化具有改善的木糖利用率的菌株。
发明内容
本发明涉及遗传工程化以利用木糖的细菌菌株，该菌株用编码木糖异构酶的嵌合基因进行转化，所述基因表达自改善的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)。该菌株也用表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因进行转化。改善的Pgap引起比天然Pgap更高的表达，这引起与不具有用于表达木糖异构酶的改善的Pgap的菌株相比改善的木糖利用率。
本文所描述的是重组细菌菌株，该菌株选自包含通过转化被导入的基因的发酵单胞菌属和发酵细菌属(Zymobacter)，所述基因包含：
a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和
b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。
通过上述转化步骤导入的基因可以为嵌合基因，该嵌合基因包含用于提高Pgap表达的突变。
本文也描述了对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括用基因如嵌合基因进行转化，所述嵌合基因包含：
a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和
b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。
本文描述了对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的利用木糖的细菌菌株进行工程化的另一种方法，所述方法包括任何顺序的下述步骤：
a)用表达转醛醇酶和转酮醇酶的基因或操纵子进行转化；和
b)用表达木糖异构酶和木酮糖激酶的基因或操纵子进行转化，其中所述木糖异构酶表达自运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap。
本文也描述了从包含木糖的培养基中生产乙醇的方法，所述方法包括在培养基中培养选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的重组细菌菌株，所述菌株包含通过转化导入的嵌合基因，所述嵌合基因包含：
a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和
b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。
此外，本文所述的重组细菌菌株选自发酵单胞菌属和发酵细菌属，并且经工程化以表达木糖异构酶，表达水平为产生至少约0.1微摩尔产物/毫克蛋白/分钟，这通过使20μL细胞游离提取物在30℃下在反应混合物中反应而进行测定，所述混合物包含0.256mM NADH，50mM木糖，10mM MgSO4，10mM三乙醇胺，和1U/mL山梨醇脱氢酶，其中D-木酮糖是产物。
附图简述和序列描述
可通过下列发明详述、附图、以及结合作为本专利申请一部分的序列描述更全面地理解本发明的多个实施方案。
图1示出转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)、和木酮糖激酶(D)的酶检测分析方法。
图2是在用Pgapxy1AB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)的活性的示意图。
图3是在用Pgapxy1AB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的转醛醇酶(TAL)和转酮醇酶(TKT)的活性的示意图。
图4是选择的适合利用木糖菌落的％理论乙醇产量和％木糖利用率的示意图。
图5是适合利用木糖的菌株在具有5％葡萄糖(RMG)的RM(丰富培养基)中生长50代之前和之后，在具有5％木糖(RMX5％)的RM上生长70小时时的生长示意图。
图6示出以下质粒图谱：(A)pZB188；(B)pZB188/aadA；和(C)pZB188/aadA-GapXylA；以及(D)大肠杆菌木糖异构酶表达盒PgapXylA的示意图。
图7示出以下质粒的图谱：(A)pMODTM-2-<MCS>；(B)pMOD-连接子；和(C)pMOD-连接子-Spec。
图8示出质粒pLDHSp-9WW的图谱。
图9示出质粒pMOD-连接子-Spec-801GapXylA的图谱。
图10示出以下质粒的图谱：(A)pMOD-连接子-Spec-801GapXylA；(B)pZB188/aadA-GapXylA；和(C)pZB188/aadA-801GapXylA。
图11示出包含Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒(X1、X2和X2)的三个菌株和包含对照质粒(C1、C2和C3)的三个菌株在包含木糖的培养基中的生长曲线(OD600对时间)图。
图12示出ZW641、ZW658、X1和C1菌株在包含木糖的无奇放线菌素培养基中的生长曲线(OD600对时间)图，(A)为在线性比例上作的图，而(B)为在对数比例上作的图。
图13示出具有整合801Pgap-XylA(#8-2、#8-4、#8-5)的三个菌株和具有整合641Pgap-XylA(#6-1、#6-3、#6-5)的三个菌株与菌株ZW658进行比较的生长曲线(OD600对时间)图，(A)为在线性比例上作的图，而(B)为在对数比例上作的图。
表3是木糖异构酶HMM序列谱。表3以电子方式附上并以引用方式并入本文。
根据下面的发明详述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的发明详述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则))，并且符合World Intellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及Administrative Instructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。
SEQ ID NO：1是来自运动发酵单胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是来自运动发酵单胞菌的ZM4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是来自pZB4的ZmPgap的核苷酸序列，它也位于菌株ZW641和8XL4的PgapxylAB操纵子中。
SEQ ID NO：4是来自菌株ZW658的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是来自菌株8b的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是在Pgap的pZB4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是在Pgap的CP4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是在Pgap的CP4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是在Pgap的CP4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是在Pgap的ZM4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13和14是用于扩增包含来自pZB4的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15和16是用于扩增包含来自pZB4的tal编码区的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17和18是用于扩增包含来自Pgap和tal片段的Pgaptal的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19和20是用于扩增包含来自pZB 186的loxP::Cm的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是pMODPgaptaltktCm质粒的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：22和23是用于扩增在接纳pMODPgaptaltktCm的转化体中包含tal和tkt编码区的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是pMODPgapxylABCm质粒的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：25和26是用于扩增来自具有pMODPgapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合子的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27和28是用于扩增包含来自ZW641和ZW658的Pgap的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29-31是用于对来自ZW641和ZW658的Pgap进行测序的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32和33是用于扩增包含Specr-盒的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是木糖异构酶表达盒PgapXylA的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：35和36是用于替代pMOD2-<MCS>中的不同多克隆位点的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37和38是用于扩增来自菌株ZW801-4和ZW641的PgapxylA区域的引物的核苷酸序列，该序列用于插入pMOD-连接子-Spec以分别生成质粒pMOD-连接子-Spec-801GapXylA和pMOD-连接子-Spec-641GapXylA。
SEQ ID NO：39和40是用于扩增包含来自8XL4和8b的Pgap的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是用于对来自8XL4和8b的Pgap进行测序的引物的全长核苷酸序列。
表1
关于木糖异构酶的蛋白和编码区SEQ ID号汇总
Figure BPA00001231788800071
Figure BPA00001231788800081
1该编码序列是基于锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)编码序列设计的，以编码白色链霉菌(Streptomyces albus)蛋白(它与锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)蛋白有三个不同的氨基酸。
2该编码序列是基于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)编码序列设计的，以编码嗜热细菌(Thermus Caldophilus)蛋白(它与锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)蛋白有21个不同的氨基酸。
3该编码序列来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)并且翻译成水生栖热菌(Thermus aquaticus)蛋白，尽管水生栖热菌(Thermus aquaticus)编码序列由于密码子简并性可能具有差异。
表2
关于木糖利用率的基因和蛋白SEQ ID号汇总
Figure BPA00001231788800091
发明详述
本文所述的是利用木糖的重组细菌菌株，该菌株经遗传工程化以具有高表达的木糖异构酶，以及对细菌进行工程化以获得提高的木糖异构酶表达的方法。木糖异构酶的表达通过改善的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(ZmPgap)引导，该启动子具有至少一个使其成为较强启动子的突变。ZmPgap在-190位、-89位、或两个位置上都具有突变，所述位置是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子(CP4菌株ZmPgap：SEQ ID NO：1和ZM4菌株ZmPgap：SEQ ID NO：2)。本文所述的利用木糖的重组细菌菌株在包含木糖的培养基上具有改善的发酵。如本文所述进行工程化的产生乙醇或其它产品的细菌当在包含木糖的培养基上生长时，可用于提高产量。例如从乙醇细菌如发酵单胞菌属中可获取增加量的乙醇，该细菌如本文所述进行工程化，它可用作化石燃料的替代能源。
以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。
如本文所用，术语“包含”、“由...组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他性的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
