CN104145811A - 一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 - Google Patents
一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104145811A CN104145811A CN201410406815.XA CN201410406815A CN104145811A CN 104145811 A CN104145811 A CN 104145811A CN 201410406815 A CN201410406815 A CN 201410406815A CN 104145811 A CN104145811 A CN 104145811A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- arabidopsis
- seeds
- screening
- sensitive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims abstract description 33
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims abstract description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000002786 root growth Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims abstract description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 40
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 7
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 claims description 6
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 6
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims description 6
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 claims description 6
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 claims description 3
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 2
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 abstract description 14
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 abstract 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- HNXQXTQTPAJEJL-UHFFFAOYSA-N 2-aminopteridin-4-ol Chemical compound C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 HNXQXTQTPAJEJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023020 Aldehyde Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000048262 Aldehyde oxidases Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 2
- 108010027912 Sulfite Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000043440 Sulfite oxidase Human genes 0.000 description 2
- 102000005773 Xanthine dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010091383 Xanthine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 101150074884 CNX1 gene Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- HDAJUGGARUFROU-JSUDGWJLSA-L MoO2-molybdopterin cofactor Chemical compound O([C@H]1NC=2N=C(NC(=O)C=2N[C@H]11)N)[C@H](COP(O)(O)=O)C2=C1S[Mo](=O)(=O)S2 HDAJUGGARUFROU-JSUDGWJLSA-L 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 101100005050 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cal1 gene Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046778 molybdenum cofactor Proteins 0.000 description 1
- CWQXQMHSOZUFJS-UHFFFAOYSA-N molybdenum disulfide Chemical compound S=[Mo]=S CWQXQMHSOZUFJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- CZAKJJUNKNPTTO-AJFJRRQVSA-N precursor Z hydrate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@@H]1C(O)(O)[C@H]1[C@@H]2NC(N=C(NC2=O)N)=C2N1 CZAKJJUNKNPTTO-AJFJRRQVSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法以及筛选所用的培养基和培养方法。此方法筛选出拟南芥Mo敏感的突变体。筛选所用的培养基包括不含钼(-Mo)和含170nM钼(+Mo)的固体培养基。培养方法是：拟南芥M2种子先用75％的酒精浸泡30s，然后在1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次，消毒后的种子接种于-Mo或+Mo培养基上，经过4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养。筛选方法是：以EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0获得的M2代种子为试验材料，通过在-Mo和+Mo的培养基上进行反复筛选培养，根据拟南芥根系在两种培养基上的生长差异筛选出在-Mo培养基上根生长不好而在+Mo培养基上根生长很好的拟南芥Mo敏感变异株，并对其表型进行了分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物生物技术，具体涉及一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法以及筛选用的培养基。
