CN104220590A - 使得工程化的发酵单胞菌在木糖培养基上立即生长的基因失活 - Google Patents

使得工程化的发酵单胞菌在木糖培养基上立即生长的基因失活 Download PDF

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Abstract

经过基因工程改造以具有破坏的醛糖还原酶基因，使在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性降低了超过90％的、以及经过工程化改造以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌(Zymomonas)细胞，被发现具有在包含作为唯一糖类的木糖的培养基上生长而不需在包含木糖的培养基上适应的能力。

Description

使得工程化的发酵单胞菌在木糖培养基上立即生长的基因失活
本申请要求2011年12月20日提交的美国临时申请61/577879的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，发酵单胞菌(Zymomonas)基因组中被注释为编码醛/酮还原酶的基因的失活，被发现使得经工程化以表达木糖利用途径的发酵单胞菌能够在木糖上立即生长而不需木糖适应步骤。
背景技术
通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望产生乙醇以及其它有用产品的微生物能够使用木糖作为碳源，因为木糖是水解的木质纤维素生物质中主要的戊糖。生物质能够提供丰富的可利用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和其他天生不会利用木糖的产生乙醇的细菌已接受了基因工程改造以利用木糖，上述基因工程改造是通过引入编码下列的基因进行的：1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖-5-磷酸；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US5514583、US5712133、US6566107、WO95/28476、Feldmann等人(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.38：354-361；Zhang等人(1995)Science267：240-243；Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。通常所使用的编码区域是来自大肠杆菌(E.coli)的基因。
即使有木糖利用途径的表达，当木糖是唯一碳源时，工程化的发酵单胞菌菌株在它们能够在木糖上生长之前通常还需要在含木糖的培养基中的适应期。通过连续传代，已使经工程化以表达木糖利用途径的菌株在含木糖的培养基上适应，产生了具有改善的木糖利用率的菌株，如美国专利7,223,575和美国专利7,741,119中所述。美国专利7,989,206所公开的是，在适应过程中，表达大肠杆菌木糖异构酶的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，被突变为使得先前是木糖代谢的限速酶的木糖异构酶活性水平升高的更具活性的形式这一发现。
美国专利7,741,119还公开了通过编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(当葡萄糖和木糖都可用时能够产生木糖醇的酶))的gfor基因座的失活改善的木糖利用。因此，在包含葡萄糖和木糖的生长培养基中，与缺少木糖异构酶的细胞相比，表达将木糖转化为木酮糖的木糖异构酶的发酵单胞菌细胞产生了约3倍的木糖醇(US7,741,119)。此外，当GFOR基因失活时，这种增加没有发生，因此表明了该酶在木糖醇的体内生产中的重要性。
使用无细胞提取物已确定，运动发酵单胞菌的野生型菌株(CP4)具有能够直接将D-木糖转化为木糖醇的NADPH依赖的醛糖还原酶活性(Feldmann等人Appl.Microbiol.Biotechnol.(1992)38：354-361)。运动发酵单胞菌的另一野生型菌株(ZM4)也被报道具有NADPH依赖的醛糖还原酶活性(Agrawal等人2011 108：777-785)。在该研究中，包含木糖代谢所需的全部四种基因的质粒被引入了ZM4，所得到的转化体没有适应步骤时不能在木糖上生长。从该方法产生的适应的菌株(A1)能够在木糖上生长，但只能非常缓慢地生长。为了改善木糖利用率，以木糖作为唯一碳源，在花了80天和30次系列转移的过程中使A1进一步适应。新的适应的菌株(A3)在木糖上比A1亲本生长更好。它还产生了更少的木糖醇、更加耐受木糖醇、并且具有更高的木糖异构酶活性。因此，在A3菌株的进化过程中，至少发生了三种不同的突变。尽管在导致了A1菌株(其能够在木糖上生长，尽管是不佳地)的第一适应期中发生的突变的数量没有被测定，作者指出，A1和A3两种适应的菌株均具有与携带空质粒的野生型ZM4相比“勉强可检测”的NADPH依赖的醛糖还原酶活性。随后报道了A3菌株在编码具有能够使木糖转化为木糖醇的NADPH依赖的木糖还原酶活性的酶的ZMO0976基因编码区中具有点突变(Agrawal和Chen(2011)Biotechnol.Lett.33：2127-2133)。基于在大肠杆菌中的表达，经纯化的突变体蛋白质具有野生型酶的活性的＜5％。在相同的研究中还显示了对于ZMO0976基因产物，苯甲醛和糠醛是比木糖更好的底物。
仍然存在对包含用以利用木糖的基因并且能够在包含木糖作为唯一碳源的培养基上生长而不需预先的适应步骤的工程化的发酵单胞菌和其他产乙醇细菌、以及对使用这些菌株来生产乙醇的方法的需求。
发明内容
本发明提供了经基因工程改造以能够在包含木糖作为唯一糖类的培养基上生长而不需适应的发酵单胞菌细胞、以及制备所述细胞和使用所述细胞生产乙醇的方法。
因此，本发明提供了一种制备可利用木糖的(xylose-competent)发酵单胞菌细胞的方法，所述方法包括：
a)提供发酵单胞菌宿主细胞；
b)在所述细胞内至少一种内源性基因中创建基因修饰，所述内源性基因编码具有在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的能力的EC1.1.1.21的醛糖还原酶；以及
c)向所述细胞中引入木糖利用代谢途径；
其中步骤(b)和(c)的顺序不是指定的，并且其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞具有的醛糖还原酶活性与缺少步骤(b)的基因修饰的发酵单胞菌细胞相比降低超过90％。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种可利用木糖的且产乙醇的发酵单胞菌细胞，所述发酵单胞菌细胞具有下列特性：
a)所述细胞对于在含木糖的培养基上立即生长，不需要木糖适应步骤；
b)所述细胞具有的在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性降低超过90％；以及
c)所述细胞包含木糖利用代谢途径，所述途径包括一系列多核苷酸，所述多核苷酸编码各自具有木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、或转醛醇酶的酶活性的多肽。
另外，本发明提供了用于生产乙醇的方法，该方法包括使本发明的可利用木糖的且产乙醇的发酵单胞菌细胞在其中产生乙醇的条件下生长。
附图说明和序列描述
图1显示了用于木糖的利用和乙醇的生产的代谢途径的图表。
图2显示了工程化的木糖利用途径的前两个步骤(框内)、木糖醇的合成、木糖醇-5-磷酸(有毒的“死路”中间体)的形成、和木糖醇对木糖异构酶的抑制的图表。
图3显示了pZX21(A)、pZX52(B)、和pZX6(C)的质粒图谱。
图4显示了ZW1-109(A)、ZW1-210(B)、和对照ZW1(C)在mRM3-X10中生长的培养物的生长、木糖利用、和乙醇生产的图。
图5显示了pMODlinker-Cm的质粒图谱。
图6(A)显示了pAR-cm的质粒图谱，(B)显示了在包括了ZMO0976开放阅读框在内的ZW658染色体的部分中的引物结合位点的图表。
图7显示了ZW1染色体的区域的图表，其包括在与pAR-cm自杀构建体的双交换事件之后的ZMO0976开放阅读框，标出了引物结合位点和PCR产物。
图8显示了两个ZMO0976敲除突变体(AR1、AR2)和对照野生型运动发酵单胞菌ZW1生产木糖醇的图。
图9显示了经工程化以表达木糖利用途径(在pZB4上)的具有ZMO0976基因敲除(AR1；三个分离株：-1、-2、-3)或具有天然ZMO0976基因(ZW1；三个分离株：-A、-B、-C)的运动发酵单胞菌菌株，通过OD600监测的在包含100g/L木糖作为唯一糖类的培养基中生长的图。填满的符号全部是重叠的。
图10显示了经工程化以表达木糖利用途径(在pZB4上)的八个运动发酵单胞菌分离株，在包含45g/L木糖和5g/L葡萄糖的培养基中、然后在包含100g/L木糖作为唯一糖类的培养基中适应之后，通过OD600监测的在包含100g/L木糖作为唯一糖类的培养基中生长的图。圆圈标出了所分离的三种类型的经适应的突变菌株(组#1-3)。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。
SEQ ID NO：1是ZMO0976编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是由ZMO0976编码区编码的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是来自运动发酵单胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是来自菌株ZW658的改进的Pgap的核苷酸序列，其被称为801GAP启动子或超级GAP启动子或PgapS。
SEQ ID NO：5是来自菌株8b的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是在Pgap的pZB4变体中具有位置116(ZW658)和位置217(8b)突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是在Pgap的CP4变体中具有来自ZW658的位置116突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是在Pgap的CP4变体中具有来自8b的位置217突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是在Pgap的CP4变体中具有位置116(ZW658)和位置217(8b)突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是在Pgap的ZM4变体中具有来自ZW658的位置116突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是在Pgap的ZM4变体中具有来自8b的位置217突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是在Pgap的ZM4变体中具有位置116(ZW658)和位置217(8b)突变的改进的Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是针对发酵单胞菌经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missourinesis)木糖异构酶的编码区。
SEQ ID NO：14是来自菌株ZW641和ZW658的具有78核苷酸缺失的ZMO0976编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是质粒pZX21的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是GFO-L片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是gfor编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是GFO-R片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是包含304-bp运动发酵单胞菌超级GAP启动子、1,185-bp密苏里游动放线菌(A.missouriensis)xylA编码序列、和具有5’XbaI位点的166-bp大肠杆菌araD3’UTR的166-bp嵌合的xylA基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是包含191bp Peno、1,455-bp大肠杆菌xylB编码序列和314-bp大肠杆菌xylB3’UTR的1,960-bp嵌合的xylB基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是由lox位点限定的1,014bp aadA标记(用于奇放线菌素抗性；Spec-R)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是穿梭载体pZX52的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是LDH-L片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是LDH-R片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：25是ldhA编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是包含运动发酵单胞菌GAP启动子的304-bp T突变体(PgapT)、954-bp大肠杆菌Tal编码区、1,992-bp大肠杆菌Tkt编码区、和68-bp大肠杆菌Tkt3’UTR的3,339bp PgapT-Tal-Tkt操纵子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27是PgapT启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是包含191bp Peno、471bp运动发酵单胞菌Rpi编码序列、663bp运动发酵单胞菌Rpe编码序列、和35bp大肠杆菌xylA3’UTR的1,443bp Peno-Rpi-Rpe操纵子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29是DCO穿梭载体pZX6的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是PNP-L片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是PNP-R片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32至41是PCR引物。
