CN104206280B - 一种绿色球状体途径的泽泻蕨种苗组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
一种绿色球状体途径的泽泻蕨种苗组培快繁方法，包括诱导培养基：1/6MS～1/4MS+TDZ0.4～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L；增殖培养基：1/6MS～1/4MS+TDZ0.1～0.3mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L；分化培养基：1/4MS～1/2MS+活性炭3～6g/L；各培养基加有蔗糖和琼脂，pH为5.80。其绿色球状体诱导率88％以上，增殖倍数11～12.5倍，分化率98％以上，一个绿色球状体一年内可繁出种苗150～200万株，成活率95％以上。
Description
技术领域
本发明本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及一种绿色球状体途径的泽泻蕨组培快速繁殖方法。
技术背景
泽泻蕨(Hemionitisarifolia)隶属于裸子蕨科泽泻蕨属，商品名：心愿蕨、心愿叶、心叶蕨。泽泻蕨属共8种，仅泽泻蕨1种产于亚洲，中国是该种分布的北界，主要分布于海南及云南南部。泽泻蕨叶片心形，叶型独特，具有良好的市场应用前景。
自然条件下，蕨类植物主要依靠孢子进行繁殖，但孢子繁殖的周期较长，通常需要6-18个月，甚至更长。
蕨类植物绿色球状体是指由蕨类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可以获得大量蕨类植物幼苗。蕨类植物的绿色球状体途径的组培繁殖方法是指：外植体——绿色球状体——植株，一旦诱导得到绿色球状体，其繁殖系数将高于孢子繁殖途径。
目前，大多数蕨类植物直接从地栽的活体植株上很难获得合适的外植体，诱导难度极大，获得蕨类植物绿色球状体的也较困难。到目前为止，蕨类植物中已获得绿色球状体的种类十分有限，这主要由于不同种类的蕨类植物绿色球状体的获得对于外植体的选取以及植物激素的种类和浓度具有一定的专一性，需经过大量筛选试验才能获知特定蕨类植物种类适宜的外植体种类以及植物激素种类和浓度。目前，尚无泽泻蕨绿色球状体途径组培繁殖技术的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在泽泻蕨通过孢子繁殖周期较长，缺乏新途径快速繁殖的缺陷，因此，本发明目的是提供一种通过绿色球状体途径组培快速繁殖泽泻蕨种苗的新方法。本发明技术方案如下：
一种绿色球状体途径的泽泻蕨种苗组培快繁方法，其特征在于步骤如下：
(1)泽泻蕨无菌外植体的获得
将泽泻蕨无菌孢子接种在1/2MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到幼嫩的无菌苗，以幼嫩无菌苗作为泽泻蕨无菌外植体；
(2)泽泻蕨绿色球状体的诱导
将步骤(1)获得的泽泻蕨无菌外植体接种于诱导培养基上进行培养，培养条件与步骤(1)相同，无菌苗茎尖和叶柄基部膨大形成原始的绿色球状体即为诱导得到的泽泻蕨绿色球状体；所述的诱导培养基为：1/6MS～1/4MS+TDZ0.4～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；
(3)泽泻蕨绿色球状体的增殖
将步骤(2)诱导得到的泽泻蕨绿色球状体分割为直径2～5mm的球状体，接种于增殖培养基上进行培养，培养条件与步骤(1)相同；所述的增殖培养基为：1/6MS～1/4MS+TDZ0.1～0.3mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；
(4)泽泻蕨绿色球状体的分化
将步骤(3)增殖后的泽泻蕨绿色球状体分割为直径2～5mm的球状体，接种于分化培养基上进行培养得到分化幼苗，培养条件与步骤(1)相同；所述的分化培养基为：1/4MS～1/2MS+活性炭3～6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；
(5)分化幼苗的培养
将步骤(4)得到的分化幼苗接种于分化幼苗培养基上进行培养得到组培苗，培养条件与步骤(1)相同；分化幼苗培养基为：MS+活性炭3-6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80；
(6)组培苗移栽培育