“基因”指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5′非编码区)和之后的调节序列(3′非编码区)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。
术语“遗传构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白或功能RNA分子的核酸片段。在基因构建体中u基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。
如本文所用，术语“表达”指转录和衍生自基因的编码RNA(mRNA)或功能RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“超表达”指在转基因生物中产生的基因产物超出在正常生物或未转化生物中产生的基因产物的水平。“共抑制”指产生能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源性基因表达的正义RNA转录物或片段(美国专利5,231,020)。
如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。
术语“运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子”和“ZmPgap”指具有启动子活性的核酸分子，它具有天然存在于运动发酵单胞菌基因组中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码区上游的碱基序列。这些术语指运动发酵单胞菌菌株如CP4和ZM4菌株(分别是SEQ IDNO：1和2)的启动子以及引导表达的序列和/或长度上的变异体，如pZB4(SEQ ID NO：3)的ZmPgap，所述变异体引导的表达水平无显著不同。
术语“异源的”指不天然存在于受关注的位点。例如“异源基因”指不天然存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。例如存在于嵌合基因中的异源核酸分子是不与嵌合基因中的其它片段一起天然存在的核酸分子，如具有彼此不天然相关联存在的编码区和启动子片段的核酸分子。
如本文所用，“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)中有举例说明，尤其是其中的第11章和表11.1(将其全部内容以引用的方式并入本文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6×SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2×SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两种核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；并且最优选地，长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推测性地鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul，S.F.等人，J.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测性地鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或者30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定真菌蛋白的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“同源性”或“同源”本文互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的同源核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本发明核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。
如本领域所熟知的，术语“百分比同一性”是两种或更多种多肽序列之间或两种或更多种多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence  Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”，该方法相当于称为Clustal V(在Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgms，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM程序中。对于多重比对，默认值对应于缺口罚分(GAP PENALTY)＝10和缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中有所描述)和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(缺口罚分＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。可用的同一性百分比的实例包括但不限于：24％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％，或者从24％至100％的任何整数百分比可用于描述本发明，如25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR有限公司，Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，召开年份：1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；以及Ausubel，F.M.等人，In Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing和Wiley-Interscience公布于1987年。
改善的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的发现
运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ZmPgap或Pgap)的启动子已经被用于在运动发酵单胞菌和棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)中表达嵌合基因。当已经使用该启动子表达木糖代谢的基因时，所得木糖利用率通常仍未达到期望的水平。使经过工程化以表达四个木糖代谢酶(木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、和转醛醇酶)的具有有限的木糖利用能力的重组运动发酵单胞菌菌株进一步适应木糖培养基，以获得改善的木糖利用率(描述于共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870)。
如本文实施例3所述，申请人已经发现称为ZW658(ATCC#PTA-7858)的改善的木糖利用率的菌株具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶表达，所述酶作为操纵子被整合进基因组中，从ZmPgap(PgapxylAB操纵子)开始表达。申请人已经进一步发现在PgapxylAB操纵子的启动子中有单个的新核苷酸改变，它负责引导可操作地连接的编码区的表达增加的启动子。与ZW658前体菌株中的PgapxylAB操纵子的ZmPgap序列相比，该核苷酸改变是相对于菌株ZW658的PgapxylAB操纵子的Pgap序列的新改变，所述前体菌株不具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶活性。因此具有该单个核苷酸改变的Pgap是改善的启动子。
此外，申请人已经发现运动发酵单胞菌菌株经个别工程化具有编码四个木糖利用酶的基因并且分别经改造以具有改善的木糖利用率(菌株8b，描述于美国专利7,223,575)，该菌株也具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶表达，所述酶作为PgapxylAB操纵子被整合进基因组中。申请人已经进一步发现在8b菌株的PgapxylAB操纵子的Pgap中有单个的新核苷酸改变，所述改变位于与ZW658Pgap的核苷酸改变不同的位置。基于由PgapxylAB操纵子编码的木糖异构酶和木酮糖激酶的表达提高，PgapxylAB操纵子的突变型Pgap也提供改善的启动子。
在ZW658的Pgap和8b菌株PgapxylAB操纵子中鉴定的新核苷酸改变分别在-190位和-89位，其相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶天然ATG翻译起始密码子。发现的核苷酸改变在-190位是从G变成T，在-89位是从C变成T。
碱基改变的序列上下游区域是重要的因素，因为位置编号可由于序列变异而改变。
-190位在以下序列中：AACGGTATACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGATGTTTTT，该序列是CP4、ZM4、和pZB4的ZmPgap的一部分，分别对应于SEQID NO：1、2、和3，其中粗体并且用下划线标示的是G突变成T的碱基。-190位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-189位在pZB4中，因为在pZB4的启动子序列中的-21位上缺失了T。
-89位在以下序列中：CGGCATCACGAACAAGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTCGGC，该序列是CP4、ZM4、和pZB4的ZmPgap的一部分，分别对应于SEQID NO：1、2、和3，其中粗体并且用下划线标示的是C突变成T的碱基。-89位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-88位在pZB4中，因为在pZB4的启动子序列中的-21位上缺失了T。本发明的启动子在ZmPgap中的-190位、-89位、或者这两个位置上都具有核苷酸改变。优选地，改变是在-190位上从G变成T，并且在-89位上从C变成T。包含这些突变的本发明启动子是改善的Pgap。
在-190和-89位的其它核苷酸改变可提供活性改善的ZmPgap。此外，在ZmPgap中其它位置的核苷酸改变可提供活性改善的ZmPgap。
ZmPgap的天然发生的序列不是单独序列，但是序列中可具有一些变异，所述变异对启动子功能无显著影响。对启动子功能无显著效应意味着该启动子序列引导的表达水平基本上类似于存在于天然运动发酵单胞菌菌株中的ZmPgap引导的表达水平。序列变异可天然发生在不同分离物或运动发酵单胞菌菌株之间，如CP4和ZM4菌株之间在相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(分别是SEQ ID NO：1和2)的天然ATG翻译起始密码子的-29位上的差异，其中在CP4中有A，而在ZM4中有G。
除天然存在的序列变异外，不显著影响功能的核苷酸改变还可在常规操纵程序期间发生，包括PCR、克隆、转化、以及菌株生长，这是本领域技术人员已知的。一个实例是pZB4的ZmPgap，它在-21位置上缺失T。
发生在不同天然或工程化菌株中的ZmPgap序列中的、不显著影响启动子功能的任何核苷酸改变可存在于运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子序列中，例如在pZB4(SEQ ID NO：3)的ZmPgap中的-21位置后缺失T。因此确实影响启动子功能，即，显著改善启动子功能的、在上述-190和-89位置上的突变可在任何具有基本上类似的活性(天然水平)的ZmPgap序列中发生，并且可与不影响功能的突变共发生。
具有在-190和/或-89位置上的所述突变的改善的Pgap序列的实例包括来自菌株ZW658(SEQ ID NO：4)、菌株8b(SEQ ID NO：5)、和来自pZB4(SEQ ID NO：6)的双重突变的相同ZmPgap变异体的启动子序列。改善的Pgap序列的附加实例是-190、-89或在来自CP4的ZmPgap变异体中的双重突变(分别是SEQ ID NO：7、8、和9)以及-190、-89或在来自ZM4的ZmPgap变异体中的双重突变(分别是SEQ IDNO：10、11、和12)。
此外在ZmPgap序列中发生的变异基本上不影响启动子功能。本发明包括改善的Pgap，它在-190位和/或-90位(相对于运动发酵单胞菌CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子)具有所述的突变，所述位置在添加-190和/或-89突变之前无显著活性改变的不同长度ZmPgap中。
制备改善的Pgap
可通过本领域技术人员已知的任何方法将-190和/或-89位置上的所述突变导入到ZmPgap核酸分子中。例如可合成具有突变和围绕DNA序列的寡核苷酸并将其克隆到较大的启动子DNA片段中以取代无突变的片段。可合成包含该突变和一些邻近启动子序列的引物并用于PCR中以制备启动子片段。可合成全长启动子DNA片段使之成为连接到一起的多个寡核苷酸。可使用定点诱变导入突变。此外可使用来自ZW658或8b菌株的DNA作模板制备突变启动子，作为PCR扩增的DNA片段。
使用改善的Pgap来表达木糖异构酶