SEQ ID NO：42是来自运动发酵单胞菌菌株ZM4的pnp编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是起始密码子突变为ATG的运动发酵单胞菌RPI蛋白质的编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44和45是引物。
SEQ ID NO：46是包含侧翼为两个野生型loxP位点的Cmr-盒的片段2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：47至72是引物。
具体实施方式
可使用下列定义阐释权利要求和说明书：
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其他变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明所用的成份或反应物的量的术语“约”是指数量上的变动，其可通过，例如，通过在实际中为制成浓缩物或使用溶液而进行的典型测量和液体操作工序所产生；通过在这些工序中的意外失误而产生；通过在用于制备组合物或实施方法的成份的制造、来源或纯度上的差异而产生；等等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。
“基因”指表达特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段，其可任选地包括位于编码序列之前的调控序列(5′非编码序列)和之后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。
“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时候表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。
如本文所用，术语“表达”指衍生自基因的编码(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA向多肽的翻译。“过表达”是指基因产物在转基因生物体内的生产，其超过了在正常或非转化生物体内的生产水平。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，在其中许多核苷酸序列已被接合或组合为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起引入细胞中的独特构造。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。
术语“基因修饰”非排他地指宿主细胞或细菌菌株的遗传因子的任何修饰、突变、碱基缺失、碱基添加、密码子修改、基因过表达、基因抑制、启动子修饰或取代、基因添加(单或多拷贝的)、反义表达或抑制、或任何其他改变，无论它们是否产生表型的变化。
术语“重组细菌宿主细胞”是指包含至少一种异源性基因或遗传构建体或核酸片段的细菌细胞。
术语“NADPH依赖的木糖还原酶活性”是指在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性。
术语“可利用木糖的发酵单胞菌细胞”是指能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中生长而不需针对在木糖上的生长经过适应的发酵单胞菌细胞。
术语“针对在木糖上的生长适应的”是指在包含木糖的培养基中长时间生长之后分离的细胞或菌株。适应可包括在包含木糖和葡萄糖的培养基中生长一段时间，然后在仅包含木糖的培养基中生长一段时间，每种培养基为含木糖的培养基。通常，所述长时间的生长是至少约四天。
术语“木糖代谢途径”或“木糖利用代谢途径”是指将木糖代谢为果糖-6-磷酸和/或甘油醛-6-磷酸的一系列(由基因编码的)酶，并且包括1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖-5-磷酸；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。
术语“木糖异构酶”是指催化D-木糖和D-木酮糖的互变的酶。木糖异构酶(XI)属于被分类为EC5.3.1.5的酶的组。
术语“核糖-5-磷酸异构酶”或“RPI”是指催化核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸的互变的酶。核糖-5-磷酸异构酶属于被分类为EC5.3.1.6的酶的组。
术语“核酮糖-磷酸-3-差向异构酶”或“RPE”是指催化D-核酮糖-5-磷酸和D-木酮糖-5-磷酸的互变的酶，并且被分类为EC5.1.3.1。
术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被微生物代谢的碳源。碳底物的一种类型是“可发酵糖类”，它是指能够在发酵过程中被微生物用作碳源的寡糖和单糖。
术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质材料也可包含半纤维素。
术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。
术语“糖化”指由多糖生产可发酵糖。
术语“经预处理的生物质”是指已经经受过热、物理和/或化学处理，以提高糖化酶对该生物质中的多糖的可用性的生物质。
“生物质”指任何纤维质的或木质纤维质的材料并包括包含纤维素的材料，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖。生物质也可包含附加组分如蛋白和/或脂质。生物质可来自单一来源，或生物质可包含来自超过一种来源的混合物；例如，生物质可包含玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草与叶的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱，从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。生物质也可在糖化前进行预处理或预加工。
术语“异源”指非天然存在于受关注的位置。例如异源基因指宿主生物中非天然存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。例如，存在于嵌合基因中的异源核酸分子是与其他嵌合基因片段相关的非天然存在核酸分子，例如具有彼此非天然相关的编码区和启动子片段的核酸分子。
如本文所用，“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高度严格性条件是最后两次洗涤在65℃下用0.1XSSC，0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下杂交并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度超过100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。在优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选地，长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing： Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成代码。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign程序进行。
序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V比对方法的“Clustal V比对方法”，该方法描述于Higgins和Sharp，(CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中)并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignv8.0程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY＝10、以及GAP LENGTH PENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为ClustalW(在Higgins和Sharp，CABIOS；5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl Biosci.8：189-191(1992)；Thompson，J.D.等人，Nucleic AcidResearch，22(22)：4673-4680，1994)并存在于LASERGENE生物信息学计算包(DNASTAR Inc.)的MegAlign v8.0程序中。用于多重比对的默认参数规定为蛋白质/核酸(GAP PENALTY＝10/15、GAP LENGTHPENALTY＝0.2/6.66、Delay Divergen Seqs(％)＝30/30、DNA TransitionWeight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet系列、DNA WeightMatrix＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它菌种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。百分比同一性的有用例子包括但不限于：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％，或者从50％至100％的任何整数百分比可用于鉴定所关注的多肽，例如50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同一性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少125个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin PackageVersion9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods GenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是为人们所熟知的，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第5版Current Protocols，John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.，2002。
本发明涉及创建发酵单胞菌菌株的方法，所述菌株能够在木糖利用途径的引入之后直接在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中生长，而不需在含木糖的培养基中的适应期。木糖是水解的木质纤维素材料中主要的戊糖之一，使得木糖的利用是生物质水解产物的发酵所期望的。生物质水解产物能够提供丰富的、可再生的碳水化合物来源，用于目标产物的生物催化的生产。在含木糖的培养基中的适应步骤(这是耗时的并且在其中可能发生多种不确定的突变)的除去，极大地有利于利用木糖的生物催化剂的开发。
经改造的利用木糖的发酵单胞菌
发酵单胞菌细胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为发酵底物生产乙醇，但木糖不被其代谢。产乙醇的发酵单胞菌的菌株，例如运动发酵单胞菌，已被工程化以将木糖发酵为乙醇。通常，四种基因被引入运动发酵单胞菌，用于表达参与木糖代谢的四种酶，以创建木糖利用代谢途径(图1)，如美国专利5,514,583、美国专利5,712,133、美国专利6,566,107、WO95/28476、Feldmann等人((1992)Appl Microbiol Biotechnol38：354-361)、和Zhang等人((1995)Science267：240-243)所述。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成木酮糖-5-磷酸。另外还表达了戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将木酮糖-5-磷酸转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源可包括黄单胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、埃希氏菌(Escherichia)、红细菌(Rhodobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、农杆菌(Agrobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonads)和发酵单胞菌。大肠杆菌的编码区通常被使用。