待步骤(5)所述组培苗苗高达到2～3cm时，在20～25℃、每天的光照时间为12小时、光照强度2000lx条件开盖炼苗2～3天，将炼苗后的组培苗除去根部的培养基，并用质量分数为0.1～0.125％百菌清溶液清洗根部，种植于装有基质的育苗盒内，育苗盒内所用基质为草炭：河沙：珍珠岩的体积比为3:1:1的混合基质，再将育苗盒放置塑料棚里，控制棚内温度为20～25℃，在自然光照下生长10～15天即得到泽泻蕨商品种苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明方法繁殖效率特别高。
本发明方法绿色球状体诱导时间为2周，平均诱导率可达88.33％～98.33％，绿色球状体增殖倍数为11倍～12.5倍，绿色球状体分化率为98.33％～100％，用一个绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株。而采用常规的孢子组培快繁出的原叶体簇增殖倍数为2～3倍，孢子体幼苗形成率为63.33％，表明本发明方法的绿色球状体诱导率、绿色球状体增殖倍数和绿色球状体分化率均特别高、繁殖倍数比常规的孢子组培快繁种苗的繁殖倍数提高了3.67倍～6.25倍。
2、本发明方法繁育周期短。
由于本发明泽泻蕨绿色球状体的增殖倍数特别高，达11～12.5倍，获得泽泻蕨绿色球状体后，一个绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株，即用诱导出的一个绿色球状体一年内可繁殖出百万至几百万株优质泽泻蕨种苗，因此，本发明以泽泻蕨的绿色球状体作为一种重要的中间材料，从诱导泽泻蕨绿色球状体至繁育成泽泻蕨商品种苗，其繁育周期比常规的孢子组培快繁种苗的繁育周期短缩68～89天。
3、本发明生产的组培苗健壮，根系发达，组培苗成活率高，组培苗移栽后平均成活率为95％～100％。
4、本发明生产的种苗健壮、根系发达、质量好，用本发明方法生产的种苗种植生产盆栽观赏植物的成活率可达100％。
5、本发明方法通过培育出的泽泻蕨绿色球状体繁育种苗周年可生产，不受季节限制，而常规的孢子组培快繁只能在夏秋季节收集泽泻蕨孢子，受季节影响较大。
综上所述，本发明方法以泽泻蕨的绿色球状体作为一种重要的中间材料，繁殖效率特别高、繁育周期短、节约生产成本，生产的种苗健壮、种苗质量好、成活率高，与常规的孢子组培快繁种苗相比，繁殖倍数提高了3.67倍～6.25倍，繁育周期短缩68～89天，且种苗周年可生产，不受季节限制，产生了预料不到的技术效果，本发明为泽泻蕨商品种苗的规模化和标准化生产提供了重要的新方法、新途径。
附图说明
图1是泽泻蕨幼嫩无菌苗诱导产生的原始绿色球状体，图中箭头所示的即是诱导产生的原始绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1000μm。
图2是泽泻蕨绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1000μm。
具体实施方法
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混合后，用pH计调pH为该培养基要求的pH值即制成。
实施例1本发明方法
(1)泽泻蕨无菌外植体的获得
将泽泻蕨无菌孢子接种在1/2MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，培养6-7月后可得到幼嫩的无菌苗，以幼嫩无菌苗作为泽泻蕨无菌外植体。
泻蕨无菌孢子的获得方法为将10～15mg孢子置于1.5ml离心管中用无菌水预清洗3次，6000r/min离心2min，获得孢子沉淀物，加入体积分数为5％NaClO溶液灭菌4min，无菌水清洗3-5次即得泽泻蕨无菌孢子。
(2)泽泻蕨绿色球状体的诱导
将步骤(1)获得的泽泻蕨无菌外植体接种于诱导培养基上进行培养，接种数量为60株，培养条件与步骤(1)相同。
所述的诱导培养基为：1/4MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.1mg/L+水解酪蛋白400mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养2周，无菌苗茎尖和叶柄基部膨大形成原始的绿色球状体即为诱导得到的泽泻蕨绿色球状体，平均诱导率可达88.33％。诱导率＝产生绿色球状体的无菌苗数/接种的无菌苗数×100％。
(3)泽泻蕨绿色球状体的增殖