可将本文所述的启动子可操作地连接至编码木糖异构酶的异源核酸分子以引导木糖异构酶与ZmPgap引导的表达相比提高的表达。改善的Pgap和木糖异构酶编码区构成嵌合基因，该基因也一般包括3’终止控制区。终止控制区可来源于不同基因，并且常来自靶宿主细胞天然具有的基因。嵌合基因构建体是本领域熟知的。
可在嵌合基因中使用任何木糖异构酶编码区以从本发明的改善Pgap开始表达木糖异构酶。木糖异构酶属于EC5.3.1.5。适用的木糖异构酶蛋白和可用的编码序列的实例在表1中给出。尤其适用的实例是那些来自大肠杆菌(分别是SEQ ID NO：42和43)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(分别是SEQ ID NO：44和45)的木糖异构酶。
木糖异构酶蛋白和编码序列的许多其它实例在文献和本领域技术人员熟知的生物信息数据库中被确认。此外本文所述的或编码序列或那些本领域引用的编码序列可用于鉴定自然界中的其它同源物。例如每个本文所述的编码核酸片段的木糖异构酶可用于分离编码来自相同或其它微生物物种的同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。
序列依赖性规程的实例包括但不限于：1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法例证[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和互补筛选方法。
例如，编码与本文所述的木糖异构酶编码区类似的蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基序列可通过使用所有或部分本发明的核酸片段作为DNA杂交探针，使用本领域的技术人员熟知的方法来筛选来自任何所需细菌的文库而得以直接分离。基于公开的核酸序列的特异性，寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针以在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于期望的检测条件，应当设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)第33-50页，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，Methods in Mol ecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)第15卷，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将所述序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自所述核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
作为另一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如技术人员可按照RACE规程(Frohman等人，PNAS USA 85：8998(1988))通过PCR生成cDNA以扩增转录物中的单个点和3′或5′末端之间的区域拷贝。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE系统(例如BRL，Gaithersburg，MD)，可分离特定3′或5′cDNA片段(Ohara等人，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等人，Science 243：217(1989))。
作为另外一种选择，可使用这些编码序列的木糖异构酶作为杂交试剂用于鉴定同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基不与适当的互补碱基配对。
杂交方法是有严格规定的并且是本领域已知的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在适当浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂允许短寡核苷酸探针在室温下的敏感和严格杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。通常，离液剂的终浓度将为约3M。如果需要，可以将甲酰胺加入到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。通常的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％的去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
生物信息学方法
作为另外一种选择，因为木糖异构酶蛋白是如此熟知的和丰富的，可基于催化位点残基和序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden Markov Model，HMM)来鉴定附加的木糖异构酶蛋白，所述序型隐马尔可夫模型是使用Pfam(Pfam：clans，web tools and services：R.D.Finn，J.Mistry，B.Schuster-
Figure BPA00001231788800231
S.Griffiths-Jones，V.Hollich，T.Lassmann，S.Moxon，M.Marshall，A.Khanna，R.Durbin，S.R.Eddy，E.L.L.Sonnhammer和A.Bateman，Nucleic Acids Research(2006)Database Issue 34：D247-D251)木糖异构酶蛋白的鉴定的家族构建起来的。
使用HMMER软件包(Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA)的hmmsearch算法制备序型HMM。序型HMM的理论基础描述于Durbin等人((1998)Biologicai sequence analysis：probabilistic models  of proteins and nucleic acids，Cambridge University Press)和Krogh等人((1994)J.Mol.Biol.235：1501-1531)，它基于比对该组蛋白每个位置上出现的每个氨基酸的概率来表征一组蛋白。
使用具有BRENDA数据库提到的、通过实验证实的功能的32个木糖异构酶蛋白序列制备的木糖异构酶序型HMM提供了鉴定木糖异构酶的基础。BRENDA人工设计的数据库，它包含关于酶动力学、物理、和生物化学性质的详细信息，这些信息得自实验文献并且与相关数据库链接(Cologne University BioInformatics Center)。这32个蛋白的SEQ ID NO在表1中给出。使用这32个蛋白序列，用ClustalW的默认参数建立了多序列比对(MSA)。使用MSA结果作为数据输入制备表3中给出的序型HMM。在该表中用单字母代码表示氨基酸。每个位置的首行报告了匹配发散评分：每个氨基酸处于该状态的概率(突出显示最高的评分)。第二行报告了插入发散评分，第三行报告了状态转移评分：M→M，M→I，M→D；I→M，I→I；D→M，D→D；B→M；M→E。
除了序型HMM外，木糖异构酶的特征是有四个催化位点的氨基酸：组氨酸54、天冬氨酸57、谷氨酸181、和赖氨酸183，其位置编号是参照白色链霉菌(Streptomyces albus)木糖异构酶序列。符合具有Evalue＜或＝3×10-10的木糖异构酶序型HMM并具有这四个催化位点残基的任何蛋白是木糖异构酶，可如本文所述将其编码区构建到包含改善的Pgap的嵌合基因中并转化到细菌菌株中。当前，在减少到90％的无冗余水平的GenBank序列数据库中的251个蛋白符合这些标准。本文将不以SEQ ID NO提供全部这些序列，因为它们能被本领域的技术人员容易地鉴定。也可如本文所述使用符合这些可用标准的附加序列。
本领域已知的是由于遗传密码的简并性，在编码氨基酸序列的DNA序列中可存在变异。密码子可以被最优化以用于表达靶宿主细胞中的氨基酸序列，从而提供最佳的编码的表达。
用于木糖异构酶表达的工程化细菌细胞
本文所述的嵌合基因通常在载体中构建或者转移到载体中以进行进一步的操纵。载体为人们所熟知。某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。pRK404和三个相关载体：pRK437、pRK442、和pRK442(H)的完全注解序列是可用的。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid 50(1)：74-79(2003))。
可在不同靶宿主细胞中使用其它熟知的载体。用于不同宿主的载体实例描述于共有的和共同未决的美国专利申请公布US20070092957A1，pp11-13中，该文献以引用方式并入本文。尤其可用于在发酵单胞菌属中表达的载体能够在大肠杆菌和发酵单胞菌属中复制，如pZB188，它在美国专利5,514,583中进行了描述。载体可包括用于在细胞中自主复制的质粒，以及用于运送构建体以将其整合进细菌基因组中的质粒。用于DNA整合的质粒可包括转座子、与靶细菌基因组同源的核酸序列区域、或者参与整合的其它序列。一种其它类型的载体可为使用例如可从
Figure BPA00001231788800251
商购获得的系统生产的转座体。如何选择合适的载体用于期望的靶宿主和期望的功能是熟知的。
可通过熟知的方法(如使用冻融转化、钙介导转化、电穿孔、或接合)导入载体以工程化细菌细胞，所述载体具有包含改善的Pgap和可操作地连接木糖异构酶编码区的嵌合基因。通过表达木糖异构酶进行工程化以利用木糖的任何细菌细胞是用于转化以工程化本文所述菌株的靶宿主细胞。尤其适用的宿主细胞是发酵单胞菌属和发酵细菌属。导入的嵌合基因可在稳定复制质粒上被保持在细胞中，或者在导入后被整合进基因组中。
就工程化在细菌细胞基因组中具有整合的改善Pgap-木糖异构酶嵌合基因的菌株而言，可使用本领域所熟知的方法如同源重组、转座子插入、或转座体插入。在同源重组中，DNA序列侧接靶整合位点，将该序列定位在邻接抗奇放线菌素基因或其它选择性标记，并且改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因引导选择性标记和改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因插入靶基因组位点。此外，选择性标记可通过位点特异性重组位点进行结合，以便在对应的位点特异性重组酶表达之后，将所述抗性基因从基因组中切除。尤其适用于改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因整合的是在体外转座体系中使用
Figure BPA00001231788800252
EZ::Tn的转座，它在实施例1和6中使用。
木糖异构酶活性
在本文所述的菌株中，木糖异构酶活性水平比前文所述的本领域木糖异构酶活性水平更高。这些菌株被工程化以表达木糖异构酶，其表达水平产生至少约0.1微摩尔产物/毫克蛋白/分钟，这通过使20μL细胞游离提取物在30℃下在反应混合物中反应而进行测定，所述反应混合物包含0.256mM NADH，50mM木糖，10mM MgSO4，10mM三乙醇胺，和1U/mL的山梨醇脱氢酶，其中D-木酮糖是所述产物。菌株可表达木糖异构酶，其表达水平产生至少约0.14、0.2、或0.25微摩尔产物/毫克蛋白/分钟。具有本文所述的改善的Pgap的高表达启动子可用于表达木糖异构酶编码区以获得这些酶活性水平。在存在下文所述的三种附加木糖代谢途径酶活性情况下的高木糖异构酶活性水平提供在包含木糖培养基上具有改善的生长的菌株。
完全木糖利用途径的工程化
除了用包含改善的Pgap和木糖异构酶编码区的嵌合基因进行转化外，细菌菌株还予以工程化以表达木糖利用所需的三种其它酶：木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶，如在以下文献中所述：美国专利5514583、美国专利5712133、美国专利6566107、WO 95/28476，Feldmann等人((1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361)，Zhang等人((1995)Science 267：240-243))，和Yanase等人((2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。
已知存在编码所有四种酶的基因以完善木糖利用途径，产生木糖利用菌株。附加的三种酶可从单个嵌合基因或从包括一种以上的编码区的操纵子开始表达。
嵌合基因可如上文所述通过可操作地连接木糖异构酶嵌合基因的启动子、编码区、和3’终止控制区进行构建。选择在靶宿主细胞中有活性的启动子，这是本领域熟知的。可用于发酵单胞菌属和发酵细菌属的启动子包括ZmPgap和发酵单胞菌属烯醇酶基因的启动子。木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的编码区可来自能够利用木糖的任何革兰氏阴性菌，例如黄单胞菌属、克雷白氏杆菌属、埃希氏菌属、红细菌属、黄杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、根瘤菌属、农杆菌属、沙门氏菌属、和假单胞菌属。可使用的蛋白序列及其编码区序列的实例在表2中给出。优选的是编码来自大肠杆菌的木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的序列(分别是SEQ ID NO：107、119、和131)。也可使用这些序列鉴定附加的编码序列，如上所述用于木糖异构酶，它可用于表达完整的木糖利用途径。