将编码DNA序列可操作地连接至发酵单胞菌细胞中表达的启动子如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)和运动发酵单胞菌烯醇酶启动子(ENO启动子)。如US7,989,206(该文献以引用方式并入本文)中所公开的具有提高的表达的突变体GAP启动子，对于在发酵单胞菌中表达也是有用的。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基因导入发酵单胞菌细胞并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合的方法整合进基因组中。经工程化以表达木糖利用代谢途径的菌株的例子包括CP4(pZB5)(US5,514,583)、ATCC31821/pZB5(US6,566,107)、8b(US20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)、和ZW658(ATTCC#PTA-7858)。
如上文所述的经工程化以表达木糖利用代谢途径的菌株通常不能在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中立即生长。这些菌株的一个代谢问题是图2中显示的旁侧途径(框外)，其不仅降低了从木糖生产乙醇(带框部分)的效率，而且在木糖的存在下对细胞活力还具有有害效应，尤其是当木糖是唯一碳源时。在该途径中，木糖被转化为木糖醇，其继而被工程化的木糖利用代谢途径中的第二个酶木酮糖激酶转化为木糖醇-5-磷酸。木糖醇-5-磷酸是抑制细菌生长的有毒化合物，并且已清楚地证明，大肠杆菌木酮糖激酶通过木糖醇至木糖醇-5-磷酸的转化直接负责木糖醇的抑制性效应(Akinterinwa等人(2009)Metabolic Engineering11：48-55)。此外，木糖至木糖醇的转化还减少了流至乙醇的底物，并且木糖醇还是工程化的木糖利用途径中的第一个酶，木糖异构酶的抑制剂。实验已确定，在运动发酵单胞菌中至少有两种不同的途径形成木糖醇：1)通过葡萄糖-果糖氧化还原酶(US7,741,119)，和2)通过NADPH依赖的醛糖还原酶活性(Feldmann等人，同上；Agrawal等人(2011)Biotechnology and Bioengineering108：777-785)。
经工程化以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌细胞，在能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中生长之前，一般需要在含木糖的培养基中适应一段时间。在适应步骤(其通常是在含木糖的培养基中系列转移的一段长时期)期间，在基因组中能够发生多个突变。在经工程化以利用木糖的不同菌株的适应期间发生的多个特定突变已被鉴定，但不清楚哪些对于在作为唯一碳源的木糖上生长的初始能力是重要的和/或必需的。实际上，在本工作之前，还没有使得表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌菌株能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中立即生长的单个突变被鉴定。
工程化在木糖培养基中的立即生长
本发明涉及以下新发现：在还被工程化以利用木糖的发酵单胞菌细胞中能够进行影响单种酶活性的表达的基因修饰，其允许在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中的立即生长，而不需适应步骤。这些细胞是可利用木糖的发酵单胞菌细胞。所述基因修饰破坏了编码能够将木糖转化为木糖醇的NADPH依赖的醛糖还原酶的至少一种内源性基因的表达，从而导致了无细胞提取物中的NADPH依赖的木糖还原酶活性降低超过90％。活性可降低超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。NADPH依赖的木糖还原酶活性是在木糖的存在下，通过在340nm监测NADPH至NADP的转化在无细胞提取物中测量的，如本文的“一般方法”中所述。
通过破坏编码推定的醛/酮还原酶(如Seo等人所命名的(2005)Nat.Biotechnol.23：63-68)的内源性基因的表达，使NADPH依赖的木糖还原酶活性比野生型发酵单胞菌细胞降低超过90％，在本文中被发现减少了当生长在含木糖的培养基中时由细胞产生的木糖醇。然而，即使有这种基因操作，细胞的木糖醇生产也没有被完全消除，尽管其减少了约三倍(显示于图8中)。
随后被提供了木糖的利用所需的四种酶(木糖利用代谢途径)的具有该破坏的细胞，在本文(实例6)中被显示能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养基中立即生长，而不需要适应步骤。因此，这些是能够针对仅包含木糖作为碳源的培养基的利用进行选择的可利用木糖的发酵单胞菌细胞。作为另外一种选择，在已经具有木糖的利用所需的四种酶、但尚未就在木糖上的生长经过适应的发酵单胞菌细胞中，能够选择NADPH依赖的木糖还原酶活性的有意失活，以利用仅包含木糖作为碳源的培养基。
即使在野生型葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)活性的存在下，也能够在仅包含木糖的培养基上立即生长，而不需适应步骤。在经工程化以表达所述木糖代谢途径中的第一个酶，木糖异构酶的发酵单胞菌细胞中，GFOR极大地有助于木糖醇的生产，因为它将木糖转化为木酮糖。与NADPH依赖的木糖还原酶将木糖直接还原为木糖醇相比，通过GFOR的木糖醇生产仅在木酮糖的源也存在时，在含葡萄糖的培养基的存在下发生，如US7,741,119中所公开的，该文献以引用方式并入本文。
在本发明的方法中，发酵单胞菌基因组的一种或多种醛糖还原酶编码基因的表达被破坏。在被完整测序的发酵单胞菌基因组中，有多个基因被注释为编码醛/酮还原酶。例如，在被测序的野生型运动发酵单胞菌ZM4菌株的基因组中(GenBank登录号AE008692；Seo等人，Nat.Biotechnol.23(1)，63-68(2005))，有至少四个编码推定的醛/酮还原酶的基因，它们被命名为ZMO0976、ZMO1344、ZMO1673、和ZMO1773。由ZMO1344、ZMO1673、和ZMO1773基因编码的蛋白质与ZMO0976编码的蛋白质(SEQID NO：2)分别具有24％、29％和38％的氨基酸序列同一性。最近被重新注释为醛/酮还原酶的两个另外的基因(ZMO062和ZMO1984)编码与ZMO976编码的蛋白质具有约32％同一性的蛋白质。醛/酮还原酶属于可溶性NAD(P)H氧化还原酶超家族，其主要功能是将醛和酮还原为初级和次级醇。醛糖还原酶，也被称为醛还原酶，被分类为EC1.1.1.21。本发明的方法和菌株涉及能够在NADPH(其被转化为NADP)存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶，该酶活性在本文中被称为NADPH依赖的木糖还原酶活性。
在运动发酵单胞菌菌株ZW1中仅导致ZMO0976基因的破坏的基因修饰，在本文的实例5中被显示使NADPH依赖的木糖还原酶活性降低了超过90％。因此，在本发明的方法中，用破坏了ZMO0976基因的基因修饰工程化了野生型运动发酵单胞菌菌株ZM4(ATCC#31821；ZW1是ZM4的另一名称)及其衍生物，该基因被鉴定在GenBank登录号AE008692的ZM4基因组序列中。当四种木糖途径的酶被引入了野生型ZM4时，这是提供在包含作为唯一糖类的木糖的培养基上生长的能力而排除了对木糖适应步骤的需求所需要的唯一基因修饰。在ZM4基因组(GenBank登录号AE008692)中被注释为编码醛/酮还原酶的其他基因，ZMO1344、ZMO1673、ZMO177、ZM0062、和ZMO1984，不在木糖的存在下显著地有助于无细胞提取物中的NADPH依赖的醛糖还原酶活性，如本文的实例5中所显示的。
ZMO0976基因具有SEQ ID NO：1的编码序列，其编码SEQ ID NO：2的蛋白质，该蛋白质在本文中被显示为具有NADPH依赖的木糖还原酶活性。野生型运动发酵单胞菌菌株NCIMB11163和ATCC10988具有与SEQID NO：1有100％核苷酸序列同一性的编码区，并且编码与SEQ ID NO：2有100％氨基酸序列同一性的蛋白质。运动发酵单胞菌菌株NCIMB11163和ATCC10988中的这些具有相同核苷酸序列的基因在本发明的方法中被破坏，以提供在包含作为唯一糖类的木糖的培养基上生长而不需对在木糖上的生长进行适应的能力。
发酵单胞菌的不同菌株中相当于ZMO0976的基因(它们可在本发明的方法中经受基因修饰)的序列可具有变化。因此，与SEQ ID NO：1具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％的核苷酸序列同一性的编码序列可在发酵单胞菌的不同菌株中代表ZMO0976基因。此外，与SEQ ID NO：2具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质可在发酵单胞菌的不同菌株中代表ZMO0976基因产物。在本发明的方法和菌株中，破坏了具有有这些特性的编码区的基因、或编码有这些特性的蛋白质的基因。
在其他发酵单胞菌菌种或菌株中，要实现使得能够在木糖上立即生长的总NADPH依赖的醛糖还原酶活性超过90％的降低，可能需要使编码具有NADPH依赖的木糖还原酶活性的蛋白质的多个基因失活。使用下文所描述的以及本领域中已知的其他的基因修饰方法，本领域的技术人员能够容易地通过实验确定，发酵单胞菌基因组序列中的哪个或那些被注释为醛/酮还原酶的基因应当被破坏，以获得NADPH依赖的木糖还原酶活性超过90％的降低。
用以破坏上文所述的NADPH依赖的木糖还原酶编码基因(即靶基因)的基因修饰，在本发明的方法中可以使用本领域的技术人员已知的任何方法，例如影响其mRNA或蛋白质的表达、或所编码的蛋白质的功能或稳定性的方法。基因修饰可以是，例如，编码区或基因的其他区域如启动子中的突变、插入、或缺失。方法包括但不限于：整个基因或其部分的缺失；向基因中(在启动子或编码区)插入DNA片段，使得所编码的蛋白质不能表达；向编码区中引入突变，突变的引入导致终止密码子的加入或移框，从而使功能性蛋白质不表达；以及向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，使得无功能的蛋白质被表达。使用已知的靶标NADPH依赖的木糖还原酶编码序列(例如SEQ ID NO：1)，以及靶标NADPH依赖的木糖还原酶编码序列周围的发酵单胞菌DNA序列，例如在完整的运动发酵单胞菌基因组序列(GenBank登录号AE008692)中可用的序列，本领域的技术人员可以容易地实施全部这些方法。
用于在编码NADPH依赖的木糖还原酶的靶基因中创建基因修饰的尤其适合的方法，如本文的实例3和4中所例示的，是使用界定了氯霉素抗性或其他标记基因的ZMO0976侧翼DNA序列介导的双交换同源重组，导致标记基因向靶标醛糖还原酶编码区中的插入，使得功能性的蛋白质不被表达。此外，标记基因可由位点特异性重组位点界定，使得在对应的位点特异性重组酶表达后将所述抗性基因从基因中切除。位点特异性重组留下了破坏醛糖还原酶编码基因的表达的重组位点。同源重组载体可被构建为在标记的切除之后同样留下醛糖还原酶编码基因中的缺失，如本领域的技术人员所熟知的。
在一个实施例中，本发明方法的步骤(b)和(c)，是通过将木糖利用代谢途径的一个或多个基因整合进编码NADPH依赖的木糖还原酶的内源性靶基因中从而破坏其表达，而同时进行的。在其他实施例中，木糖利用代谢途径的一个或多个基因的整合可以是在另一基因中，从而创建另外的基因修饰，如上文所述。
对于任何宿主细胞和在本发明的方法的任何步骤中，只要经工程化的木糖代谢途径提供了足够的碳流来支持生长，就不需要预先适应的过程来实现在包含作为唯一碳源的木糖的培养基上的立即生长。在用木糖利用代谢途径工程化的宿主细胞中，要提供所述生长性能，除了编码NADPH依赖的木糖还原酶活性的至少一种内源性基因使得活性降低超过90％的破坏之外，不需要另外的突变。然而，即使具有所述破坏，在含木糖的培养基中的进一步适应，能够通过对使通过工程化的木糖途径的碳流量增加的其他突变的天然选择，导致在木糖上更好的生长。在一个实施例中，所述破坏仅在ZMO0976基因中(例如在GenBank登录号AE008692中；如在SEQID NO：1中)。
附加的基因修饰
在一个实施例中，发酵单胞菌的野生型菌株被用作宿主细胞，用于引入木糖利用代谢途径和破坏编码NADPH依赖的木糖还原酶的至少一个内源性基因的基因修饰。在各种实施例中，所述宿主细胞或可利用木糖的发酵单胞菌细胞具有在本发明的方法的步骤(b)和/或(c)之前、同时、或之后进行的一个或多个附加的基因修饰。附加的基因修饰可包括改善菌株的任何修饰，例如使生长速率和/或细胞群增加、提高木糖的利用率和/或允许其他糖类的使用、提高对抑制性化合物如乙酸盐的耐受性、或提高乙醇的生产。这些基因修饰能够通过合理的设计被引入，或者它们能够通过使菌株在多种含木糖的生长培养基中进一步适应而通过随机突变和天然选择自发地发生。
在一个实施例中，发酵单胞菌细胞可以是针对US5,843,760(该文献以引用方式并入本文)中描述的阿拉伯糖的利用被附加地工程化的。为了运行阿拉伯糖的利用，除木糖利用途径的基因之外还表达的基因包括：1)使L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的L-阿拉伯糖异构酶，2)使L-核酮糖转化为L-核酮糖-5-磷酸的L-核酮糖激酶，和3)使L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(US5,843,760)。如US2011/0143408(该文献以引用方式并入本文)中所公开的，通过附加地表达阿拉伯糖-质子协同载体，例如通过表达来自araE基因的编码区，可实现改善的阿拉伯糖利用。
在另一个实施例中，编码整合宿主因子的α亚基的内源性himA基因经过了基因修饰以减少其表达，这改善了在包含乙酸盐的培养基中的生长，如US7,897,396中所述(该文献以引用方式并入本文)。乙酸盐存在于生物质水解产物中，因此当使用包含生物质水解产物的培养基时，对这种组分的提高的耐受性是所期望的。
在另一个实施例中，进行了降低葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)活性的基因修饰，如US7,741,119中所述(该文献以引用方式并入本文)。GFOR以及himA基因的表达的降低，可以是通过任何方法，例如上文关于降低醛糖还原酶活性所描述的那些。