将步骤(2)获得的泽泻蕨绿色球状体分割成直径为3mm大小的球状体初始鲜重为11.00±1.64mg，接种于绿色球状体增殖培养基上，接种数量为60个，培养条件同步骤(1)。
绿色球状体增殖培养基为：1/4MS+TDZ0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+水解酪蛋白400mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周，绿色球状体的鲜重增加量为131.28±7.45mg，增殖倍数约为12倍，增殖培养的次数可根据所需组培苗数量而定。
(4)泽泻蕨绿色球状体的分化
将步骤(3)增殖获得的泽泻蕨绿色球状体分割成直径3mm～4mm大小的球状体，接种于绿色球状体分化培养基上，接种数量为60个，培养条件同步骤(1)。
所述绿色球状体分化培养基为：1/4MS+活性炭3g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周分化出幼苗，平均分化率为98.33％，分化率＝发生分化的绿色球状体数量/接种的绿色球状体的数量×100％。
(5)泽泻蕨分化幼苗的培养
将步骤(4)获得的泽泻蕨分化幼苗接种于分化幼苗培养基上得到组培苗，所述的分化幼苗培养基为：MS+活性炭3g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80，培养条件同步骤(1)。
培养4周，泽泻蕨组培苗的平均高度为2.42±0.54cm，每株组培苗具8～10条根。
(6)泽泻蕨组培苗移栽培育
待步骤(5)所述组培苗高度达到2～3cm时进行炼苗，随后进行育苗即得到泽泻蕨商品种苗。
所述炼苗方法具体如下：20～25℃、每天的光照时间为12小时、2000lx，开盖炼苗3天。
所述育苗方法具体如下：将炼苗后的组培苗除去根部的培养基，并用质量分数为0.125％百菌清溶液清洗根部，种植于盛有基质的育苗盒内，育苗盒内所用基质为草炭：河沙：珍珠岩的体积比为3:1:1的混合基质，再将育苗盒放置塑料棚里，控制棚内温度为20～25℃，在自然光照下生长10～15天即得到泽泻蕨商品种苗；其泽泻蕨组培苗的平均成活率为95％。
将本发明繁殖的泽泻蕨商品种苗种植于花盆里按常规栽培方法培育盆栽观赏植物，4周后，平均成活率为100％。
实施例2本发明方法
实施例2除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同，不再赘述。
(2)泽泻蕨绿色球状体的诱导
绿色球状体诱导培养基为：1/6MS+TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L+水解酪蛋白600mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养2周，无菌苗茎尖和叶柄膨基部大形成绿色球状体，平均诱导率可达95％。
(3)泽泻蕨绿色球状体的增殖
绿色球状体增殖培养基为：1/6MS+TDZ0.2mg/L+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L+水解酪蛋白600mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周，绿色球状体的鲜重增加量为137.52±6.36mg，增殖倍数约为12.5倍，增殖培养的次数可根据所需组培苗数量而定。
(4)泽泻蕨绿色球状体的分化
绿色球状体分化培养基为：1/2MS+活性炭4g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周分化出幼苗，平均分化率为98.33％。
(5)泽泻蕨分化幼苗的培养
泽泻蕨分化幼苗培养基为：MS+活性炭4g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周，泽泻蕨组培苗的平均高度为2.63±0.46cm，每株组培苗具8-10条根。
(6)泽泻蕨组培苗移栽培育
炼苗后，除去根部的培养基，0.1％百菌清溶液对组培苗根部进行清洗。育苗2周，泽泻蕨组培苗的平均成活率为96.67％。
将本发明繁殖的泽泻蕨商品种苗种植于花盆里按常规栽培方法培育盆栽观赏植物，4周后，平均成活率为100％。
实施例3
实施例3除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同，不再赘述。
(2)泽泻蕨绿色球状体的诱导