此外，生物信息学方法，包括如上所述用于木糖异构酶的Pfam蛋白家族和序型HMM，可用于鉴定木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶。也如上所述，由于密码子简并性，编码这些酶的序列可具有多样性，并且可进行密码子优化以在特定宿主中表达。
可构建操纵子以表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶。一种或多种编码序列可与从改善的Pgap开始表达的木糖异构酶编码区可操作地连接，形成操纵子。如本文实施例1所述，木糖异构酶和木酮糖激酶通常在一个操纵子中表达，并且转醛醇酶和转酮醇酶在第二操纵子中表达。
这些酶可从位于稳定复制的质粒上的、或整合进基因组中的嵌合基因或操纵子开始表达。
具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因的细菌菌株的改善的生长
本文所述的具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因的木糖利用细菌菌株，例如运动发酵单胞菌菌株，在存在或不存在其它糖(“混合糖”)的含木糖培养基中显示改善的生长。混合糖包括至少一种除木糖之外的糖。可包括可为细胞代谢提供能源的任何糖，或者存在于含木糖混合物中的任何糖。希望本发明的菌株在从糖化生物质中制备的糖上生长。通常生物质进行过预处理，例如如专利申请WO2004/081185以及共有的和共同未决的US专利申请60/670437所述进行预处理，然后用糖化酶进行处理，参见Lynd，L.R.，等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)。生物质糖化可生产糖，所述糖通常可包括木糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、和/或阿拉伯糖的混合物。
为了最大化产量和发酵效率，期望在包含高含量糖(包括木糖)的培养基中生长本文所述的菌株。这允许直接使用生物质糖化糖，或者使用其低倍稀释液，从而减少发酵体积，这是商业规模的乙醇生产所期望的。使用高糖浓度以便可制备较高浓度的产品如乙醇。在发酵培养基中的混合糖浓度通常介于约120g/L和至多约300g/L之间，更典型地介于约150g/L和约235g/L之间。
在商业生产例如乙醇所期望的高浓度混合糖条件下，可在发酵培养基中包括山梨醇。如共有的和共同未决的US专利申请公布#20080286870所述，山梨醇(D-山梨醇和/或L-山梨醇)可存在于培养基中，其浓度介于约2mM和200mM之间，通常介于约2mM和100mM之间，或者介于5mM和20mM之间。甘露糖醇、半乳糖醇或核糖醇可在培养基中代替山梨醇，或者与山梨醇组合使用，如共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080081358所述。
在木糖醇培养基的发酵条件下，具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因的本文所述菌株比从ZmPgap开始表达的木糖异构酶菌株具有改善的生长。确切的改善将取决于菌株背景、使用的培养基、和一般生长条件而不同。如本文实施例8中的图13A所示，例如当在包含50g/L木糖的培养基中生长时，在一小时后具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因的菌株生长的OD600比无改善的Pgap的菌株高约两倍至五倍。
改善的利用木糖的菌株的发酵
具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因和用于表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因或操纵子的工程化的利用木糖的菌株可用于发酵中，以生产产物，该产物是所述菌株的天然产物，或者所述菌株经工程化生产的产物。例如运动发酵单胞菌和棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)是天然的乙醇细菌。例如描述了通过本发明的运动发酵单胞菌菌株生产乙醇。
为了生产乙醇，重组的利用木糖的运动发酵单胞菌具有改善的Pgap-木糖异构酶嵌合基因，该菌株与包含混合糖(包括木糖)的培养基接触。当混合糖浓度高至抑制生长时，该培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物。半乳糖醇或核糖醇可用山梨醇或甘露糖醇取代或与它们组合使用。运动发酵单胞菌在培养基中培养，其中进行发酵并且产生乙醇。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至少约24小时，并且可以运行30小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵运行温度可在介于约30℃和约37℃之间的范围内，发酵pH可在约4.5至约7.5的范围内。
可以在实验室规模的发酵罐中和按比例增加的发酵中(其中生产了商业规模量的乙醇)，在包含包括木糖在内的混合糖的培养基中培养本发明的运动发酵单胞菌。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例如从本发明的运动发酵单胞菌菌株中的大规模生产可以通过分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，不向系统中添加任何物质允许发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生产。在其它系统中可以获得稳定或指数后期生产。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。分批补料培养方法也适用于本发明的运动发酵单胞菌菌株的培养，并且该方法包括典型的分批系统，除了一点不同：底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素(例如pH以及废气例如CO2的分压)进行评估。分批和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。
乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量的处理过的培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞丧失必须相对于培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度达到最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock同上所述。
尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。期望的本发明的运动发酵单胞菌菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为30℃至约37℃，在回旋振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含相似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长至OD600介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化以用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源如酵母提取物或大豆产物(0-10g/l)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一种附加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/l)耗尽时将混合糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。使用苛性碱溶液(如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制在pH 5.0-6.0。将发酵罐的温度控制在30℃-35℃。为了最小化泡沫，按需将消泡剂(任何种类--硅氧烷基的、有机物基的等)加入到罐中。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。
上述任何一组条件，以及在这些本领域熟知的条件中的其它变化是通过木糖利用性重组发酵单胞菌属菌株生产乙醇的合适条件。
实施例
实施例示出了本文所述的发明。
一般方法
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
缩写的含义如下：“kb”指千碱基，“bp”指碱基对，“nt”指核苷酸，“hr”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒钟，“d”指天，“L”指升，“mL”指毫升，“μL”指微升，“μg”指微克，“ng”指纳克，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔，“nm”指纳米，“μmol”指微摩尔，“pmol”指皮摩尔，“Cm”指氯霉素，“Cmr”指氯霉素抗性，“Cms”指氯霉素敏感，“Spr”指奇放线菌素抗性，“Sps”指奇放线菌素敏感，“XI”为木糖异构酶，“XK”为木酮糖激酶，“TAL”为转醛醇酶，“TKT”为转酮醇酶，“EFT”指流逝的发酵时间，“RM”指包含10g/L酵母提取物加2g/L KH2PO4的丰富培养基，“MM”指包含10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4和0.2g/L KH2PO4的配合培养基。
制备发酵单胞菌属的细胞游离提取物用于酶分析法
细胞在50mL RM+2％葡萄糖中，在30℃下过夜生长至OD600为1.0-1.2。在4℃、4500rpm下离心10分钟收获细胞。弃去上清液，用25mL冰冻超声波降解缓冲液(10mM Tris，pH7.6，10mM MgCl2)洗涤细胞沉淀物，随后在4500rpm离心10分钟。将沉淀物重悬在2.0-2.5mL超声波降解缓冲液加1mM二硫苏糖醇的溶液中。将500μL等分试样在4℃下，在eppendorf离心机中离心1分钟。弃去大多数上清液，留下约10-20μL以防止沉淀物变干。冷冻细胞并贮存在约80℃下直至进行分析。在分析前，解冻细胞并用500μL的超声波降解缓冲液加1mM二硫苏糖醇的重悬。以62％的占空比超声处理混合物2x 45秒，使用Branson超声波细胞破碎仪450输出对照2，使样本在两次超声波降解之间冷却约3-5分钟。样本在Beckman离心机中，在4℃、14,000rpm下离心60分钟。将上清液转移到新管中并保存在4℃。使用Pierce BCA检测分析法测定蛋白浓度。
转酮醇酶(TKT)测定通常首先进行，因为该酶比其它酶更不稳定。TKT测定的图表如图1A中所示。
在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.37mM NADP，50mM TrisHCl pH7.5，8.4mM MgCl2，0.1mM TPP((焦磷酸硫胺素)，0.6mM E4P(4-磷酸赤藓糖)，4mM BHP(β-羟基丙酮酸盐)，4U/mL PGI(磷酸葡糖异构酶)，和4U/mL G6PD(6-磷酸葡萄糖脱氢酶)。在平板阅读器上读数A3403-5分钟。如下计算TKT活性：
1单位对应于形成1微摩尔D-果糖6-磷酸/min，温度为30℃。
U(μm0l/min)＝斜率(dA340/min)×反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADP→NADPH的摩尔数是6220A340/摩尔/L，在1cm比色杯中)
(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)
比活性(μmol/min-mg)＝μmol/min/蛋白浓度(mg)
转醛醇酶(TAL)测定的基础如图1B所示。在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.38mM NADH，87mM三乙醇胺，17mMEDTA，33mM F6P(果糖-6-磷酸盐)，1.2mM E4P(4-磷酸赤藓糖)，2.0U/mL GDH(甘油3-磷酸脱氢酶)，和20U/mL TPI(磷酸丙糖异构酶)。将平板培养5分钟，然后读数A3403-5分钟。如下计算TAL活性：1单位对应于形成1微摩尔D-甘油醛每分钟，温度为30℃。
U(μm0l/min)＝斜率(dA340/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NAD的摩尔数是6220A340/摩尔/L，在1cm比色杯中)
(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)
比活性(μmol/min-mg)＝μmol/min/蛋白
木糖异构酶(XI)测定的基础如图1C所示。在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.256mM NADH，50mM木糖，10mMMgSO4，10mM三乙醇胺，和1U/mL SDH(山梨醇脱氢酶)。在平板阅读器上读数A3403-5分钟。如下计算XI活性：
1单位XI对应于形成1微摩尔D-木酮糖每分钟，温度为30℃。
U(μmol/min)＝斜率(dA340/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADHP→NAD的摩尔数是6220A340/摩尔/L，在1cm比色杯中)