在另一个实施例中，进行了增加核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性的基因修饰，如在作为US20120156746A1公布的共同拥有和共同未决的美国专利申请#13/161734中所公开的，该文献以引用方式并入本文。RPI表达的提高可通过提高内源性RPI编码基因的表达，例如用比天然启动子活性更高的启动子，或通过在发酵单胞菌中表达编码具有核糖-5-磷酸异构酶活性的任何蛋白质或多肽的异源性基因而实现。有两组核糖-5-磷酸异构酶，称为RPI-A和RPI-B，如美国专利申请13/161734，US20120156746A1中所述，二者中任何一种均可被表达。
在另一个实施例中，使用US7,989,206和US7,998,722(这些文献以引用方式并入本文)中所公开的突变的、高活性的启动子，表达了作为木糖利用代谢途径的部分被表达的木糖异构酶。本文所公开的突变体启动子是在SEQ ID NO：3的启动子的位置116具有G至T或位置217具有C至T的突变的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子(Pgap)。突变的更高活性的启动子包括SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和12。这些包括了在相当于SEQ ID NO：3中的116和217的位置有一个或全部两个突变的来自运动发酵单胞菌的不同菌株的变体启动子序列。
在另一个实施例中，作为木糖利用代谢途径的部分表达的木糖异构酶是包括在按照EC5.3.1.5鉴定的酶分类中的组I木糖异构酶，如共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US2011-0318801中所公开的。在其中公开了组I的木糖异构酶，例如从分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)的编码区(具有针对发酵单胞菌优化的密码子的编码区：SEQ ID NO：13)表达的，在发酵单胞菌中具有比组2的木糖异构酶更高的活性。在其中通过分子系统发育的生物信息学分析(使用如应用在PHYLIP中的PHYLIP邻接算法(Phylogeny Inference Package版本3.5c；Felsenstein(1989)Cladistics5：164-166)、GroupSim分析(Capra和Singh(2008)Bioinformatics24：1473-1480)、和剖面隐马尔科夫模型(使用HMMER软件包的hmmsearch算法；Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA)定义了组I的木糖异构酶。
尽管除降低在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性超过90％的一个之外，在木糖上的立即生长不需要其他的突变，在一个实施例中，本文所述的可利用木糖的细胞在包含作为碳源的木糖的培养基中的系列转移(在含木糖的培养基中的适应)，可被用于产生通过有利于木糖代谢的在其他基因中的突变的积累，由于自然选择而在木糖上生长得更好的新的菌株。在含木糖的培养基上的适应描述于美国专利7,223,575和美国专利7,741,119中，上述文献以引用方式并入本文。
本发明的细胞的特性
本发明的发酵单胞菌细胞具有生产乙醇的天然能力。此外，生长以提供菌株的所述细胞具有在NADPH存在下木糖至木糖醇的转化的天然醛糖还原酶活性超过90％的降低。此外，所述细胞具有木糖利用代谢途径，所述途径包括各自具有木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、或转醛醇酶酶活性的一系列多核苷酸编码的多肽。
在各种实施例中，本发明的菌株附加地具有在该菌株中是改善的一种或多种特性，例如提高的生长速率或细胞群的产生、提高的木糖利用率和/或其他糖类的使用、对抑制性化合物如乙酸盐的提高的耐受性、或提高的乙醇生产。这些特性是通过基因修饰赋予的，例如上文所描述的那些基因修饰。
用于生产乙醇的发酵
具有木糖利用途径和在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性降低超过90％的至少一种编码醛糖还原酶的破坏的基因的工程化发酵单胞菌菌株，可被用于发酵以生产乙醇。运动发酵单胞菌是天然的产乙醇菌。例如，描述了通过本发明的运动发酵单胞菌菌株生产乙醇。
对于乙醇的生产，使重组的利用木糖的运动发酵单胞菌与包含包括木糖的混合糖类的培养基接触。通常，培养基包含包括阿拉伯糖、木糖、和葡萄糖的混合糖类。所述培养基也包含包括这些糖的生物质水解产物，它们来源于经处理的纤维质或木质纤维质生物质。
当混合的糖的浓度高至足以抑制生长时，培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物，如US7,629,156中所公开的。半乳糖醇或核糖醇可代替或与山梨醇或甘露糖醇组合。运动发酵单胞菌培养基中生长，所述培养基中进行了发酵并且产生了乙醇。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至少约24小时，并且可运行30小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵可在约30℃和约37℃之间的温度、约4.5至约7.5的pH下进行。
可以在实验室规模的发酵罐中以及放大发酵中(在其中生产了商业规模量的乙醇)，在包含包括木糖在内的混合糖培养基中培养本发明的运动发酵单胞菌细胞。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例如，由本发明的运动发酵单胞菌菌株进行的大规模生产可以通过分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。
标准的分批体系的变型是补料-分批体系。分批补料培养方法也适用于本发明运动发酵单胞菌菌株的培养，并且其包括典型的分批系统，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO2的分压的改变来评估。分批和分批补料培养方法是常见的和本领域熟知的，例子可见于Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Crueger，Crueger，and Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA、或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，其以引用方式并入本文。
乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率达到最大的技术是工业微生物学领域熟知的，并且各种方法由上面Brock所述。
尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。使本发明的所期望的运动发酵单胞菌菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为约30°至约37℃，在回旋振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含类似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长直至OD600介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源如酵母提取物或大豆基产物(0-10g/l)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一种附加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/l)耗尽时将混合糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。使用苛性碱溶液(如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制在pH5.0-6.0。发酵罐的温度被控制在30℃-35℃。为使发泡最小化，根据需要向所述容器内加入消泡剂(任何类别基于硅氧烷的、基于有机物的等等)。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。
上述任何条件组和这些条件中在本领域为人所熟知的附加变化是通过木糖利用型发酵单胞菌菌株产生乙醇的合适条件。
实例
一般方法
运动发酵单胞菌的转化
采用电穿孔将复制的和非复制的质粒DNA引入了运动发酵单胞菌，基本上如US5,514,583中所述。简而言之，50μL的转化反应包含在10％(v/v)甘油中的～1010个细胞/mL和1-2μg的从大肠杆菌SCS110分离的未甲基化质粒DNA。对照反应进行相同处理，但是不接受任何质粒DNA。电穿孔仪的设置是1.6kv/cm、200Ω、和25μF，电击杯的间隙宽度是0.1cm。电穿孔之后，用MMG培养基(50g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L K2HPO4、和1mM MgSO4)稀释了转化反应，并使细胞在30℃恢复，然后将它们铺板在如所指示的有或没有抗生素的包含1.5％琼脂的MMG培养基(MMG琼脂平板)上。MMX琼脂平板与MMG琼脂平板是相同的，但是包含50g/L木糖而不是葡萄糖。在厌氧腔室中于30-33℃孵育平板，直到菌落出现。更多的细节描述在“实例”部分中。
运动发酵单胞菌ZW641和ZW658菌株的构建
从野生型亲本菌株ZW1开始，构建利用木糖的重组菌株ZW658的详细描述，提供在US7,741,084中(该文献以引用方式并入本文)。通过将包含编码区来自大肠杆菌基因的编码木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转醛醇酶(tal)、和转酮醇酶(tkt)的四种利用木糖的基因的两个操纵子PgapxylAB和Pgaptaltkt，通过顺序转座事件整合进ZW1(菌株ZM4的重命名；ATCC31821)的基因组，然后在含木糖的生长培养基上适应以产生菌株X13L3(其随后被重命名为ZW641，如US7,989,206中所公开的，该文献以引用方式并入本文)，构建了ZW658。ZW641在含木糖的生长培养基上的进一步适应产生了ZW658，其在木糖中生长得好得多，并根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏为ATCC PTA-7858。如在US7,989,206中所进一步公开的，由于在驱动染色体上整合的大肠杆菌XylA/B操纵子的运动发酵单胞菌Pgap启动子中的一个点突变，ZW658具有比ZW641更高的木糖异构酶活性。与ZW641中天然的Pgap(641GAP启动子)相比，该突变体启动子(SEQ ID NO：4)，本文中称为801GAP启动子或超级GAP启动子或PgapS，在位置116具有“T”而不是“G”。801Gap启动子是641Gap启动子的3至4倍强，并且在ZW641中木糖代谢的限速步骤是木糖异构酶。
摇瓶实验
除非另外指明，下文描述的全部实验均于33℃在摇瓶(15-mL松弛地盖着的圆锥形试管)中进行，使用包含葡萄糖和/或木糖作为碳源的合成培养基。mRM3-G10培养基包含10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4(7H2O)和100g/L葡萄糖。mRM3-X10培养基除包含100g/L木糖而不是葡萄糖之外是相同的。通过跟踪在600nm的光密度作为时间的函数的变化，以分光光度法监测了细胞的生长。在正文中和配图说明中，“OD”或“OD600”是指在600nm的光密度。在摇瓶生长实验过程中的所指示的时间，取出培养物的1.0-mL等分试样用于使用配备了折光率检测器的HP1100(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)的HPLC分析，以测定发酵液体培养基中存在的葡萄糖、木糖、木糖醇、核酮糖、甘油、乙酸盐和乙醇的浓度。在HPLC分析之前，离心移除细胞并通过0.22μm的乙酸纤维素Spin-X离心管过滤器(Costar，产品目录号8160)过滤上清液以移除小颗粒。在Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)上分离化合物，该柱子在55℃下，在等度条件下使用0.6mL/分钟的流速并使用0.01N H2SO4作为流动相。使用已知浓度的可靠标准品定量所关注的峰值，全部结果用g/l表示。
无细胞提取物的制备
使运动发酵单胞菌菌株ZW1和ZW1-AR1在25mL mRM3-G10生长至OD～2.8，通过以3,000×g(4℃)离心收集，迅速冷冻细胞沉淀物并储存在-80℃供后续使用。使用Bio101FastPrep FP120Cell Disrupter(ThermoSavant)，通过机械破碎制备了无细胞提取物；除如下文所述在室温进行的机械破碎步骤之外，全部的步骤均在0-4℃进行。使冷冻的细胞沉淀物解冻，用1.0mL包含12.5mM三乙醇胺盐酸盐(用KOH调节至pH7.5)、0.5mM EDTA、1mM二硫苏糖醇的裂解缓冲液洗涤三次，并最终重悬在0.8mL相同溶液中。将重悬的细胞转移至包含0.1mm二氧化硅微珠(MPBiomedicals，目录号9911-100)的2.0-mL裂解基质B管，并在FastPrepFP120中进行三个循环的细胞破碎，每一循环由以6m/秒进行的20-秒搅拌期和之后在冰上3-分钟的冷却期组成。然后以20,800×g离心裂解液10分钟，将所得到的上清液转移至新的管并以相同速度再离心60分钟。在下文描述的NADPH依赖的木糖还原酶活性测定中，将来自第二个离心步骤的上清液称为“无细胞提取物”。以牛血清白蛋白作为标准品，使用Coomassie(Bradford)Protein Assay Kit(Pierce Biotechnology，目录号23200)测定了无细胞提取物的蛋白质浓度。
NADPH依赖的木糖还原酶活性的测定