绿色球状体诱导培养基为1/5MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.3mg/L+水解酪蛋白800mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80。
培养2周，无菌苗茎尖和叶柄基部膨大形成绿色球状体，平均诱导率可达98.33％。
(3)泽泻蕨绿色球状体的增殖
绿色球状体增殖培养基为：1/5MS+TDZ0.3mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+水解酪蛋白800mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周，绿色球状体的鲜重增加量为120.63±7.82mg，增殖倍数约为11倍。
(4)泽泻蕨绿色球状体的分化
绿色球状体分化培养基为:1/4MS+活性炭6g/L+蔗糖浓度30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周分化出幼苗，平均分化率为100％。
(5)泽泻蕨分化幼苗的培养
泽泻蕨分化幼苗培养基为：MS+活性炭6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周，泽泻蕨组培苗的平均高度为2.30±0.52cm，每株组培苗具10-12条根。
(6)泽泻蕨组培苗移栽培育
炼苗2天，育苗10天，泽泻蕨组培苗的平均成活率为100％。
将本发明繁殖的泽泻蕨商品种苗种植于花盆里按常规栽培方法培育盆栽观赏植物，4周后，平均成活率为100％。
以上各实施例所生产的一个泽泻蕨绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株。泽泻蕨绿色球状体的保存：采用绿色球状体的增殖培养基进行保存，每3～4周更换一次培养基，绿色球状体增殖培养基为：1/6MS+TDZ0.2mg/L+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L+水解酪蛋白600mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
实施例4对照实验
(1)泽泻蕨孢子消毒
于夏秋季节收集泽泻蕨孢子，将10～15mg孢子置于1.5ml离心管中用无菌水预清洗3次，6000r/min离心2min，获得孢子沉淀物，加入体积分数为5％NaClO溶液灭菌4min，无菌水清洗3～5次即得泽泻蕨无菌孢子。
(2)泽泻蕨孢子培养
将步骤(1)获得的泽泻蕨无菌孢子接种于1/2MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为10瓶，20～25℃培养，每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx。
培养3周后，孢子开始萌发，萌发率约为30.56％，继续培养9～10周后，形成原叶体簇。萌发率＝萌发的孢子数/接种的孢子数×100％。
(3)泽泻蕨原叶体培养
将步骤(2)中获得的原叶体簇分成小块，继续接种于1/2MS+蔗糖30.0g/L，琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为60块，培养条件同步骤(1)。培养4周后，原叶体簇增殖2～3倍。
将增殖后的原叶体簇分成小块，继续接种于1/2MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为60块，并在原叶体上滴加适量的无菌水，以促进孢子体的形成，培养条件同步骤(1)。
培养4～6周后，逐渐有孢子体幼苗形成，孢子体幼苗形成率为63.33％。孢子体幼苗形成率＝产生孢子体幼苗的原叶体数/接种的原叶体数×100％。
(4)泽泻蕨孢子体幼苗的生根培养
将步骤(3)中获得的孢子体幼苗接种于MS+活性炭6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。
培养4周后，泽泻蕨组培苗的平均高度为2.10±0.48cm，每株组培苗具6-8条根。
(5)泽泻蕨组培苗移栽培育
同实施例1的步骤(6)。
育苗2周后得到泽泻蕨商品苗，泽泻蕨组培苗的平均成活率为90％。泽泻蕨商品苗种植于花盆里按常规栽培方法培育盆栽观赏植物，4周后，平均成活率为90％。
上述各实施例表明：