(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)
比活性(μmol/min-mg)＝μmol/min/蛋白浓度(mg)
木酮糖激酶(XK)测定的基础如图1D所示。
在微板测定中，在30℃下将20μL细胞游离提取物每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.2mM NADH，50mM Tris HCl pH7.5，2.0mM MgCl2-6H2O，2.0M ATP，0.2M PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，8.5mM D-木酮糖，5U/mL PK(丙酮酸激酶)，和5U/mL LDH(乳酸脱氢酶)。在平板阅读器上读数A3403-5分钟。如下计算XI活性：1单位对应于形成1微摩尔D-木酮糖至D-5-磷酸木酮糖每分钟，温度为30℃。
U(μmol/min)＝斜率(dA340/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NAD的摩尔数是6220A340/摩尔/L，在1cm比色杯中)
(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)
比活性(μmol/min-mg)＝μmol/min/蛋白浓度(mg)
HPLC方法
用Agilent 1100系列HPLC和LC 3D的Agilent ChemStation软件进行分析。柱子为BioRad Aminex HPX-87H(HPLC Organic Analysis Column 125-0140)，具有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125-0129)。操作条件为：
流量        0.6mL/min
溶剂        0.01N H2SO4
终止时间    25min
注射体积    5μL
自动取样机  温度控制：在10℃或4℃下
柱温        55℃
检测器      折射指数(40℃)
            具有外标标准校准曲线
实施例1
构建木糖发酵的运动发酵单胞菌菌株
如共有的和共同未决的美国专利公布US20080286870所述，木糖发酵性运动发酵单胞菌菌株经由连续转座事件将两个操纵子，PgapxylAB和Pgaptaltkt整合进ZW1(ATCC#31821)的基因组中进行构建，随后在包含木糖的选择性培养基上使该菌株适应，它包含四个木糖利用性基因，编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶。先前构建了称为8b的木糖发酵性运动发酵单胞菌菌株，如美国专利申请公布20030162271所述，经由组合使用同源重组和转座方法将两个操纵子PgapxylAxylB和Penotaltkt与选择性抗生素标记一起整合进运动发酵单胞菌5C的基因组中进行构建，随后进行适应和NTG诱变。在制备新菌株的过程中，使用与位点特异性同源重组相反的转座(Epicentre’s EZ::Tn体外转座系统)，因为该方法具有提供多个可选择整合位点和相对高的插入频率的优点。将编码木糖利用性酶的四个基因排列并克隆成两个分开的操纵子：用于整合的PgapxylAB和Pgaptaltkt。将一个抗生素抗性标记、一个侧接两个P1噬菌体Cre-重组酶识别序列(loxP)的氯霉素抗性(Cmr基因)连接到每个操纵子上用于选择整合子。用一个两步的连续方法完成两个操纵子的整合：Pgaptaltkt，然后是PgapxylAB。在两个整合事件中使用Cm抗性选择，因为它通过在质粒上表达Cre重组酶，随后在每次整合后消除质粒而被移除。该方法允许使用相同抗生素标记进行多次选择。更重要的是，它允许移除导入的抗生素标记以选择整合的操纵子。该方法消除了抗生素抗性基因对商用发酵菌株的负面影响。
构建pMODPgaptaltktCm用于转座
如美国专利申请公布20030162271(实施例9)所述，包含来自大肠杆菌的转酮醇酶(tkt)编码区的2.2kb DNA片段从pUCtaltkt(美国专利申请公布20030162271)中通过BglII/XbaI消化进行分离并被克隆到用BamHI/XbaI消化的pMOD(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)载体中，产生pMODtkt。称为Pgaptal的PCR片段通过如下所述将运动发酵单胞菌gap(Pgap；甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的启动子区域熔合到大肠杆菌转醛醇酶(tal)的编码区上生成。从pZB4扩增Pgap片段，该片段的构建如美国专利5514583(实施例3)所述，使用具有SEQ ID NO：13和14的引物。pZB4包含Pgap-xylA/xylB操纵子和Peno-tal/tkt操纵子。从pZB4中扩增tal编码区片段，使用具有SEQ IDNO：15和16的引物。Pgaptal片段使用Pgap和tal片段作模板，用具有SEQ ID NO：17和18的引物进行扩增。该片段用XbaI消化并克隆到质粒pMODtkt，tkt编码区的上游中。loxP::Cm片段通过PCR，使用Cmlox(F，sfi)和Cmlox(R，sfi)引物(SEQ ID NO：19和20)以及pZB 186作模板生成。pZB 186是天然运动发酵单胞菌质粒和pACYC184的组合，描述于US514583(实施例3)和Zhang等人((1995)Science267：240-243)。最后，将loxP::Cm PCR片段插入到包含Pgaptaltkt的质粒的SfiI位点以形成整合质粒pMODPgaptaltktCm。在该质粒中，将Pgaptaltkt loxP::Cm片段插入到pMOD载体中的两个嵌合末端(转座酶结合位点)之间。SEQ ID NO：21是pMODPgaptaltktCm质粒的全长核苷酸序列。
转座和转化ZW 1中的pMODPgaptaltktCm
质粒pMOD是基于pUC的载体，因此在发酵单胞菌属中是非复制载体。质粒pMODPgaptaltktCm在室温下，在存在Mg2+的情况下用转座酶处理一小时，并用于转化ZW1细胞，转化通过电穿孔(使用BioRadGene Pulser，设为200Ω，25μF和16kV/cm)进行。电穿孔细胞在30℃下，在配合培养基(MM)中培养6小时，该培养基包含10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L K2HPO4)，补充了50g/L葡萄糖和1mM MgSO4。将转化混合物置于琼脂板上，该琼脂板包含在MM中的15g/L Bacto琼脂，补充了50g/L葡萄糖和120μg/mL氯霉素，并且在30℃下厌氧培养。转化体在约2天后可见。转化/转座频率为约3×101/μg DNA。
获得了总计39个Cmr转化体菌落。挑取了二十一个菌落并通过PCR和酶活性检测分析法进行进一步分析。使用引物SEQ ID NO：22和23的PCR证实存在3kb DNA片段，该片段在转化体中包含tal和tkt编码区。用来自21个整合子菌落的质粒DNA回转化不生成在大肠杆菌中的回转化体，这说明tal和tkt被整合进ZW1的基因组中。使用改进用于微板的规程(一般方法)测试这些整合子的转醛醇酶和转酮醇酶活性。使用Pierce BCA蛋白检测分析法测定蛋白浓度。转化体在30℃下，在50mL锥形离心管中的RM培养基上生长，该培养基包含2％(w/v)的葡萄糖，补充了120μg/mL的氯霉素)。对照菌株8b和ZW1也生长(RM加2％的葡萄糖用于ZW1)用于酶分析法。当OD600达到1.0时收获细胞。洗涤细胞一次并重悬在超声波降解缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.6和10mM MgCl2)中。酶分析法如美国专利申请公布20030162271所述进行。单位为μmol/min-mg。除一个样本外，所有样本具有转醛醇酶和转酮醇酶活性。
选择的整合子的基因组和质粒DNA用PstI消化，使用tkt探针进行DNA杂交。ZW1DNA不与tkt探针杂交。在所有整合子基因组样本中均有1.5kb的条带是可见的，它是期望的DNA片段，位于tkt中的PstI位点和tal中的PstI位点之间。第二个可见的高分子量(6kb或者更大)条带是唯一的，位于独立品系T2、T3、T4和T5之间，指示每个品系中的个别基因组整合位点。令人感兴趣的是，与tkt探针杂交的T5的质粒和基因组DNA指示Pgaptaltkt也可能在天然质粒上整合到T5中。选择这四个菌株(T2、T3、T4和T5)进行进一步的Cre处理以除去Cmr标记。
Cre处理以从taltkt整合子中除去Cm r 标记
为了从染色体中除去Cmr标记，用pZB 188/Spec-Cre转化T2、T3、T4和T5。该质粒是发酵单胞菌属-大肠杆菌穿梭载体pZB188[Zhang等人(1995)Science 267：240-243；US 5514583]的衍生物，它包含Cre重组酶的表达盒。pZB188/Spec-Cre与Cre表达载体相同，该载体在实施例10中描述(pZB 188/Kan-Cre)，不同的是它具有抗奇放线菌素基因，而不是抗卡那霉素基因。在补充了2％葡萄糖和200μg/mL奇放线菌素)的MM琼脂板上选择转化体。挑取Spr抗性菌落置于补充了2％葡萄糖和200μg/mL奇放线菌素的RM琼脂板上和补充了2％葡萄糖和120μg/mL Cm的RM琼脂板上。百分之百的挑取菌落是Cm，指示Cre高效切除Cmr。SprCms转化体在37℃下在加有2％葡萄糖的RM中培养2至5天，每日转移以消除pZB188aadACreF。在每次转移过程中，稀释细胞并置于加有2％葡萄糖的RM琼脂板上，用于挑取到具有或不具有200μg/mL Sp的相同培养基的附加平板上。通过PCR分析Sps菌落以确认消除了pZB188aadACreF。将整合子的消除质粒的后代称为T2C、T3C、T4C和T5C。为了检查这些转座整合子是否稳定，这4个菌株在加有2％葡萄糖的RM中生长，然后转移到10mL相同培养基中并在37℃下在双重测试管中生长。每日转移细胞，持续十天，或者大约100代。稀释菌落并将其置于RMG平板上用于第1次和第10次转移后的菌落分离。来自每个测试菌株的每次转移的十二个菌落对存在的Pgaptaltkt显阳性，测试通过菌落PCR，使用5’Pgap和3’tkt引物(SEQ ID NO；13和23)。也测量在第1次转移和第10次转移后的分离转醛醇酶和转酮醇酶的活性(如一般方法所述)。在100代后，所有4个整合子在非选择性培养基上具有相似水平的TAL和TKT活性，说明这些整合子是遗传稳定的。
构建pMODPgapxylABCm用于转座
下一步骤是进一步将PgapxylAB loxP::Cm操纵子整合进ZW1::Pgaptaltkt整合子中(T2C、T3C、T4C和T5C)。整合质粒pMODPgapxylABCm基于质粒pMODPgaptaltktCm(上文所述)构建。Pgaptaltkt DNA片段通过SacI/SfiI消化除去。将一个包含SacI、NotI、和SfiI限制性位点的衔接子片段通过连接导入。然后将分离自pZB4(US 5514583)的PgapxylAB的NotI片段克隆进衔接子的NotI位点。木糖异构酶(XI)由xylA编码，而木酮糖激酶(XK)由xylB编码。SEQ ID NO：24是pMODPgapxylABCm质粒的全长核苷酸序列。
转座和转化T2C、T3C、T4C和T5C中的pMODPgapxylABCm
使用相似方法整合PgaptaltktCm，用pMODPgapxylABCm(如上所述)经转座酶处理以转化/转座T2C、T3C、T4C和T5C。在Cm选择后的2个转化/转座实验后获取六个整合子(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、T5CCmX2)。通过PCR确认所有转座子存在xylAB，所述PCR使用两组引物：SEQ ID NO：25和26，以及SEQ ID NO：15和16，不同的是T2CcmX1和T2CcmX6使用引物SEQ ID NO：25和26进行检测，它们无PCR片段。
检测包括2个PCR阴性品系的整合子的XI、XK、TAL和TKT活性(一般方法)。如图2和3所示的结果指示六个xylAB整合子T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、和T5CCmX2都具有XI、XK、TAL和TKT活性。与阴性亲本对照相比，XI和XK活性是新获得的(图2)。TAL和TKT活性保持与亲本对照一致。所有结果指示制备了蛋白并且具有功能。酶活性水平不同，并且TI和XK活性类似于用相同质粒转化/转座的ZW1整合子的那些活性。XI、XK、TAL和TKT的活性水平低于菌株8b中的那些活性水平。
xylAB操纵子的整合通过DNA杂交确认。6个品系的基因组和质粒DNA用SphI消化并与地高辛标记的xylB探针杂交。共有的条带约3kb，它从xylB的SphI位点和在pMOD载体上的邻近克隆位点上的另一个SphI位点中生成，存在于所有基因组DNA样本中，并且此外在基因组DNA样本中的较高分子量的杂交条带指示有四个用于染色体中的PgapxylAB操纵子的整合位点。T3CCmX1和T3CCmX2看来似乎具有相同的整合位点，T3CCmX3和T4CCmX1可具有相同的整合位点，而T5CCmX1和T5CCmX2各具有分开的整合位点。用PstI消化相同DNA，随后通过用tkt探针进行的DNA杂交证明每个整合子具有与其相应的亲本菌株相同的杂交图像。
ZW1::Pgaptaltkt PgapxylAB Cm整合子适应木糖培养基