以木糖作为底物，对无细胞提取物中的NADPH依赖的醛糖还原酶活性的测量基本上如文献所述(Feldmann等人(1992)Appl Microbial Biotechnol.38：354-361)，有一些小的修改。测定于32℃在包含下列组分的0.5-mL石英比色杯中进行：400μL反应缓冲液(50mM三乙醇胺盐酸盐(pH7.5)和5mMMgSO4)、40μL无细胞提取物(其包含8-10mg蛋白质/mL)、10μL的10mMNADPH四环己铵盐和50μL的2M D-木糖。“无木糖对照”反应是相同的，但是去掉了木糖并代之以50μL的反应缓冲液。在340nm使用分光光度计法作为时间的函数测量了酶活性，使用6220M-1cm-1的消光系数来监测NADPH至NADP的转化。在对木糖的不存在下NADPH氧化的速率进行校正之后，将酶活性表示为mU/mg无细胞提取物蛋白质；1mU＝1纳摩尔形成的木糖醇每分钟。对野生型菌株ZW1而言，NADPH依赖的木糖还原酶活性的信噪比是～3.5(即，在木糖的存在下与“无木糖对照”反应相比NADPH消失的比率)。
实例1
经适应的利用木糖的发酵单胞菌菌株中ZMO0976突变的发现
对遗传上与野生型菌株ZM4(ATCC#31821)相同的运动发酵单胞菌野生型菌株ZW1以及ZW641和ZW658两种经适应的利用木糖的ZW1衍生物(关于菌株的构建参见“一般方法”)进行了比较基因组序列分析，以鉴定在木糖上的适应过程中发生的基因修饰(突变)。全基因组序列分析显示，在ZW641和ZW658菌株的适应过程中发生了多个突变。这些突变中包括在ZW1的编码区中78个核苷酸的缺失，这在ZW641和ZW658中均存在。在ZM4菌株的基因组序列(GenBank登录号AE008692)中，具有上述缺失的编码区被命名为ZMO0976。该ZMO0976编码区被注释为编码醛/酮还原酶。该缺失去除了ZMO0976的1023个核苷酸的全长编码区(包括终止密码子)(SEQ ID NO：1)的一个大的部分(相对于起始密码子的起点的核苷酸547至624)，得到了SEQ ID NO：14。
实例2
具有ZMO0976突变的另外的利用木糖的发酵单胞菌菌株
通过引入木糖利用途径的基因和在含木糖的培养基上适应，获得了两种另外的利用木糖的菌株，如下文所述。
用于使用靶向整合构建利用木糖的运动发酵单胞菌菌株的载体构建体
通过将嵌合的xylA、xylB、tal、和tkt基因引入ZW1菌株，构建了新的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株。xylB、tal、和tkt编码区是来自如在“一般方法”中描述的ZW658菌株中的大肠杆菌基因。xylA编码区是来自密苏里游动放线菌(AMxylA)，其公开于共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US2011-0318801中(该文献以引用方式并入本文)，编码具有比运动发酵单胞菌中的大肠杆菌木糖异构酶更高的活性的酶。AMxylA的编码区是针对在运动发酵单胞菌中的表达经密码子优化的(SEQ ID NO：13)。还引入了运动发酵单胞菌rpi和rpe基因的附加的拷贝，以提高核糖-5-磷酸异构酶(RPI)和核酮糖-磷酸-3-差向异构酶(RPE)活性。设计了双交换(DCO)转化载体，以特异性地将嵌合基因整合进运动发酵单胞菌基因组中的靶标区域。
使用了标准的分子重组方法构建DCO(双交换)自杀整合载体。为了在运动发酵单胞菌中表达木糖异构酶和木酮糖激酶，构建了10,250-bp DCO自杀载体pZX21(SEQ ID NO：15；图3A)。该载体具有pBluescript主链，其包含针对大肠杆菌的复制起点但没有运动发酵单胞菌复制起点，因此它不能在运动发酵单胞菌中增殖，使得它是自杀载体。它包含来自编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的运动发酵单胞菌基因的DNA序列，GFO-L和GFO-R，侧接待整合的序列。两种片段均是使用运动发酵单胞菌基因组DNA作为模板，通过PCR合成的。1,186-bp GFO-L片段(SEQ ID NO：16)包括gfor编码序列(SEQ ID NO：17)的前654bp(从nt-1至nt-653)和533bp的上游基因组序列。1,446-bp GFO-R片段(SEQ ID NO：18)包括GFOR编码序列的后480bp(从nt-823至nt-1302)和966bp的下游基因组序列。GFO-L和GFO-R指导向gfor基因座中的整合，替换了运动发酵单胞菌基因组中gfor编码序列的片段(从nt-655至nt-822)。这破坏了葡萄糖-果糖氧化还原酶的表达，这降低了木糖醇的生产和提高了乙醇的生产，如US7,741,119中所公开的，该文献以引用方式并入本文。
pZX21中介于GFO-L和GFO-R之间的区域包括三个嵌合基因。一个是包含304-bp运动发酵单胞菌超级GAP启动子(PgapS；描述于US7,989,206中)、1,185-bp密苏里游动放线菌(A.missouriensis)xylA编码序列(AMxylA)和具有5’Xbal位点的166-bp大肠杆菌araD3’UTR(ECaraD3’UTR)的1,661-bp嵌合的xylA基因(SEQ ID NO：19)。AMxylA编码区是针对在运动发酵单胞菌中的表达，按照运动发酵单胞菌ZM4的密码子偏好性，经密码子优化的(SEQ ID NO：13)。ECaraD3’UTR来自大肠杆菌araBAD操纵子。第二个基因是1,960-bp嵌合的xylB基因(SEQ ID NO：20)，包含191bpPeno、1,455-bp大肠杆菌xylB编码序列(ECxylB)和314-bp大肠杆菌xylB3’UTR(ECxylB3’UTR)。Peno是来自运动发酵单胞菌基因组DNA的强组成型启动子，具有Pgap大约28％的活性。第三个基因是由lox位点限定的1,014bp aadA标记(用于奇放线菌素抗性；Spec-R)(SEQ ID NO：21)。该标记能够通过表达Cre重组酶在整合之后被移除。
为了在运动发酵单胞菌中表达转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-P-异构酶、和D-核酮糖-P-3-差向异构酶，构建了12,198-bp DCO穿梭载体pZX52(SEQ ID NO：22；图3B)。该载体是基于载体pZB188(Zhang等人(1995)Science267：240-243；US5,514,583)的发酵单胞菌-大肠杆菌(Zymomonas-E.coli)穿梭载体，其包括包含允许该载体在发酵单胞菌细胞中复制的复制起点的2,582bp运动发酵单胞菌基因组片段、和909-bp大肠杆菌复制起点(Ori)。它具有911bp的氯霉素抗性标记(Cm-R)，用于大肠杆菌或运动发酵单胞菌转化体的选择。pZX52包含来自编码乳酸脱氢酶的运动发酵单胞菌ldhA基因的DNA序列、待整合的序列侧翼的LDH-L(875bp；SEQ IDNO：23)和LDH-R(1,149bp；SEQ ID NO：24)。这些序列指导在运动发酵单胞菌基因组中在核苷酸#493和#494之间向ldhA编码序列(SEQ ID NO：25)中的整合，从而破坏了乳酸脱氢酶的表达。
pZX52中介于LDH-L和LDH-R之间的区域包括两个嵌合的操纵子。第一个是3,339bp PgapT-Tal-Tkt操纵子(SEQ ID NO：26)，包含运动发酵单胞菌GAP启动子的304-bp T突变体(PgapT)、954-bp大肠杆菌Tal编码区(ECTal)、1,992-bp大肠杆菌Tkt编码区、和68-bp大肠杆菌Tkt3’UTR(ECTkt3’UTR)。除了PgapT启动子(SEQ ID NO：27)之外，该操纵子是与天然存在的大肠杆菌Tal-Tkt操纵子相同的，PgapT启动子是与天然的Pgap(SEQ ID NO：3)相比在位置83具有“G”至“A”的变化和在位置285的“T”缺失的Pgap。另一嵌合的操纵子是1,443bp Peno-Rpi-Rpe操纵子(SEQID NO：28)，包含191bp Peno、第一密码子变为ATG的471bp运动发酵单胞菌Rpi编码序列(SEQ ID NO：43)(ZMRpi)、663bp运动发酵单胞菌Rpe编码序列(ZMRpe)、和35bp大肠杆菌xylA3’UTR(ECxylA3’UTR)。
构建了称为pZX6(SEQ ID NO：29；图3C)的另一个DCO穿梭载体。这种12,704bp的载体是用来自编码多核苷酸磷酸化酶的运动发酵单胞菌pnp基因的序列替换了LDH-L和LDH-R序列的pZX52的修改形式。1,318bpPNP-L片段(SEQ ID NO：30)是pnp编码序列(SEQ ID NO：42)从nt-767至nt-2,084的片段，而1,225bp PNP-R片段(SEQ ID NO：31)包括pnp编码序列的最后59bp(从nt-2189至nt-2247)和1,166bp的下游基因组序列。因此，pZX6能够指导PgapT-Tal-Tkt操纵子和Peno-Rpi-Rpe操纵子在靠近pnp编码序列末端处向内源性pnp基因内的整合和替换运动发酵单胞菌基因组中pnp编码序列的片段(从nt-2,084至nt-2,188)。
利用木糖的运动发酵单胞菌菌株的开发
用两种质粒在两个步骤中转化了ZW1菌株。ZW1的感受态细胞通过在30℃、150rpm振荡条件下在mRM3-G5(1％酵母提取物，15mMKH2PO4，4mM MgSO4，和50g/L葡萄糖)中培养种子细胞过夜至OD600值接近5进行制备。收获细胞并将其重悬在新鲜培养基中至OD600值为0.05。细胞在相同条件下生长至对数期的早期至中期(OD600接近0.5)。收获细胞并用冰水洗涤两次，然后用冰冷的10％甘油洗涤一次。收集所得到的感受态细胞并重悬在冰冷的10％甘油中至OD600值接近100。由于运动发酵单胞菌的转化需要非甲基化的DNA，将DCO质粒pZX21、pZX52、和pZX6各自转入了大肠杆菌SCS110感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。对于每一转化，使转化的细胞的一个菌落在10mL LB-Amp100(包含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基)中于37℃生长过夜。使用QIAprep Spin DNAMiniprep Kit(Qiagen)，从10mL培养物制备了DNA。
将大约1μg非甲基化的pZX21DNA与50μL ZW1感受态细胞在1MM电穿孔杯(VWR，West Chester，PA)中混合。在2.0KV下使用BT720Transporater Plus(BTX-Genetronics，San Diego，CA)将质粒DNA电穿孔到细胞中。转化细胞在30℃下，在1mL MMG5培养基(10g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，2g/L K2HPO4，和1mM MgSO4)中恢复4小时，并且在30℃下，在带有AnaeroPack(Mitsubishi Gas Chemical，New York，NY)的厌氧广口瓶内的MMG5-Spec250平板(具有250mg/L的奇放线菌素和15g/L的琼脂的MMG5)上生长3天。
由于pZX21是DCO自杀载体，存活的SpecR菌落具有整合进gfor基因座的PgapS-AMxylA：：Peno-ECxylB：：Spec-R片段。菌落被划线接种并生长在新鲜的MMG5-Spec250平板上，然后对其进行PCR以检测嵌合基因的整合。第一次PCR使用正向引物ara285(SEQ ID NO：32)和反向引物ara120(SEQ ID NO：33)来检测pZX21中GFO-L片段介导的双交换重组。ara285引物匹配基因组中GFO-L片段上游494bp的运动发酵单胞菌基因组序列片段，而ara120与pZX21中PgapS的最后18bp和AMxylA的前17bp互补。如果整合如所设计的发生，PCR将从转化体扩增出1,903bp片段。第二次PCR使用正向引物ara46(SEQ ID NO：34)和反向引物ara274(SEQ ID NO：35)来检测pZX21中GFO-R片段介导的双交换重组。ara46引物是靠近pZX21中SpecR基因末端的序列，而ara274与GFO-R片段83bp下游的运动发酵单胞菌基因组DNA的片段互补。这次PCR将从具有成功的整合的菌落扩增出1,864-bp片段。两项检测均产生了所预期的PCR产物，从而确认了准确的转基因整合。所得到的菌株被命名为ZW1-pZX21。
在第二个步骤中，用pZX52转化了ZW1-pZX21，并在MMG5-Spec250-CM120(具有120mg/L氯霉素的MMG5-Spec250)平板上进行选择。因为pZX52是具有用于质粒选择的CmR标记和无标记整合片段(PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe)的DCO穿梭载体，回收的菌落应当不仅在运动发酵单胞菌基因组中包含早先整合的构建体PgapS-AMxylA：：Peno-ECxylB：：Spec-R，而且在增殖的pZX52质粒中包含非整合的构建体PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe。这些转化体应当具有木糖利用途径全部所需的基因。为了证明全部的转基因在运动发酵单胞菌中是功能性的，在木糖中对十个选择的菌落进行了48小时的生长测定。在该测定中，用选择的菌落接种了14mL Falcon聚丙烯圆底管中的2mL mRM3-G5-Spec200-CM120(具有200mg/L奇放线菌素和120mg/L氯霉素的mRM3-G5)，并于30℃以150rpm摇动培养过夜。盖紧管子，但是用23G1针在盖子顶部刺一个孔，用于在细胞生长和发酵期间释放压力。收集细胞，用MRM3X10(具有100g/L木糖的MRM3)洗涤，并重悬在mRM3-X10-Spec200-CM120(包含200mg/L奇放线菌素和120mg/L氯霉素的mRM3-X10)至具有0.1的起始OD600。将五毫升的悬浮液置于新的14mL Falcon聚丙烯圆底管中。用顶部有一孔的盖盖上管子。使细胞在30℃以150rpm摇动生长48小时，在Shimadzu UV-1201分光光度计上测量OD600。然后以10,000×g离心1mL培养物以除去细胞。将上清液滤过0.22μm的Costar Spin-X离心管过滤器(Corning Inc，Corning，NY)并通过Agilent1100HPLC系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)上的BioRad Aminex HPX-A7H离子排阻柱(BioRad，Hercules，CA)，在55℃以0.6mL/分钟的0.01N H2SO4流速，针对木糖和乙醇进行分析。结果表明，全部10种转化体均已获得了用于生产乙醇的木糖利用途径。新的菌株被命名为ZW1-pZX21-pZX52，并将培养物之一用于进一步的实验。