1、本发明方法绿色球状体诱导时间为2周，平均诱导率可达88.33％～98.33％，绿色球状体增殖倍数为11倍～12.5倍，绿色球状体分化率为98.33％～100％，一个绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株。表明本发明方法的绿色球状体诱导率、绿色球状体增殖倍数、绿色球状体分化率、繁殖效率均特别高。
2、本发明生产的组培苗健壮，根系发达，组培苗成活率高，组培苗移栽后平均成活率为95％～100％。
由于本发明泽泻蕨绿色球状体的增殖倍数特别高，达11～12.5倍，获得泽泻蕨绿色球状体后，一个绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株，即用诱导出的绿色球状体繁育种苗一年内可繁殖出百万至几百万株优质泽泻蕨种苗，可满足市场需求，因此，本发明以泽泻蕨的绿色球状体作为一种重要的中间材料，从诱导泽泻蕨绿色球状体到繁育出泽泻蕨种苗计算，本发明的繁育周期比常规的孢子组培快繁种苗的繁育周期短缩68～89天。
3、由于本发明绿色球状体增殖倍数高，增殖倍数达11倍～12.5倍，获得泽泻蕨绿色球状体后，一个绿色球状体一年内可繁殖出优质泽泻蕨种苗150～200万株，即一个绿色球状体一年内可繁殖出百万至几百万株优质泽泻蕨种苗，可满足市场需求，本发明以泽泻蕨的绿色球状体作为一种重要的中间材料，本发明从诱导泽泻蕨绿色球状体至培育成商品种苗需14周13天～14周18天即平均需114天，繁育周期短。而采用常规的孢子组培快繁需26～29周即平均需182天～203天，原叶体簇增殖倍数为2～3倍，孢子体幼苗形成率为63.33％，可见，本发明绿色球状体途径繁育泽泻蕨种苗的繁育周期短比常规的孢子组培快繁种苗的繁育周期短缩68～89天，繁殖倍数提高3.67倍～6.25倍，产生了预料不到的技术效果。
4、本发明方法通过培育出的泽泻蕨绿色球状体繁育种苗可周年生产，不受季节限制，而常规的孢子组培快繁只能在夏秋季节收集泽泻蕨孢子，受季节影响较大。
Claims (1)
1.一种绿色球状体途径的泽泻蕨种苗组培快繁方法，其特征在于步骤如下：
(1)泽泻蕨无菌外植体的获得
将泽泻蕨无菌孢子接种在1/2MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到幼嫩的无菌苗，以幼嫩无菌苗作为泽泻蕨无菌外植体；
(2)泽泻蕨绿色球状体的诱导
将步骤(1)获得的泽泻蕨无菌外植体接种于诱导培养基上进行培养，培养条件与步骤(1)相同，无菌苗茎尖和叶柄基部膨大形成原始的绿色球状体即为诱导得到的泽泻蕨绿色球状体；所述的诱导培养基为：1/6MS～1/4MS+TDZ0.4～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；
(3)泽泻蕨绿色球状体的增殖
将步骤(2)诱导得到的泽泻蕨绿色球状体分割为直径2～5mm的球状体，接种于增殖培养基上进行培养，培养条件与步骤(1)相同；所述的增殖培养基为：1/6MS～1/4MS+TDZ0.1～0.3mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+水解酪蛋白400～800mg/L+蔗糖30.0g/L，琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80；
(4)泽泻蕨绿色球状体的分化
将步骤(3)增殖后的泽泻蕨绿色球状体分割为直径2～5mm的球状体，接种于分化培养基上进行培养得到分化幼苗，培养条件与步骤(1)相同；所述的分化培养基为：1/4MS～1/2MS+活性炭3～6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；
(5)分化幼苗的培养
将步骤(4)得到的分化幼苗接种于分化幼苗培养基上进行培养得到组培苗，培养条件与步骤(1)相同；分化幼苗培养基为：MS+活性炭3-6g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80；
(6)组培苗移栽培育
待步骤(5)所述组培苗苗高达到2～3cm时，在20～25℃、每天的光照时间为12小时、光照强度2000lx条件，开盖炼苗2～3天，将炼苗后的组培苗除去根部的培养基，并用质量分数为0.1～0.125％百菌清溶液清洗根部，种植于盛有基质的育苗盒内，育苗盒内所用基质为草炭：河沙：珍珠岩的体积比为3:1:1的混合基质，再将育苗盒放置塑料棚里，控制棚内温度为20～25℃，在自然光照下生长10～15天即得泽泻蕨种苗。
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