尽管存在所有四个木糖利用的酶活性，以前的观察(美国专利申请公布20030162271)指示整合子可能不立即在木糖上生长。在木糖上生长可发生在长时间在木糖培养基上培养之后(或者在测试管中或平板上)，该过程称为适应。
菌株如下进行适应。将ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm整合子菌株接种到包含RMX(包含10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4，20g/L或2％(w/v)木糖的测试管中以及MMGX或MMX平板上(10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L K2HPO4，1mM MgS04，1.5％(w/v)琼脂，0.025％(w/v)葡萄糖和4％(w/v)木糖或正好4％(w/v)木糖)。低水平的木糖用于支持初始生长以提高适应期间的突变可能性。在培养物和平板中的木糖上进行适应的至少五个尝试的其中一个是成功的。在30℃下厌氧培养10天后，在具有T3CCmX1和T3CCmX2细胞的MMGX上分别有17和19个菌落是可见的。平板上的菌落较小，并且看上去不健康(透明)。将十二个菌落(四个来自T3CCmX1平板：T3CCmX11、T3CCmX12、T3CCmX13和T3CCmX110；或者来自T3CCmX2平板：T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211和T3CCmX212)接种到RMGCm120中并转移到3mL RMX中用于进一步的适应以获得能够在木糖上生长较快的品系。
在包含3mL RMX的测试管中的整合子的适应在30℃下进行。一直在Spectronic 601分光光度计上监控OD600。当生长达到对数中期时，将培养物转移到RMX的新鲜管中。该过程持续7次转移。生长速率和最终的OD(非线性读数)经转移而被改善。
在第6次转移时，将培养物划线接种在RMX平板上以分离单菌落。三个整合子比在RMX划线平板上的其它整合子生长更快：T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27，在表中和下文的讨论中将它们称为X13、X26和X27。为了筛选在木糖上生长最好的菌落，选择TX13、X26和X27的四个大(L1-4)菌落和四个小(S1-4)菌落并在RMX测试管中培养以便能监控生长状况、糖利用率、和乙醇产量。菌落在30℃下生长过夜，随后当OD600＝0.05时接种到在双重测试管中的3mL RMX中。X27在RMG中比其它培养物生长更慢，在6.5小时后再次接种。在69小时(X27为62.5小时)后，采集样本进行HPLC分析(一般方法)。图4图示了在69小时时(所有X27培养物为62.5小时)培养物的平均乙醇产量(％理论产量)和木糖利用率(％)。在大菌落和小菌落之间无显著差异。尽管X27在木糖上的性能比X26更好，但它在葡萄糖上显示生长更慢。因此选择性能最佳的大菌落X13(X13L3)和X26(X26L1)在pH控制发酵中进行进一步的评估。菌株X13L3和X26L1以及对照菌株8b的发酵在37℃下在RMG(6％葡萄糖)、RMX(6％木糖)和RMGX(8％/4％；葡萄糖/木糖)中进行。在RMG(6％)和RMGX(8％/4％)中生长的X13L3和X26L1的葡萄糖发酵进行得相当迅速。X13L3和X26L1在RMGX(8％/4％)中的木糖发酵比菌株8b的木糖发酵更慢。此外X13L3和X26L1在37℃下在RMX(6％)上的生长发生在长时间的延迟之后。从RMX(6％)发酵液中回收若干种分离蛋白，X13b、X13c和X13FL。这些分离蛋白与初始菌株X13a(X13L3的分离蛋白)和X26如该实施例前文所述一起经受Cre处理以从ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株中除去Cmr标记。所得经Cre处理的无Cmr整合子称为：X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。
实施例2
菌株ZW658的适应和选择
如前文所述，初始ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株在30℃下在RMX上的适应极大地改善了在这些条件下菌株的生长。然而适应的菌株在37℃下在RMX(6％)中的生长和发酵期间经历长时间的延迟。为了在优选的过程条件下(包括较高的糖浓度和温度)进一步改善用于木糖发酵的整合子，进化或适应过程继续在37℃下在RMX(5％)中进行。进行连续转移闭关选择生长最好的菌株。该过程中使用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC，这5个菌株在30℃下在RMX中生长，在被转移到37℃下的RMX(5％)之前进行了6次转移，随后另外转移5至16次。在所有转移期间和之后将培养物划线接种在RMX平板上并在37℃下培养以分离单菌落。将大菌落进一步划线接种在RMX平板上并在37℃下培养3至4次以纯化菌落。选择最终的大菌落用于在37℃下在RMX(5％)中的生长测试。
评估在37℃下在RMX(5％)培养基中适应的菌株
在经连续转移适应后的十八个菌落最初在37℃下在RMX(5％)测试管中进行测试。选择十二个菌株进行第2次测试管评估。所有的评估中包括菌株8b用于比较。18个菌落在37℃下在RMG中生长过夜，离心并将细胞在37℃下接种到4mL的RMX(5％)中，在测试管中静态进行第1次评估。基于生长状况(OD600，非线性)和终点HPLC结果(低残余木糖和高乙醇)，选择12个菌株用于第2次评估。
第2次评估的其中一个目的是为了测试在木糖上改善生长的稳定性和菌株的木糖利用能力。所有12个菌株经过稳定性研究以检查适应菌株在暴露于非选择性培养基后是否是稳定的，其中将它们在37℃下连续转移50代。将在RMG(5％)转移之前和之后的培养物接种到RMX(5％)测试管中并在37℃下生长用于评估。非线性OD通过在Spectronic 601分光光度计中直接对测试管读数进行监控。将在RMG中生长50代之前和之后的、在RMX(5％)中生长至70小时的OD绘制图5中。结果指示大多数菌株在37℃下在RMG中生长50代后是稳定的。终点(稳定期)上清液也通过HPLC对木糖和乙醇浓度进行分析。在这些培养物中的低残余木糖和高乙醇浓度支持该菌株在木糖上生长和发酵良好这一事实。
基于上述测试管评估(低残余木糖、高乙醇浓度和较高的OD)和随后用高浓度葡萄糖和/或木糖(至多20％)以及葡萄糖和木糖及乙酸盐的混合物进行的微滴定板生长筛选的结果，在高糖和存在乙酸盐的情况下选择生长较好的菌株，如菌株#26，命名为ZW658，它表现出最好的总体性能。
实施例3
戊糖磷酸盐途径酶活性的测定
由整合基因(描述于实施例1中)编码的四种木糖利用酶的活性如一般方法所述进行测量，选择三个菌株适应高糖和37℃(实施例1)并比较在进一步适应的菌株ZW658(实施例2)中的相同酶的活性。表4显示了以微摩尔产物/毫克蛋白/分钟表示的结果。
表4：在不同木糖利用的适应运动发酵单胞菌菌株中的酶活性
  菌株   木糖异构酶   木酮糖激酶   转醛醇酶   转酮醇酶
  X13bC   0.033+/-0.013   1.15+/-0.13   1.66+/-0.5   0.22+/-0.02
  ZW658   0.25+/-0.033   4.41+/-0.21   2.67+/-1.0   0.19+/-0.05
在进一步适应的菌株ZW658中，xylAB操纵子的两个成员的活性水平与在部分适应的前体菌株中的活性水平相比提高了约4至8倍。在ZW658和部分适应的前体菌株之间，来自tal/tkt操纵子的酶表达水平变化不大或无变化。
实施例4
在部分适应的菌株和ZW658中的XylAB操纵子的启动子区域的序 列比较
因为在驱动xylAB的GAP启动子(Pgap)控制下的两个基因产物的酶活性水平的清楚改变是导致ZW658的适应的显著结果，通过PCR扩增来自部分适应菌株(实施例1；随后给定菌株编号ZW641)和ZW658的操纵子的启动子区域并进行测序。使用来自recG编码区的正向PCR引物(PC11；SEQ ID NO：27)(其中将PgapxylAB操纵子整合)和来自xylA编码区(PC12；SEQ ID NO：28)的反向引物制备PCR片段。所得961bp的PCR产物使用引物LM121、LM122、和LM123(SEQID NO：29、30、和31)测序。来自ZW641的启动子序列是SEQ ID NO：3，来自ZW658的启动子序列是SEQ ID NO：4。发现这些启动子序列在一个位置上不同于运动发酵单胞菌菌株CP4(SEQ ID NO：1)的Pgap公布序列：在-21位置后缺失1个碱基(T)，朝着GAP编码区的ATG起始密码子的5’末端起始上游计算。该序列变化不导致ZW641的Pgap和ZW658的Pgap之间的任何表达差异，因为它存在于两个菌株中。除了该共有改变外，在ZW641和ZW658的Pgap序列之间还存在单碱基对差异。在针对来自ZW641菌株的序列中的XylA编码区起始ATG的-189位上的G被在来自ZW658的序列中的T置换。发现两个序列之间无其它改变，由于在GAP启动子区域的单碱基变化，表达水平的改变可导致在该启动子控制下由基因编码的两个蛋白的酶活性提高似乎是可能的。
实施例5
构建具有驱动运动发酵单胞菌ZW641中XylA/B操纵子的相同 Pgap的运动发酵单胞菌木糖异构酶表达载体
赋予奇放线菌素抗性并在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶(pZB188/aada-GapXylA；其中Gap提供启动子)的质粒构建体如下所述生成，使用大肠杆菌/运动发酵单胞菌穿梭载体(pZB188)作为原料(图6A)。pZB188构建涉及的步骤公开于US 5,514,583中。简而言之，这一7008bp的质粒能够在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制，因为它具有两个不同的复制起点，分别用于各个细菌菌种。pZB188也包含赋予四环素抗性的DNA片段(即Tcr-盒)。构建pZB188/aada-GapXylA的第一步是从pZB188中除去Tcr-盒并用赋予奇放线菌素抗性的DNA片段置换它(即Specr-盒)。为了从pZB188中切除Tcr-盒，如下文详述用ClaI和BssHII酶切质粒，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得较大载体片段。Specr-盒通过使用质粒pHP15578(Cahoon等人，(2003)Nature Biotechnology 21：1082-1087)作模板以及引物1(SEQ ID NO：32)和2(SEQ ID NO：33)进行的PCR生成。质粒pHP15578包含Specr-盒的完整核苷酸序列及其启动子，它基于编码3’(9)-O-核苷酸转移酶的Tranposon Tn7aadA基因(GenBank保藏号X03043)的公布序列。
引物1(SEQ ID NO：32
CTACTCATTTatcgatGGAGCACAGGATGACGCCT
引物2(SEQ ID NO：33)
CATCTTACTac gcgtTGGCAGGTCAGCAAGTGCC
引物1(正向引物)的用下划线标示的碱基与Specr-盒的启动子上游杂交(GenBank保藏号X03043的nts 4-22)，而小写字母对应于加到引物5’末端的ClaI位点。引物2(反向引物)的用下划线标示的碱基与Specr盒的终止密码子下游的约130个碱基杂交(GenBank保藏号X03043的nts 1002-1020)，而小写字母对应于加到引物5’末端的AflIII位点。1048bp的PCR生成的Specr-盒用ClaI和AflIII进行双重消化，所得DNA片段使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，Cat.No.28104)，按照制造商推荐的规程进行纯化。在下一步骤中，质粒pZB188(为了获得非甲基化质粒DNA用于ClaI酶切，从大肠杆菌SSC110(dcm-，dam-)中分离，该质粒DNA对dam甲基化敏感)用ClaI和BssHII进行双重消化以除去Tcr-盒，所得较大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将该DNA片段和纯化的PCR产物连接到一起，并且将转化反应混合物导入大肠杆菌JM110中，使用获取自Stratagene的化学感受态细胞(Cat.No.200239)。注意BssHII和AflIII生成相容的“粘性末端”，但是当它们连接到一起时两个位点被破坏。将转化子置于包含奇放线菌素(100μg/mL)的LB培养基上并在37℃下生长。包含具有适宜大小插入序列的质粒的抗奇放线菌素转化体通过NotI限制性消化分析进行鉴定，并且选择用于进一步操纵的质粒，该质粒下文称为pZB188/aadA。图6B显示该构建体的环状示意图。
在下一步骤中，在用两种酶酶切后者并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段之后将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入pZB188/aadA的NcoI和AclI位点之间。用作大肠杆菌木糖异构酶表达盒的～2Kbp DNA片段通过用NcoI和ClaI酶切后一个构建体并通过琼脂糖凝胶电泳纯化相关的DNA片段从质粒pZB4中分离。质粒pZB4在US5514583中详述，并且大肠杆菌木糖异构酶表达盒PgapXylA(SEQ ID NO：34)的示意图在图6D中的框图中显示。