然后，使ZW1-pZX21-pZX52依次经受了三个转化后实验程序，以整合PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体。
(1)使菌株在木糖上适应。在该实验程序中，将ZW1-pZX21-pZX52以0.2的起始OD600值悬浮在5-mL mRM3-G1X9-Spec200-CM120培养基(具有10g/L葡萄糖、90g/L木糖、200mg/L奇放线菌素和120mg/L氯霉素的MRM3)中，并于30℃生长，以倍增3至4次(OD600值从0.2升至2；传代一次)。然后将培养物稀释至起始OD600值并进行另一代的生长。总共完成了4次传代(大约15次倍增)。
(2)通过使10μL的适应细胞池于较高的温度(37℃)在2mL mRM3-G5-Spec200培养基中生长过夜，进行了PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体的质粒消除和整合。然后，将10μL培养物稀释在2mL mRM3-G5-Spec200培养基中并再生长一代。总共在葡萄糖培养基中于37℃进行了5次传代。作为高温度生长的结果，群体中的大多数应当不再具有pZP52质粒，但PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体(缺少选择性标记)应当已被整合进运动发酵单胞菌基因组的ldhA基因。群体中的少数可能维持了pZX52，没有整合。
(3)通过使50μL的细胞池于30℃在2mL mRM3-X10-Spec200中生长过夜，富集了群体。使富集的群体于30℃在MMG5-Spec250平板上生长过夜。选择单独的菌落并以重复形式划线接种至MMG5平板和MMG5-CM120平板上。于30℃过夜孵育之后，选择在MMG5上生长但不在MMG5-CM120上生长的那些菌落用于进一步的PCR检测。第一次PCR使用正向引物ara45(SEQ ID NO：36)和反向引物ara356(SEQ ID NO：37)来检测pZX52中LDH-L片段介导的双交换重组。ara45引物匹配基因组中LDH-L片段86bp上游的运动发酵单胞菌基因组DNA片段，而ara356与pZX52中ECTal编码区的片段(从nt-91至nt-112)互补。如果整合如所设计的发生，PCR将从所述菌落扩增出1,383bp片段。第二次PCR使用正向引物ara354(SEQ ID NO：38)和反向引物ara43(SEQ IDNO：39)来检测pZX52中LDH-R片段介导的双交换重组。ara354引物是靠近pZX52中ZMRpe的3′端的序列。ara43引物与LDH-R片段122bp上游的运动发酵单胞菌基因组DNA的片段互补。当重组如所预期的发生时，PCR将从所述菌落扩增出1,468bp片段。两次PCR产生了具有预期大小的DNA片段，这确认了在所检测的全部菌落中，PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体均已如所设计的正确地整合。所得到的菌落被命名为ZW1-X109。
在第二种方法中，用pZX6DCO穿梭载体转化了ZW1-pZX21菌株，并如上文关于ZW1-X109所描述的进行了包括木糖适应步骤在内的三个转化后实验程序，不同的是适应进行了10次传代而不是4次传代。因此，PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体被靶向至内源性pnp基因。如关于ZW1-X109的构建所描述的，在三个转化后实验程序之前，进行了48小时生长测试，以确保全部的转基因如所预期的起作用。在三个转化后实验程序之后，同样通过PCR检测了整合。第一次PCR使用正向引物ara340(SEQ ID NO：40)和反向引物ara356(SEQ ID NO：37)来检测pZX6中PNP-L片段介导的双交换重组。ara340引物匹配PNP-L片段75bp上游的运动发酵单胞菌基因组DNA。所使用的ara356引物与pZX6中ECTal的片段(从nt-91至nt-112)互补。如对于正确的整合事件所预期的，PCR从转化体产生了1,815-bp的片段。第二次PCR使用正向引物ara354(SEQ ID NO：38)和反向引物ara339(SEQ ID NO：41)来检测pZX6中PNP-R片段介导的双交换重组。在这种情况下，ara354引物匹配pZX6中靠近ZMRpe的3′端的序列，而ara339引物与PNP-R片段序列59bp下游的运动发酵单胞菌基因组DNA片段互补。PCR从转化体扩增出1,549bp的片段，该大小是成功的整合所预期的。因此，PCR检测确认了在所检测的全部菌落中，PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体均已被正确地整合。新的菌株被命名为ZW1-X210。
概括地说，从野生型ZW1重新构建了两种利用木糖的运动发酵单胞菌菌株。它们均具有整合进gfor基因座的PgapS-AMxylA：：Peno-ECxylB：：Spec-R构建体。ZW1-X109菌株具有整合进IdhA基因座的PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体，而ZW1-X210菌株具有整合进内源性pnp基因的相同构建体。两种菌株在整合的PgapS-AMxylA：：Peno-ECxylB：：Spec-R构建体中均具有一个标记基因，其能够通过Cre重组酶的引入被移除。
新的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株的表征
在20mL mRM3-X10中进行了摇瓶发酵，以测定每一菌株利用木糖的能力。在0、24、48、和72小时测定了OD600值以及木糖和乙醇浓度。图4是ZW1-X109(A)、ZW1-210(B)和ZW1(C)的结果的总结。该结果确认了两种新菌株均能够发酵木糖。在72小时的发酵后，ZW1-X109已利用了大约64.2％的木糖(从105.6g/L减少至37.8g/L)来支持31.5g/L的乙醇滴度和达到3.51的OD600值的生物质生长；ZW1-X210已利用了几乎全部可用的木糖(从105.6g/L减少至1.6g/L)来支持48.5g/L的乙醇滴度和达到5.22的OD600值的生物质生长。然而，ZW1由于缺少木糖代谢途径，不能在mRM3-X10中生长。因此，在新菌株之中，ZW1-X210能够在含木糖的单种糖培养基中比ZW1-X109更快地发酵木糖。ZW1-X109和ZW1-X210之间的主要差异是PgapT-ECTal-ECTkt：：Peno-ZMRpi-ZMRpe构建体在ZW1-X109中插入至ldhA基因座，而在ZW1-X210中插入至内源性pnp基因。该结果表明，pnp基因的破坏可有利于运动发酵单胞菌中的木糖代谢。
对ZW1-X109和ZW1-X210菌株的基因组进行了测序，并与如实例1中所述的ZW1基因组序列进行了比较。差异之中包括两个菌株中ZMO0976编码区内的序列变化。在ZW1-X109中，在所述编码区序列的位置917有G至A的突变(在SEQ ID NO：1天然ZMO0976序列中)。该突变使密码子306从TGG(编码色氨酸)变为TAG终止密码子，这通过在C末端除去35个氨基酸缩短了天然的340个氨基酸编码的蛋白质(SEQ IDNO：2)。在ZW1-X210菌株中，有一个大的缺失，其包括了ZMO0976启动子区域的125个核苷酸并延伸穿过了编码区的475个核苷酸。
实例3
用于在ZW1中敲除ZMO0976基因的自杀构建体的生成
为了直接评估ZMO0976突变单独对野生型ZW1菌株中木糖醇生产的影响，如下文所述生成了能够使该基因插入失活的自杀构建体。
pMODlinker-Cm的构建
在被设计用于使运动发酵单胞菌中的ZMO0976基因(Seo等人(2005)Nature Biotechnol.23：63-68)插入失活(“敲除”)的自杀构建体(pAR-cm)的构建中，pMODlinker-Cm(图5)是重要的质粒中间体。赋予对氯霉素的抗性(Cmr)的DNA片段被插入至pMOD-Linker-Spec质粒(其详细描述于U.S.7,989,206中)的NotI和PacI位点之间，替换了赋予对奇放线菌素的抗性(Specr)的DNA片段，如下文所述。用PacI和NotI顺序消化了pMOD-Linker-Spec，从1％琼脂糖凝胶纯化了2.6kb的载体DNA片段。然后，使用引物Cm-F-NotI(SEQ ID NO.44；NotI位点带下划线)和引物Cm-R-PacI(SEQ ID NO：2；PacI位点带下划线)，从可商购获得的质粒pACYC184(Boca Scientific，Boca Raton，FL)PCR扩增了Cmr基因及其所关联的启动子。
引物Cm-F-NotI(SEQ ID NO：44)：
CATCTTACTGCGGCCGCGTGACGGAAGATCACTTCGCAG
引物Cm-R-PacI(SEQ ID NO：45)：
TCACTCATTTAATTAACTTATTCAGGCGTAGCACCAG
同样用PacI和NotI切割了0.9kb的PCR产物，将纯化的DNA片段连接至上文描述的PacI/NotI切割的载体片段，以产生pMODlinker-Cm(图5)。该3525bp的质粒具有侧翼为loxP的Cmr盒，其位于Tn5转座酶与其相互作用以形成转座体的两个嵌合末端(ME)之间。
质粒pAR-cm的构建
自杀构建体(pAR-cm)被用于通过宿主介导的双交换同源重组敲除ZW1中的ZMO0976基因。用于该操作的质粒是与之前用于敲除ZW801-4中himA基因的自杀构建体(pHimA)相似的。pHimA的构建详细描述于US7,897,396中，该文献以引用方式并入本文。为了生成用于本发明中的pAR-cm自杀构建体(图6A)，用5’-和3’-ZMO0976侧翼的DNA片段替换了pHimA中5’-和3’-himA侧翼的DNA片段，以将选择性标记和双交换事件靶向染色体的ZMO0976基因。此外，用侧翼为loxP的氯霉素抗性(Cmr)盒替换了pHimA中侧翼为loxP的奇放线菌素抗性(Specr)盒。生成pAR-cm需要四种纯化的DNA片段，如下文所述。
片段1是通过用四种不同的限制性酶：NotI、BsaI、SbfI和AscI，切割先前描述于US7,897,396中的质粒pLDHSp-9WW而从该质粒获得的。NotI在nt2647切割pLDHSp-9WW，而BsaI在nt1816切割该质粒。在用上述四种限制性酶完全消化了该质粒DNA之后，通过用1％琼脂糖凝胶进行的电泳和Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(目录号D4001，ZymoResearch)，纯化了2666bp的SbfI-AscI DNA片段。被称为片段1的该片段包含在运动发酵单胞菌中非功能性的大肠杆菌复制起点，和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的基因。
片段2对应于在pMODlinker-Cm(图5)中位于FseI和AsiSI位点之间的1002bp的DNA片段。如上文所述，该DNA片段包含侧翼为两个野生型loxP位点(每个末端一个)的Cmr盒。SEQ ID NO：46中给出了片段2的完整DNA序列。
片段3包含3’-ZMO0976侧翼的DNA。该～1.2Kb的DNA片段是使用引物A(SEQ ID NO：47)和B(SEQ ID NO：48)通过PCR产生的。用于PCR扩增的模板是使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(目录号#A1125，Promega)从ZW658(ATCC#PTA-7858)分离的基因组DNA。
引物A(SEQ ID NO：47)：
CTACTCATcctgcaggCTTCTCGGTGATCGTGTTGC
引物B(SEQ ID NO：48)：
TCACTCATggccggccGAACAGATCGACGGTATTGATG
引物A(正向引物)的带下划线的碱基在假定蛋白(ZMO0975基因的产物)的编码区的中间与ZMO0976编码区的下游结合，而小写字母对应于被添加至引物5′端的SbfI位点。引物B(反向引物)的带下划线的碱基与ZMO0976开放阅读框的3′端杂交，而小写字母对应于被添加至引物5′端的FseI位点。引物A和B的染色体结合位点和所产生的PCR产物显示在图6B中。用SbfI和FseI消化了PCR产物，然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化了所得到的1168bp片段，如上文所述。
片段4包含5’-ZMO0976侧翼的DNA。该～1.1kb的DNA片段是使用引物C(SEQ ID NO：49)和D(SEQ ID NO：50)通过PCR产生的。用于PCR扩增的模板是使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(目录号#A1125，Promega)从ZW658(ATCC#PTA-7858)分离的基因组DNA。
引物C(SEQ ID NO：49)：
CATCTTACTgcgatcgcGATCAATCGCCCGATGAATG
引物D(SEQ ID NO：50)：
CATCTTACTggcgcgccTCGCCGTATTGTATCGCTG
引物C(正向引物)的带下划线的碱基与ZMO0976开放阅读框的5′端杂交，而小写字母对应于被添加至引物5′端的AsiSI位点。引物D(反向引物)在编码推定的“外周胞质结合蛋白”基因的开放阅读框的中间与ZMO0976基因的上游杂交，而小写字母对应于被添加至引物5′端的AscI位点。引物C和D的染色体结合位点和所产生的PCR产物显示在图6B中。用AsiSI和AscI消化了PCR产物，通过使用1％琼脂糖凝胶的电泳纯化了所得到的1086bp片段。