包含大肠杆菌木糖异构酶表达盒的片段在其5’和3’末端分别具有NcoI位点和ClaI位点。如US 5514583所详述，该片段包含强组成型运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子(nts 316-619)，该启动子精确稠合到编码木糖异构酶的大肠杆菌xylA开放阅读框(nts620-1942)的完整开放阅读框上。它也包含小茎-环区域，该区域紧接木糖异构酶终止密码子(nts 1965-1999)。在标准连接反应中将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入pZB188/aadA的NcoI和AclI位点之间。注意ClaI和AclI生成相容的“粘性末端”，但是当它们连接到一起时两个位点被破坏。然后将连接反应混合物电穿孔进入大肠杆菌SSC110(dcm-，dam-)，获得非甲基化质粒DNA以用于随后的运动发酵单胞菌转化，并且将转化细胞置于包含100μg/mL的奇放线菌素的LB培养基上；在37℃下生长。具有带适宜大小插入序列的质粒的抗奇放线菌素转化体通过NotI、NcoI和AclI的限制性消化分析进行鉴定。选择质粒用于在运动发酵单胞菌ZW641菌株中进一步操纵和超表达大肠杆菌木糖异构酶，该质粒下文称为“pZB188/aadA-641Gap-XylA”；图6C显示该质粒构建体的环状示意图。
重要的是注意到SEQ ID NO：34的核苷酸序列不同于在共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870和US20080187973中的SEQ ID NO：34中描述的核苷酸序列，甚至即使它对应于相同大肠杆菌木糖异构酶表达盒(PgapXylA)。在本文的SEQ ID NO：34中公开的DNA序列缺失在Pgap中缺失1-bp，它对应于在美国专利申请公布US20080286870和US20080187973中的SEQ ID NO：34的nt 599。在较早的专利申请中报道的核苷酸序列基于运动发酵单胞菌菌株CP4的Pgap的公布DNA序列(Conway等人，J.Bacteriol.169(12)：5653-5662(1987))，并且启动子那时不再进行重新测序。然而最近我们已经发现pZB4中的Pgap也缺失相同核苷酸，并且用于所有三个专利申请的大肠杆菌木糖异构酶表达盒(PgapXylA)来源于上文提到的质粒。
实施例6
生成具有驱动运动发酵单胞菌ZW658和ZW801-4中XylA/B操纵 子的相同P gap的大肠杆菌木糖异构酶表达载体
质粒pZB 188/aadA-801GapXylA与pZB 188-aada-641GapXylA(图6C)相同，不同的是在Pgap中有一个单核苷酸取代，它对应于存在于驱动ZW658中的大肠杆菌XylA/B操纵子表达的Pgap中的-189位上的G-＞T突变。该相同点突变也存在于菌株ZW800和ZW801-4中，它们如下所述相继来源于ZW658。ZW800和ZW801-4的构建和表征详述于共有的和共同未决的美国专利申请公布11/862566中。ZW800是ZW658的衍生物，ZW658在编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的序列中具有奇放线菌素抗性盒的双交叉插入序列，它灭活该活性。ZW801-4是ZW800的衍生物，其中奇放线菌素抗性盒通过位点特异性重组去除，留下过早截短蛋白的框内终止密码子。这些操纵不改变突变驱动ZW658中的XylA/B操纵子的Pgap启动子核苷酸序列。因此“801GAP启动子”指存在于以下菌株中的启动子序列：ZW658、ZW800、和ZW801-4。
该步骤和用于生成pZB 188/aadA-801GapXylA的质粒中间体在下文中以时间顺序描述，从质粒pMOD-连接子开始。
构建pMOD-连接子
质粒pMOD-连接子的前体是pMODTM-2<MCS>转座子构建载体(Cat.No.MOD0602)，它可从
Figure BPA00001231788800451
商购获得。如图7A所示，pMODTM-2<MCS>具有氨苄青霉素抗性基因(ampR)、大肠杆菌复制起点(ori)、和位于Tn5转座酶相互作用的两个嵌合末端(ME)之间的多克隆位点。构建pMOD-连接子的第一步是除去pMOD2-<MCS>中的起始多克隆位点并用新的多克隆位点置换它，新的多克隆位点具有AsiSi、FseI和SbfI的唯一限制性位点。这通过用EcoRI和HindIII酶切质粒并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大(约2.5Kbp)载体片段完成。然后将两个合成寡核苷酸一起退火生成新的多克隆位点，这两个寡核苷酸是5’末端均被磷酸化的连接子B(SEQ ID NO：35)和连接子T(SEQID NO：36)。
连接子B(SEQ ID NO：35)：
aattCTACCTGCAGGAGTAGGCCGGCCATGA
Figure BPA00001231788800452
A
连接子T(SEQ ID NO：36)：
agctT
Figure BPA00001231788800453
TCATGGCCGGCCTACTCCTGCAGGTAG
这些寡核苷酸是彼此互补的，并且当一起退火形成在两端(小写字母)具有单链突出部分双链连接子时，允许DNA片段在上述大pMODTM-2<MCS>载体片段的EcoRI和HindIII位点之间连接。如上所述该合成连接子也包含三个唯一的限制性位点(Asi Si、FseI和SbfI)，它们可用于随后的克隆步骤。SbfI位点用细下划线标示，FseI位点用粗下划线标示，而AsiSI位点用两条细下划线标示。连接子B和连接子T一起进行退火，将所得DNA片段通过标准连接反应插入pMODTM-2<MCS>的EcoRI和HindIII位点之间。将连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B并将转化细胞置于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上。然后从包含新的多克隆位点的代表性抗氨苄青霉素菌落中分离质粒DNA。所得质粒构建体(下文称为“pMOD-连接子”)的环状示意图如图7B所示。
构建pMOD-连接子-Spec
将赋予奇放线菌素(Specr)抗性并在两个末端具有野生型loxP位点的DNA片段插入上述pMOD-连接子构建体的AsiSI和FseI位点之间。loxP-侧接Specr盒的来源是质粒pLDH-Sp-9WW(图8)，该质粒详述于美国专利申请11/862566中。在第一步骤中，MOD-连接子质粒DNA连续用FseI和AsiSI消化，并且使用DNA Clean & ConcentratorTM-5离心柱试剂盒纯化大载体片段，该试剂盒购自Zymo Research Corporation(Cat.No.DO4003)。接下来，质粒pLDH-Sp-9WW也用相同两种酶进行双重消化，并且包含loxP-侧接Specr盒的小(约1.1Kbp)DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将受关注的两个DNA片段连接到一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将转化体置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)并在37℃下生长。然后从其中一个抗氨苄青霉素菌落中分离质粒DNA，所述菌落包含具有合适大小的DNA片段并且被用于随后的操纵。该构建体(下文称为“pMOD-连接子-Spec”)的环状示意图如图7C所示。
构建pMOD-连接子-Spec-801GapXylA和pMOD-连接子 -Spec-641GapXylA
包含完整Pgap、XylA编码区、和位于XylA和XylB开放阅读框之间的茎-环区域的DNA片段使用引物3和4(分别是SEQ ID NO：37和38)并用重悬细胞作模板，从ZW801-4通过PCR扩增得到。如上所述，DNA序列分析已经显示ZW801-4在Pgap启动子中的-189位上具有相同G-＞T点突变，该启动子驱动ZW658整合大肠杆菌XylA/B操纵子的表达并且Pgap在两个菌株中是相同的。
引物3(SEQ ID NO：37)
TCACTCATggccggccGTTCGATCA ACA ACCCGAATCC
引物4(SEQ ID NO：38)
CTACTCATcctggcaggCCGATATACTTATCGATCGTTCC
引物3(正向引物)的用下划线标示的碱基与Pgap的最前面的22个碱基杂交(SEQ ID NO：34的nts 316-337，而小写字母对应于加到引物5’末端的FseI位点。引物4(反向引物)的用下划线标示的碱基与在XylA终止密码子之后的茎-环区域下游杂交(SEQ ID NO：34的最后12个nts)，而小写字母对应于加到引物5’末端的SbfI位点。
PCR产物用FseI和SbfI进行双重消化，并且用DNA Clean &ConcentratorTM-5离心柱试剂盒纯化，该试剂盒购自Zymo Research Corporation(Cat.No.DO4003)。接下来，用相同的两种酶酶切质粒pMOD-连接子-Spec并用相同方法纯化所得大载体片段。然后将受关注的两个DNA片段连接到一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将细胞置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)并在37℃下生长。包含具有合适大小插入序列的质粒的转化体通过PCR进行鉴定，使用引物3和4并用重悬菌落作模板(“菌落PCR”)。下文把选择用于进一步操纵的质粒称为pMOD-连接子-Spec-801GapXylA，并且该构建体的环状示意图如图9所示。
使用上述相同步骤生成称为“pMOD-连接子-Spec-641GapXylA”的另一个质粒，不同的是用于PCR-扩增Pgap-XylA基因DNA片段的模板是ZW641的细胞悬浮液。pMOD-连接子-Spec-641GapXylA和pMOD-连接子-Spec-801GapXylA是相同的，不同的是在区别ZW658(以及ZW801-4)与ZW641的Pgap中的G-＞T取代。
构建pZB188-aadA-801GapXylA
如实施例6第一段所述，pZB188-aadA-801GapXylA是运动发酵单胞菌的大肠杆菌木糖异构酶表达载体，它与pZB188-aadA-641GapXylA相同，但是它在驱动ZW658(和ZW801-4)中整合Pgap-XylA/B操纵子表达的Pgap中具有相同的G-＞T取代。为了构建该质粒，pMOD-连接子-Spec-801GapXylA(图10A)用MluI和SalI进行双重消化，并且用琼脂糖凝胶电泳和Zymoclean Gel DNA Recovery试剂盒(catalog#D4001，Zymo Research)纯化较小的DNA片段(约1100bp)。该片段包含Pgap G-＞T取代和部分XylA ORF，并且在用相同两种酶酶切后一个构建体并用琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段后，被用于置换pZB188-aadA-641GapXylA(图10B)中的对应片段。然后将受关注的两个片段连接到一起，并且使用电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将转化子置于包含奇放线菌素(100μg/mL)的LB培养基上并在37℃下生长。从抗奇放线菌素菌落中分离质粒DNA，并且通过DNA序列分析确认存在Pgap启动子的G-＞T取代。用于随后的操纵的质粒(“pZB188-aadA-801GapXylA”)如图10C所示。
实施例7
超表达ZW641中的大肠杆菌木糖异构酶
表4中的酶活性测量显示木糖异构酶和木酮糖激酶活性在从ZW641转变成ZW658期间显著提高。为了验证木糖异构酶是ZW641中用于在木糖上生长的限速酶这一假设，该酶使用多拷贝质粒pZB188/aadA-641GapXylA(图6C)在这一菌株中过表达。该实验的对照是用多拷贝质粒pZB188/aadA转化的ZW641，它缺失Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达盒(图6B)。这两个质粒的构建如实施例5所述，并且转化规程基本上如共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080187973的实施例5所述。简而言之，使用电穿孔将非甲基化质粒DNA(从大肠杆菌SSC110中分离，它是dcm-和dam-菌株)导入ZW641，并且将转化细胞置于包含200μg/mL奇放线菌素的LB培养基上。在30℃的厌氧条件下生长48小时后，随机选择每个质粒的三个初级转化体，并且将这些转化体斑片接种(转移)到包含相同生长培养基的琼脂平板上进行进一步表征。
图11示出包含641Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒(X1、X2和X2)的三个菌株和包含对照质粒(C1、C2和C3)的三个菌株在包含木糖的培养基中的生长曲线(OD600对时间)。该实验在30℃下在摇瓶(在15mL管中的5mL培养物，转速150rpm)中进行，并且生长培养基是mRM3-X10(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4和100g/L木糖)，它也包含奇放线菌素(200μg/mL)。培养物以来自上文段落所述的斑片平板的一接种环细胞开始，并且在各种情况下的初始OD600为约0.13。类似于ZW641，具有对照质粒的三个菌株几乎不能在木糖上生长。在标记的对照中，当ZW641用641Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒pZB188/aadA-641GapXylA转化时，在木糖上的生长速率和生长程度(最终OD600值)都发生了显著改善。因为在实验中具有该质粒的所有三个菌株表现相同，如图11所示，仅仅X1菌株和C1菌株进行进一步表征。
图12示出在包含无奇放线菌素的生长培养基的相同木糖上的ZW641、ZW658、X1和C1并列型比较。该实验的条件与那些上述条件相同，不同的是20mL培养物在50mL管中生长，并且初始OD600低约4倍(0.035)。为了比较指数生长速率，图12A中显示的生长曲线以线性标度作图(OD600对时间)，而图12B示出以对数标度(logOD600对时间)作图的相同实验数据。从该实验中明显的看出X1的指数生长速率几乎与木糖适应菌株ZW658一样快，并且该菌株在木糖上比具有或不具有对照质粒的亲本菌株ZW641生长得好得多。因此木糖异构酶在ZW641中的高表达(由来自多拷贝质粒的641Pgap启动子驱动)对在木糖上生长具有的效应与木糖异构酶活性提高对ZW658(如表4所示)具有的效应相似。尽管X1的最终生物质产量比用ZW658获取的生物质产量低约2倍，从该数据中清楚地看出ZW641中的木糖生长限速酶是木糖异构酶。在图11和12中显示的该实验进一步说明两个其它的令人感兴趣的可能性：(1)发生在ZW641转变成ZW658(表4)期间的木糖异构酶活性的较大提高很大程度上是发生在“木糖适应”过程中的较好的木糖上生长的原因；和2)木糖异构酶活性的提高可能已经由Pgap启动子中的G-＞T取代产生，该启动子驱动存在于ZW658中的染色体整合的Pgap-XylA/B操纵子的表达。
实施例8
转座子介导的ZW641中的大肠杆菌木糖异构酶整合
ZW641和两个质粒构建体(pMOD-连接子-Spec-801GapXylA和pMOD-连接子-Spec-641GapXylA)用于验证以下假设：具有G-＞T取代并且驱动ZW658中整合XylA/B操纵子表达的Pgap启动子(下文称为“801GAP启动子”)强于ZW641中对应启动子(下文称为“641GAP启动子”)。选择ZW641用于这些实验是因为其几乎不能在木糖上生长，并且因为在该菌株中木糖异构酶的超表达导致在木糖上的较快生长(实施例7、图11和12)。基本的想法是将一拷贝的大肠杆菌木糖异构酶基因(由641GAP启动子或801GAP启动子驱动)额外导入ZW641的染色体并检验那个构建体将导致在木糖上的较快生长。使用Epicentre转座体技术完成两个嵌合基因的染色体整合。
正如已经指出的：pMOD-连接子-Spec-641GapXylA和pMOD-连接子-Spec-801GapXylA是相同的质粒，不同的是在后一个构建体中的Pgap启动子中存在G-＞T点突变。在两种情况下用于随机插入DNA的转座元件由两个19-bp的嵌合末端(ME)和位于它们之间的完整DNA片段组成。如图9所示，该元件称为转座子，它包含奇放线菌素抗性盒(Specr)和下游的Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达盒。用于形成转座体的规程基本上与Epicentre说明书手册中描述的用于EZ::TNTM pMODTM-2<MCS>Transposn Construction Vector(Cat.No.MOD0602)的规程相同。8-μL反应液包含1.5μL不含Mg++离子的、5’-磷酸化的、钝化末端转座子DNA(约250ng/μL)、4μL的Epicentre EZ::TN转座酶和2.5μL 80％(v/v)甘油。对照转座体反应混合物是相同的，不同的是4μL无菌水取代了转座酶。该反应在室温下孵育30分钟，然后转移到4℃下孵育2至7天，这段时间是慢速异构化步骤所需的，该异构化步骤导致形成活性转座体；使用该程序转座体在-20℃下稳定至少3个月。
基本上使用与US 5,514,583所述的转化规程相同的转化规程使转座体通过电穿孔进入ZW641。简而言之，40-μL转化反应物包含在10％(v/v)甘油中的约1010个细胞/mL，1μL Epicentre TypeOneTM Restriction Inhibitor(Cat.No.TYO261H)和1μL对照或转座体反应混合物。电穿孔乙仪的设置是1.6kv/cm，200Ω，25μF，比色杯的间隙宽度为0.1cm。在电穿孔之后，转化反应用1.0mL的MMG培养基稀释(50g/L的葡萄糖，10g/L酵母的提取物，5g/L的蛋白胨，2.5g/L的(NH4)2SO4，0.2g/LK2HPO，和1mM MgS04)，并且允许细胞在30℃下恢复约3小时。然后在室温下，在无菌的1.5mL微量离心管中离心收获细胞(13,000Xg，5min)，小心地移除上清液。将细胞沉淀物重悬于200μL的液体MMG培养基中，并且将每个细胞悬浮液的100μL等分试样置于MMG培养基上，该培养基包含1.5％的琼脂和200μg/mL奇放线菌素。在30℃厌氧条件下孵育72小时后，3个菌落位于对照平板上，13个菌落位于641GapXylA转座体平板上并且18个菌落位于801GapXylA转座体平板上。随机选择来自转座体平板的六个菌落进行进一步表征，并且将这些菌落斑片接种到琼脂平板上，该平板包含MMX培养基和200μg/mL奇放线菌素；生长条件如上所述。MMX培养基与MMG培养基相同，不同的是它包含50g/L的木糖，而不是葡萄糖。在加上奇放线菌素的新鲜MMX平板上生长两轮后，在木糖上生长最好的六个菌株(每个转座体三个)用于下文所述的实验。
图13A示出三个ZW641菌株的线性生长曲线，所述菌株在包含木糖的培养基中具有641Gap-XylA转座体(#6-1、#6-3和#6-5)并且三个接受801Gap Xy1A转座体(#8-2、#8-4和#8-5)。相同数据以对数标度绘制在图13B中。该实验在30℃下在摇瓶(在15mL管中的7mL培养物，转速150rpm)中进行，并且生长培养基是mRM3-X10(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4和100g/L木糖)。培养物以来自上文所述的斑片平板的一接种环细胞开始，并且初始OD非常相似(约0.02-0.03)。该实验的对照物是木糖适应菌株ZW658，它在Pgap中具有G-＞T取代，该启动子驱动染色体整合大肠杆菌XylA/B操纵子。
类似于亲本菌株(ZW641)，具有额外染色体整合拷贝的641GapXylA表达盒的三个菌株在包含木糖的培养基中生长非常差，尽管显然有一些生长速率和生物量(OD600)的微小改善，尤其是菌株#6-5(比较图12A和图13A)。与之相反，获取的具有801GapXylA转座子的所有三个菌株比亲本菌株在木糖上生长好得多(图13A和13B)。事实上，两个转化体(#8-4和#8-5)与包含多拷贝质粒pZB188/aadA-GapXylA的ZW658和ZW641转化体在糖上生长几乎一样好，所述质粒包含641GapXylA表达盒(比较图12和图13)。因为转座是随机事件并且所有六个菌株具有插入染色体不同位置的641GapXylA或801GapXylA表达盒，在使用相同转座体的实验中观察到的外源基因表达的差异可能是由于位置效应。例如位置效应可说明为什么#6-5比#6-1和#6-3生长得更好，以及为什么#8-2比#8-4和8-5生长得更差。然而尽管分析了较小的种群，图13中显示的结果强烈支持这一观点：存在于驱动ZW658和ZW801-4中XylA/B操纵子的大肠杆菌Pgap启动子中的G-＞T突变是与亲本菌株ZW641相比，在这些菌株中观察到的更高木糖异构酶活性和更好的木糖上生长状况的原因。
实施例9
木糖利用性运动发酵单胞菌的独立适应的木糖菌株的转基因GAP 启动子区的酶活性和序列比较
因为菌株8b(实施例1和美国专利申请公布20030162271)是使用与ZW658相似的基因导入和菌株适应过程来获取的，戊糖磷酸途径的转基因活性和PgapxylAB操纵子的序列也在与该独立菌株生产的部分地适应的菌株和更充分适应的菌株中进行了比较。在部分地适应的菌株8XL4和最终适应的菌株8b中的PgapxylAB操纵子的产物酶活性使用如一般方法所述的技术进行测量，并且结果以微摩尔产物/毫克蛋白/分钟表示，如表5所示。
表5：在不同木糖利用性适应的运动发酵单胞菌菌株中的酶活性
  菌株   木糖异构酶   木酮糖激酶
  8XL4   0.027+/-0.004   1.10+/-0.41
  8B   0.142+/-0.057   5.76+/-0.43
正如当前述ZW658菌株发生促进在木糖上生长的突变时发生的适应一样，菌株8b在xylAB操纵子中的两个基因的产物具有比其前体菌株8XL4的产物更高的活性。测量的酶活性的再一次提高与不适应菌株相比提高了约5倍。
引导xylAB操纵子表达的Pgap在8b和8XL4菌株中测序。使用来自启动子5’末端的正向PCR引物(GAP-F8；SEQ ID NO：39)和来自xylA编码区(XylAB851R；SEQ ID NO：5)的反向引物制备PCR片段。所得PCR产物使用引物GAP-F8、XylAB449R、和XylAB851R(SEQID NO：39、41、和40)进行测序。来自ZW8XL4的启动子序列是SEQID NO：3，来自8b的启动子序列是SEQ ID NO：5。这些启动子序列也都与菌株CP4的Pgap公布序列具有一个差异，如同在ZW641和ZW658中的xylAB操纵子的Pgap一样。除了这些共有改变外，在ZW641和ZW658的Pgap序列之间还存在单碱基对差异。当在相对于起始ATG的-189处的G变成T的改变不存在于8XL4和8b的比较中时，在相对于起始ATG的-89位处不发生C变成T的改变。
正如在菌株ZW658中的PgapxylAB操纵子的启动子序列一样，在菌株8b中的PgapxylAB操纵子的启动子序列在适应新序列期间改变，所述新序列允许在其控制下比在来自部分适应菌株的相同启动子的序列控制下从编码区产生更多的蛋白。
Figure IPA00001231788200011
Figure IPA00001231788200021
Figure IPA00001231788200041
Figure IPA00001231788200051
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Claims (11)

1.选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的重组细菌菌株，所述重组细菌菌株包含通过转化导入的嵌合基因，所述嵌合基因包含：
a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和
b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。
2.权利要求1的重组菌株，其中所述碱基取代是：
a)在-190位，T取代G；和
b)在-89位，T取代C。
3.权利要求2的重组菌株，其中所述改善的Pgap包含选自下组的序列：SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和12。
4.权利要求1的重组菌株，所述重组菌株附加地用表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因进行了转化。
5.权利要求1的重组菌株，其中所述嵌合基因还包含可操作地连接的编码木酮糖激酶的分离的核酸分子，形成操纵子。
6.权利要求1的重组菌株，其中当使用Pfam序型HMM查询表3中给出的xylA家族蛋白时，所述木糖异构酶是具有小于或等于3×10-10的E值参数的蛋白，并且具有四个催化位点残基：组氨酸54、天冬氨酸57、谷氨酸181、和赖氨酸183，所述位置编号是参照白色链霉菌木糖异构酶序列(SEQ ID NO：X)。
7.权利要求1的重组菌株，其中所述木糖异构酶具有的氨基酸序列与选自下组的序列具有90％的氨基酸同一性：SEQ ID NO；42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、和104。
8.对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括：
用嵌合基因进行转化，所述嵌合基因包含：
a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和
b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。
9.对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的利用木糖的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括任何顺序的下述步骤：
a)用表达转醛醇酶和转酮醇酶的基因或操纵子进行转化；和
b)用表达木糖异构酶和木酮糖激酶的基因或操纵子进行转化，其中所述木糖异构酶表达自运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap。
10.生产乙醇的方法，所述方法包括：
在包含木糖的培养基中培养权利要求1的重组细菌菌株；
保持在任何系统中适于乙醇生产的发酵条件，
由此促使权利要求1的培养的重组细菌菌株将木糖转化成乙醇。
11.选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的、经工程化以表达木糖异构酶的重组细菌菌株，所述木糖异构酶的表达水平为产生至少约0.1微摩尔产物/毫克蛋白/分钟，这通过使20μL细胞游离提取物在30℃下在反应混合物中反应而进行测定，所述混合物包含0.256mM NADH，50mM木糖，10mM MgSO，10mM三乙醇胺，和1U/mL山梨醇脱氢酶，其中D-木酮糖是产物。
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