然后，将上文所述的四种DNA片段用于4方连接反应，以装配ZMO0976敲除构建体(pAR-cm)，其显示在图6A中。用于该反应的片段#1-#4的摩尔比为大约1∶1∶1∶1。连接反应混合物的等分试样被电穿孔进大肠杆菌DH10B，并将转化的细胞铺板在包含氯霉素(25μg/mL)的LB培养基上。然后在37℃孵育平板。使用引物A/引物D，首先通过菌落PCR鉴定了包含具有正确大小插入序列的质粒的氯霉素抗性转化体。随后通过对来自PCR阳性克隆的pAR-cm质粒DNA的DNA序列分析确认了阳性克隆。
为了获得运动发酵单胞菌的转化所需的非甲基化的质粒DNA，将pAR-cm引入了大肠杆菌SCS110(dcm-，dam-)，并将转化的细胞铺板在包含氯霉素(25μg/mL)的LB培养基上；生长是在37℃进行。用于该操作的化学感受态细胞是从Stratagene(目录号200247)获得的，并采用了供应商的规程。重要的是注意到，将非甲基化的质粒DNA用于来源于ZM4的运动发酵单胞菌菌株的转化对于成功是至关重要的，因为从大肠杆菌的野生型菌株如DH10B分离的甲基化的质粒DNA将被宿主的限制/修饰系统轻易地破坏。在最后一个步骤中，使用QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit(目录号12943)从SCS110转化体之一分离了质粒DNA，DNA的最终浓度是～1.5μg/μL。
实例4
ZW1ZMO0976敲除突变体的生成
为了使ZW1中的ZMO0976基因失活，利用电穿孔将非甲基化的pAR-cm质粒DNA(其不在运动发酵单胞菌中复制)引入了ZW1感受态细胞，如“一般方法”部分所描述的。在于1.0mL MMG培养基中3小时的恢复期之后，通过离心(13,000×g进行1分钟)收集了转化的细胞，并将细胞沉淀物重悬在300μL的MMG培养基中。然后将细胞悬浮液的等分试样铺板在包含120μg/mL氯霉素的MMG琼脂平板(MMG/Cm120平板)上，于33℃在厌氧条件下孵育平板3天。随机选择了所得到的氯霉素抗性菌落中的两个用于进一步的操作。将两个菌落划线接种在MMG/Cm120平板上并孵育24小时，如上文所述。然后将新的菌斑重新划线接种在新鲜的MMG/Cm120平板上，在相同条件下24小时的生长期之后，将所得到的细胞斑块用于进一步的分析，如下文所述。
如US7,897,396中所述，运动发酵单胞菌染色体与自杀构建体之间初始的相互作用是在两段侧翼DNA序列中的一段发生的单交换事件，单交换事件最终导致了双交换事件。向双交换的转变通常是非常迅速的(除非该事件是致死的或导致更慢的生长速率)，并且通常在包含针对自杀构建体的选择剂(在这个例子中是氯霉素)的液体或固体培养基中的一些系列转移之后发生。在所选择的两个菌株中，为了确认pAR-cm自杀构建体的确在ZW1染色体中的正确位置发生了双交换事件，使用三对不同的引物(引物E/引物F、引物G/引物H、引物I/引物J)进行了菌落PCR实验。
引物E(SEQ ID NO：51)：
CTACTTCACTTCATGACCGG
引物F(SEQ ID NO：52)：
AGTCATGCaggcctCTGATGAATGCTCATCCGGAA
引物G(SEQ ID NO：53)：
GTCTGACGTTGATCCTGATC
引物H(SEQ ID NO：54)：
TCACTCATggccggccTGCGTATAATATTTGCCCATGG
引物I(SEQ ID NO：55)：
GTTCCTGCTTTGCTTTTGTGG
引物J(SEQ ID NO：56)：
CCCGGAAGCTATCAAAATTTTG
引物E、I、J、和G在图7中显示的位置与运动发酵单胞菌染色体杂交。引物F和H的带下划线的碱基与在所期望的双交换事件发生之后插入至染色体中的氯霉素抗性(Cmr)盒杂交(图7)。采用引物E和F的1921bpPCR产物表明正确的单交换事件在ZMO0976基因的一个末端发生，而采用引物G和H的1942bp PCR产物表明正确的单交换事件在另一个末端发生。如果发生了正确的双交换事件，引物I和J只能够产生单种1763bp的PCR产物。相比之下，这对引物与野生型ZW1菌株或尚未完成从单交换事件向双交换事件的转变的转化体的混合群体一起将产生1468bp的PCR产物。使用引物I和J，1763bp的PCR产物的存在和1468bp的PCR产物的不存在指示了具有所期望的双交换事件的ZMO0976敲除突变体的同质群体。使用上文描述的PCR策略，选择用于进一步分析的两个菌落均被显示是真实的双交换事件，这两个菌株被命名为AR1和AR2。
实例5
ZMO0976的插入失活在体内对木糖醇的生产和在无细胞提取物中对 NADPH依赖的木糖异构酶活性的效应
为了测试野生型ZMO976基因编码在活细胞中能够将D-木糖转化为木糖醇的酶的可能性，在于同时包含葡萄糖和木糖合成培养基中生长期间对野生型ZW1和两种ZW1/ZMO0976敲除突变体(AR1和AR2)监测了木糖醇的形成。使用于该实验的种子培养物于33℃在7mL的80g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、和1g/L MgSO2(7H2O)中生长至OD600为～1.8。然后，将种子培养物的等分试样用于接种包含60g/L葡萄糖、20g/L木糖、10g/L酵母提取物、6g/L KH2PO4、1g/L MgSO2(7H2O)、和2.5g/L(NH4)2SO4的10-mL培养物；用浓氢氧化钾将最终的pH调节至pH5.9。使培养物在33℃生长，初始的OD600值为～0.11。使用“一般方法”部分所描述的方法，在生长的0、15.5、39、60、和112小时，移取了培养物的1.0-mL等分试样，用于采用配备了折光率检测器的HP1100(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)的HPLC分析，以测定发酵液体培养基中存在的木糖醇的浓度。
如图8中所显示的，就野生型ZW1而言的木糖醇生产的速率和程度都比就两种ZW1/ZMO0976敲除突变体而言的高得多。例如，在实验的前40个小时中，对于AR1和AR2，发酵液体培养基中的木糖醇的量低于HPLC的检测水平，即～0.1g/L。而在实验结束时，野生型ZW1已产生了为所述ZW1/ZMO0976敲除突变体中任何一种的～3至4倍的木糖醇；对AR1和AR2分别为0.736g/L对0.254g/L和0.19g/L。应当指出的是，由AR1和AR2产生的木糖醇的较低的量不是较低细胞密度的结果：在全部的葡萄糖已被消耗后的39小时时间点，与就野生型ZW1而言的6.25相比，就AR1和AR2而言的OD600是7.29和6.98。
在上述实验中由野生型ZW1产生的木糖醇的量类似于先前针对携带对照质粒pZB188/Kan的相同菌株在可比较的实验条件下所报道的值(US7,741,084中的图14A)。然而，这些值与当木糖异构酶表达质粒pZB188/Kan-XylA被引入野生型ZW1时生成的木糖醇的量相比低至少3倍(US7,741,084中的图14B)。当木糖能够被木糖异构酶转化为木酮糖时观察到的较大量的木糖醇是此时能够继而将木酮糖转化为木糖醇的葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的结果。如US7,741,084中所描述的，GFOR是体内木糖醇的形成的主要贡献者，但只有在葡萄糖存在并且木酮糖的来源是可用的时。图8中的结果清楚地展示了ZMO0976基因产物也是体内木糖醇的生产的重要贡献者。然而，同样明显的是，该基因的失活没有彻底地消除体内的木糖醇生产，即使是在GFOR介导的用于木糖醇的途径在其中由于木糖异构酶在野生型菌株ZW1中的不存在而不起作用的条件下。为了提供ZMO0976基因产物能够催化木糖至木糖醇的转化的直接证明，对于野生型ZW1以及对于AR1制备了无细胞提取物，并测量了NADPH依赖的木糖还原酶活性。无细胞提取物的制备和用于该实验的分光光度法酶测定描述于“一般方法”部分。就野生型ZW1而言，NADPH依赖的木糖还原酶活性的比活性在所采用的条件下是14mU/mg。形成显著对比的是，就ZW1/ZMO0976敲除突变体而言，NADPH依赖的木糖异构酶活性是不能被检测到的。实际上，在从AR1菌株制备的无细胞提取物中，NADPH消失的速率在木糖的不存在下比在木糖的存在下略快。因此，从该实验可得出的保险结论是ZW1中的ZMO0976基因产物的消除使NADPH依赖的木糖还原酶活性降低了超过90％。
实例6
ZMO0976的失活使得能够在木糖上立即生长而无需适应以及能够在木 糖上针对木糖利用途径进行直接选择
为了测试功能性ZMO0976基因构成了携带木糖代谢所需的四种基因的运动发酵单胞菌重组菌株在木糖上的生长的非允许条件这一假说，将质粒pZB4引入了野生型ZW1和ZW1/ZMO976敲除突变体AR1。如US5,514,583实例3中所描述的(该文献以引用方式并入本文)，pZB4是在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制的多拷贝穿梭载体。除作为选择性标记的四环素抗性盒之外，该质粒还包含从两个合成嵌合操纵子表达的、完成用于发酵单胞菌的木糖代谢途径所需的四个基因。操纵子之一包含处于运动发酵单胞菌Pgap启动子控制下的大肠杆菌木糖异构酶和木酮糖激酶编码区(Pgap-xylA/xylB操纵子)，而另一个由受运动发酵单胞菌Peno启动子驱动的大肠杆菌转酮醇酶和转醛醇酶编码区组成(PENO-tal/tkt操纵子)。
非甲基化的pZB4质粒DNA被电穿孔至ZW1和AR1中，如“一般方法”部分所述。在电穿孔之后，整个50-μl的转化反应被添加至10mL的MMG培养基，然后使细胞于30℃在静置条件下恢复5小时。然后，通过离心收集细胞，移除了8mL的上清液并代之以等体积的包含25μg/mL四环素的MMG培养基(不含MgSO4)。然后在33℃孵育所得到的培养物～18小时，以富集携带质粒的转化体。富集步骤是非常重要的，因为pZB4的转化效率是极其低的，这可能是由于该质粒的尺寸大。富集流程之后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀物重悬在800μl MMG(不含MgSO4)中。然后，将每一细胞悬浮液的100-μl等分试样铺板在包含四环素(20μg/mL)的MMG琼脂平板(不含MgSO4)上，并于33℃在厌氧小室中孵育平板。48小时后，对于ZW1和AR1两种菌株，平板上均有～100个菌落，并且对于两种菌株，它们有相似的尺寸(2-3mm)。然后，随机选择了三个ZW1/pZB4菌落(-A、-B和-C)和三个AR1/pZB4菌落(-1、-2和-3)用于在下文所述的实验中进一步表征，而没有任何另外的操作。使用引物TF-2和引物TR-9(SEQ IDNO：57和58)，通过对重悬的细胞的PCR分析，确认了全部六种菌株均携带pZB4质粒。这些寡核苷酸与存在于pZB4中的Peno-Tal/Tkt操纵子杂交，并扩增出1681bp的DNA片段，全部六种菌株均产生了具有正确大小的DNA片段。
图9显示了使用mRM3-X10(其包含100g/L的木糖作为唯一糖类)加上20μg/mL四环素作为测试培养基的摇瓶实验。用于该研究的种菌是来自上文描述的葡萄糖/四环素琼脂平板的六个菌落，它们先前没有暴露于木糖。使培养物在33℃生长，初始的OD600值为～0.035。具有野生型ZMO0976基因的三个ZW1/pZB4转化体没能在木糖上生长，尽管它们的确包含木糖代谢所需的全部四种基因(图9)。实际上，即使在3天的孵育期之后，这些培养物的OD600仅升高了约60％，这意味着少于一次的倍增。形成显著对比的是，当携带pZB4质粒的三个ZW1/ZMO976敲除突变体菌落被从MMG/四环素平板转移至含木糖的培养基中时，生长立即开始而无需预先的木糖适应步骤(图9)。
考虑到上述结果，进行了实验来测试是否可能通过将AR1/pZB4转化体直接铺板在包含作为唯一碳源的木糖而不含四环素的固体培养基上来回收AR1/pZB4转化体。使用上文所述的相同的规程，包括使用四环素的18小时富集步骤，将pZB4质粒DNA引入了ZW1和AR1。该流程之后，通过离心收集细胞，用1.0mL的MMX培养基(与MMG培养基相同但包含50g/L木糖而不是葡萄糖)洗涤两次，并最终重悬在800μL的相同培养基中。然后，将所得到的细胞悬浮液的一百微升等分试样涂布在MMX琼脂平板和包含四环素(20μg/mL)的MMG琼脂平板(不含MgSO4)上，并于33℃在厌氧条件下孵育平板。在24小时的孵育期之后，在MMG/四环素平板上，ZW1和AR1分别有132和118个菌落。因此，对两种菌株而言，pZB4质粒DNA的转化效率是几乎相同的。然而，当相同的细胞悬浮液被直接铺板在缺少四环素的MMX琼脂平板上时，获得了非常不同的结果：在100小时的孵育期之后，对于AR1有85个菌落(～1mm)，而对于具有野生型ZMO0976基因的ZW1亲本菌株则没有菌落。
上述结果清楚地表明，对于针对木糖代谢经基因工程改造的运动发酵单胞菌重组菌株，功能性的ZMO0976基因产物构成了在木糖上生长的主要障碍。该酶是能够将木糖转化为木糖醇的NADPH依赖的醛糖还原酶。尽管木糖醇自身不抑制细菌的生长或导致细胞死亡，但它是大肠杆菌木酮糖激酶的为人们所熟知的替代性底物，该酶在ATP的存在下使它磷酸化，形成毒性化合物木糖醇-5-磷酸。然而，如图8中所显示的，ZMO0976基因的失活导致了体内木糖醇的形成3至4倍的下降，并且这使得当木糖利用途径被引入时，AR1/pZB4转化体在木糖上能够立即生长。换句话讲，AR1/pZB4转化体能够在木糖上生长而无需适应步骤，因为它们与ZW1/pZB4转化体相比产生了较少的木糖醇并从而形成了较少的木糖醇-5-磷酸。上文描述的实验还展示了ZMO0976基因的失活能够允许在木糖上的直接选择，只要所引入的木糖途径的酶在木糖是可用的唯一碳源时能够提供足够的碳流量来支持细菌的生长。
实例7
ZW1/pZB4转化体的适应产生了至少三个不同类型的突变
如图9中所显示的，通过在葡萄糖平板上的四环素选择获得的ZW1/pZB4-A转化体，当其被接种在包含20μg/mL四环素的mRM3-X10培养基中时，没有在木糖上生长。当该菌株被接种在缺少四环素的MMX10培养基(与MMX培养基相同，但包含100g/L木糖而不是50g/L木糖)中时，也没观察到生长。实际上，后一实验使用～0.2的初始OD进行了不同的八次，甚至在于33℃6天的孵育期之后，对任何培养物也没有浊度的升高。然而，通过使用葡萄糖和木糖的混合物，我们能够使ZW1/pZB4-A菌株适应，以在木糖上生长，如下文所详述的。
将ZW1/pZB4-A甘油原液接种至包含20μg/mL四环素的10-mLmRM3-G5培养基中，初始OD为0.1；mRM3-G5是与mMR3-G10相同的，但包含50g/L葡萄糖而不是100g/L。在于33℃9小时的孵育期之后，OD升高至～2.0，通过离心收集了细胞。将细胞沉淀物重悬在250mL的45g/L木糖、5g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L K2HPO4、和0.1mM MgSO4以及20μg/mL四环素中，至初始OD为0.08。然后，将重悬的细胞的二十三毫升等分试样分配至八个50-mL的松弛地盖着的试管，于33℃温和摇动培养物86小时。在孵育期间，OD值升高至～1.0，然后将每一培养物的等分试样添加至5mL的mRM3-X10培养基。于33℃孵育新的培养物28.5小时，在这段时间内，它们的OD值从～0.04升高至0.7-1.1。然后，将来自八个培养物中每一个的等分试样各自铺板在包含20μg/mL四环素的MMG琼脂平板(不含MgSO4)上，以分离单菌落。在于33℃2天的孵育期之后，随机选择了来自每一平板的两个菌落用于进一步表征；根据初始的八个培养物命名了这些菌落，并在下文中称为菌株1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A和8B。
进行了预实验以观察各种菌株在木糖上生长得如何。上述16个菌落中的每一个被分别接种至5mL的mRM3-X10培养基中，并于33℃孵育培养物21.5小时。基于该实验期间生长的程度(OD的升高)，选择了来自每一平板的一个菌落用于进一步表征，所选择的是在木糖中生长得最好的那个。所选择的菌株是1A、2B、3B、5B、6A、6B、7A和8B，代表了八种初始培养物中的七种。由于菌株4A和4B在预实验期间在木糖上几乎没有生长，它们没有被包括在下文所述的研究中，而6A和6B都被包括在内。
使用以上所选择的八种经适应的菌株，以mRM3-X10作为生长培养基，进行了摇瓶实验。培养物的初始OD是～0.05，温度是33℃；使作为种菌用于该实验的预培养物也生长在mRM3-X10中。基于在木糖中的生长和对发酵液体培养基的HPLC分析，上述菌株似乎落在三个不同的组中，如图10中所示。组#1的菌株(1A、3B、6A和8B)全部表现得相似，并且在木糖上比其他四种菌株生长更快。它们还生长至更高的最终OD。组#2的菌株(2B、5B和6B)也以相似的动力学生长，但它们的生长速率和最终OD值比组#1的菌株低得多。尽管组#3的菌株(7A)生长得最慢，它最终达到了比组#2的菌株更高的OD。
表1显示了通过HPLC分析测定的上文所述的八个培养物的发酵液体培养基中的木糖、木酮糖、核酮糖、木糖醇、甘油、乙酸盐和乙醇的终点值(102小时)。注意，全部四种组#1的菌株产生了大量的木糖醇(＞3g/L)，而生长缓慢的组#3菌株7A也是如此。形成显著对比的是，对于菌株2B、5B和6B，存在于发酵液体培养基中的木糖醇的量低于可检测的水平并且不能被定量。就除木糖醇以外的其他副产物而言，这三个组也具有不同的模式和水平。例如，组#1和组#3的菌株产生了显著量的乙酸盐、相对低水平的核酮糖和甘油。另一方面，组#2的菌株产生了大量的核酮糖和甘油，但几乎没产生乙酸盐。最后，仅组#3的菌株(7A)产生了大量的木酮糖(～4g/L)，木酮糖是所工程化的木糖途径中的第二个酶即木酮糖激酶的天然底物。而且，有趣的是，尽管组#1的菌株比组#2的菌株在木糖中生长更快并且达到更高的最终OD，它们的乙醇生产速率却比其他两组显著更缓慢。
表1针对在含木糖的培养基中的生长经适应的菌株的发酵液体培养基 分析
*nd＝未测定
为了确定任何的这八个经适应的菌株是否在ZMO0976中具有突变，使用引物I和引物G(SEQ ID NO：55和53)并以重悬的细胞作为模板，PCR扩增了该基因。所产生的DNA片段包含完整的ZMO0976编码区加上起始密码子上游的～900个核苷酸和终止密码子下游的～200个核苷酸。使用六种不同的引物(SEQ ID NO：59-64)，对所得到的PCR产物进行了DNA序列分析。
只有组#2的菌株在ZMO0976基因中具有突变。菌株#5B在开放阅读框中具有导致了移框的8-bp的缺失。该缺失是从起始密码子的第一个核苷酸下游的858个核苷酸开始的。组#2的其他两个菌株(2B和6B)是在开放阅读框中的核苷酸349处具有G至T点突变的相同的“姐妹”菌株，其使得氨基酸残基E117转变为终止密码子。这些结果是与表1中显示的HPLC数据相符合的，因为组#2的菌株是仅产生了痕量的木糖醇的那些。
存在于组#1和组#3菌株的发酵液体培养基中的大量木糖醇有力地表明，这些菌株进化出了处理木糖醇的毒性的不同机制。正如已经指出的，负责对运动发酵单胞菌的生长和生存能力的抑制性效应的是木糖醇-5-磷酸而不是木糖醇，而前一种化合物是由大肠杆菌木酮糖激酶在需要ATP和木糖醇的反应中生成的。因此，似乎有可能组#1和组#3的菌株在存在于被引入这些菌株的pZB4质粒DNA中的大肠杆菌木酮糖激酶基因(xylB)中已获得了突变。为了测试该假说，使用两种PCR引物(SEQ ID NO：65和66)并以重悬的细胞作为模板，从八个经适应的菌株扩增了大肠杆菌xylB基因(NCBI登录号NC_000913，Gene ID：948133)。
所产生的DNA片段包含完整的xylB编码区和终止密码子下游的～300个核苷酸。使用六种不同的引物(SEQ ID NO：67-72)，对所得到的PCR产物进行了DNA序列分析。测序结果显示，全部的组#1的菌株(1A、3B、6A和8B)在大肠杆菌木酮糖激酶开放阅读框中均具有点突变，并且其是完全相同的修饰，表明它们是“姐妹”菌株。全部四种菌株在核苷酸224处(相对于起始密码子的第一个核苷酸)均具有G至A的替换，其导致了单氨基酸取代，即G75D突变。推测该突变降低了木酮糖激酶的比活性或降低了其对木糖醇的底物特异性。两种情况均将导致较少的木酮糖-5-磷酸的形成，使得这些菌株能够在进行ZMO0976介导的木糖醇生产的过程中在木糖中生长。
为了确定xylB点突变对木酮糖激酶酶活性的效应，对组#1的菌株之一(3B)和未经适应的ZW1/pZB4菌株之一(ZW1/pZB4-B)制备了无细胞提取物；后者具有野生型木酮糖激酶基因。上述提取物的制备基本上如“一般方法”部分所描述的，但细胞是在～1.0的OD收集的。所得到的提取物被用于在使用乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶的酶耦联的反应中测量木酮糖激酶活性。1.0-mL反应于20℃在石英比色杯中进行，并且包含下列组分：50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、50mM KCl、1mM ATP、1mM EDTA、1mM DTT、20单位的乳酸脱氢酶、80单位的丙酮酸激酶、1.5mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.2mM NADH、5mM D-木酮糖和等量的2.5-10μL的无细胞提取物。在建立了基线条件之后，最后加入了木酮糖。对照反应是相同的，但没有加入木酮糖。在340nm使用分光光度计法作为时间的函数测量了酶活性，使用6220M-1cm-1的消光系数来监测NADH至NAD的转化。在对木酮糖的不存在下NADH氧化的速率进行校正之后，将酶活性表示为U/mg无细胞提取物蛋白质；1U＝1微摩尔形成的木酮糖-5-磷酸每分钟。当来自未经适应的ZW1/pZB4菌株的10μl无细胞提取物被用于该测定时，木酮糖依赖的NADH氧化的信噪比是超过60(即，与对照反应相比，在木酮糖的存在下NADH消失的比率)。
基于变异度小于7％的三个平行测定，在所采用的条件下，就未经适应的ZW1/pZB4菌株而言的平均木酮糖激酶比活性是3.67U/mg。形成显著对比的是，基于变异度为16％的两次测定，就经适应的3B菌株而言的平均比活性仅为0.21U/mg。因此，在经适应的菌株3B中的G75D点突变使大肠杆菌木酮糖激酶的比活性与野生型基因相比降低了～95％。尽管该突变显然允许细胞在持续的ZMO0916介导的木糖醇生产过程中存活，从图10中显示的摇瓶实验来看显然的是，其对木糖的利用和乙醇的生产的速率也具有有害效应。更重要的是，具有该突变的全部四种菌株产生了极大地降低了乙醇生产的代谢产率的显著量的木糖醇(表I)。
组3的菌株7A的突变的性质依然有待确定。尽管在质粒携带的大肠杆菌xylB开放阅读框中没有突变，表I和图10中显示的数据有力地表明，这种经适应的菌株也具有非常低水平的木酮糖激酶酶活性。实际上，除积聚大量的木糖醇之外，7A是产生了可检测的量的木酮糖的唯一菌株，表明大肠杆菌木酮糖激酶不能像木糖异构酶能够产生木酮糖那样快地使木酮糖磷酸化。
总之，ZMO0976基因的失活极大地减少了木糖醇的生产和毒性的木糖醇-5-磷酸的积聚。该策略还消除了对预先适应步骤的需要，并且使得具有木糖代谢途径的重组运动发酵单胞菌菌株能够在木糖上立即生长。更重要的是，ZMO0976的故意失活使得获得在帮助生物处理木糖醇的毒性的木糖适应过程中能够发生的其他自发突变(例如上文所述的大肠杆菌xylB突变)的可能性最小化。

Claims (19)

1.一种制备可利用木糖的发酵单胞菌(Zymomonas)细胞的方法，包括：
a)提供发酵单胞菌宿主细胞；
b)在所述细胞内至少一种内源性基因中创建基因修饰，所述内源性基因编码具有在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的能力的EC1.1.1.21的醛糖还原酶；以及
c)向所述细胞中引入木糖利用代谢途径；
其中步骤(b)和(c)的顺序不是指定的，并且其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞具有的醛糖还原酶活性与缺少步骤(b)的基因修饰的发酵单胞菌细胞相比降低超过90％。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使用包含作为唯一糖类的木糖的培养基来选择所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵单胞菌宿主细胞是野生型细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵单胞菌宿主细胞是先前未曾暴露于木糖的发酵单胞菌细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。
6.根据权利要求1所述的方法，其中编码醛糖还原酶的所述内源性基因编码与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少约95％的序列同一性的蛋白质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中编码醛糖还原酶的所述内源性基因具有与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少约95％的同一性的编码区序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的基因修饰选自突变、插入、缺失、以及它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述木糖利用代谢途径包括一系列多核苷酸，所述多核苷酸编码各自具有木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、或转醛醇酶的酶活性的多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中具有木糖异构酶活性的所述多肽是组I的木糖异构酶，并且被包括在按照EC5.3.1.5鉴定的酶分类之内。
11.根据权利要求10所述的方法，其中编码木糖异构酶多肽的所述多核苷酸分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中编码木糖异构酶多肽的所述多核苷酸可操作地连接至突变体甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，其中所述突变体启动子具有比天然的启动子更高的活性。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞还包含降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的至少一种基因修饰。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞还包含降低内源性himA基因的表达的基因修饰。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞还包含编码各自具有L-阿拉伯糖异构酶活性、L-核酮糖激酶活性、或L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶活性的用于利用阿拉伯糖的多肽的多核苷酸、和任选地编码为阿拉伯糖-质子协同载体的多肽的多核苷酸。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞还包含增加核糖-5-磷酸异构酶活性的基因修饰。
17.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述可利用木糖的发酵单胞菌细胞在含木糖的培养基中适应，其中木糖利用是改善的。
18.一种可利用木糖的且产乙醇的发酵单胞菌细胞，所述发酵单胞菌细胞具有下列特性：
a)所述细胞对于在包含作为唯一糖类的木糖的培养基上立即生长，不需要木糖适应步骤；
b)所述细胞具有的在NADPH存在下将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶活性降低超过90％；以及
c)所述细胞包含木糖利用代谢途径，所述木糖利用代谢途径包括一系列多核苷酸，所述多核苷酸编码各自具有木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、或转醛醇酶的酶活性的多肽。
19.一种用于生产乙醇的方法，包括使权利要求18所述的可利用木糖的且产乙醇的发酵单胞菌细胞在其中产生乙醇的条件下生长。
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