背景技术
钼(Molybdenum，Mo)是植物生长发育必不可少的微量矿质元素。如果土壤缺Mo植物无法生长，且植物出现典型的缺素症状，主要表现为：叶片失绿，叶脉间的组织形成黄绿或桔红色叶斑；叶缘卷曲、凋萎以至于坏死；叶柄和叶脉干枯等。据报道，自然界土壤中Mo浓度为3-7mg·kg-1，而地表水中Mo浓度为10-50nM。世界上许多地方的土壤不能提供植物生长所必需的钼元素，尤其是在酸性土壤中，然而在自然条件土壤中钼元素含量对植物生长是不足的。
钼在土壤中以辉钼矿(MoS2)或者水钼铁矿[Fe2(MoO4)3]的形式存在，然而植物在pH5以上的溶液中以钼酸盐(MoO4 2-)的形态吸收和转运钼。钼酸在植物体中主要是形成钼辅因子(Moco)参与植物生理功能。其中，钼是由CNX1催化被插入到金属靶定的蝶呤(MPT)中，从而代替铜离子靶定的二硫酚硫，这个过程与肌动蛋白丝相关。也就是说，MPT是GTP经过cPMP循环合成的。Moco也是一些氧化还原酶的重要组成成分，包括硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)、亚硫酸盐氧化酶(sulfite oxidase,SO)、黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase,XDH)以及醛氧化酶(aldehyde oxidase,AO)等。除此之外，钼在植物的生长发育中还有以下主要功能：(1)钼可以提高铁离子等养分的吸收，从而提高植物光合速率；(2)钼能够促进磷酸酶活性，增加植物体内VC的合成以及有利于糖类的形成与转化；(3)钼能促进植物产生抗坏血酸以及增加种子的含糖量，从而增强植物抗寒、抗旱和抗病能力。有机钼肥效高，对防治植物烟草花叶病效果明显。另外，Moco在古细菌、原核生物以及真核生物中都是高度保守的。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥属(Arabidopsis)，由于其基因组(125Mb)是目前已知植物基因组中最小的，这就使得拟南芥经常被作为植物材料来研究，是典型的模式植物。另外，拟南芥生长周期短，具有高等植物的一般特点，对研究和阐明植物的生长发育机制具有重要意义。同时，拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种功能缺陷型突变体。其中，使用烷化剂甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate,EMS)作为诱变剂现已被广泛运用，它具有突变频率高，易获得饱和突变，基因突变的多种效应(功能完全缺失、功能部分缺失、功能的数量性变化、功能的组成性表达)等特点，能够基本满足筛选出各种功能基因缺陷的突变体。此外，拟南芥基因组的成功测序为基因功能分析和遗传改良奠定了坚实的基础，继而可以通过图位克隆等方法分离鉴定突变体基因，为进一步揭示基因的功能以及改良植物品种都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基，其特点在于由+Mo培养基和-Mo培养基组成；
所述+Mo培养基组成为每升+Mo培养基中含有pH5.8的1.75mM磷酸钠缓冲液、1.5mM MgSO4、2.0mM Ca(NO3)2、3.0mM KNO3、67μM Na2EDTA、8.6μM FeSO4、10.3μMMnSO4、30μM H3BO3、1.0μM ZnSO4、24nM(NH4)6Mo7O24、130nM CoCl2、1μM CuSO4母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。
所述-Mo固体培养基为去除(NH4)6Mo7O24成分的+Mo培养基组分。
一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法，其特点在于，包括如下步骤：
(1)用EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0种子，即为M1；将M1种子种植，收获拟南芥种子M2；
(2)将经消毒处理的拟南芥种子M2接种于-Mo培养基上；在4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养；
(3)将在-Mo培养基上培养一周后的根系较短的幼苗选出，转移到+Mo培养基上；在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中垂直培养4-5天后，把根系伸长较好的幼苗再转移到-Mo培养基上；同样条件下培养一周后，将根系生长停滞或几乎不生长的幼苗移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株收获拟南芥种子M3；
(4)再将步骤(3)所得的拟南芥种子M3消毒后，分别取同一单株的5粒种子接种于-Mo和+Mo培养基上，在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中同时垂直培养进行第二次筛选，若M3种子在-Mo培养基上根长相对较短，且在+Mo培养基根长相对较长，则该单株植株为Mo敏感的拟南芥变异株；
(5)将筛选出的Mo敏感变异株，移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株收获拟南芥种子M4；将每个单株收获的M4种子取10粒消毒后分别接种于含0nM、1.7nM、170nM Mo的+Mo培养基中，以Col-0野生型种子为对照，通过比较其根系的长度和形态以及叶片的生长情况分析，验证其为Mo敏感的拟南芥变异株；
所述+Mo培养基组分为每升+Mo培养基中含有1.75mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)、1.5mM MgSO4、2.0mM Ca(NO3)2、3.0mM KNO3、67μM Na2EDTA、8.6μM FeSO4、10.3μMMnSO4、30μM H3BO4、1.0μM ZnSO4、24nM(NH4)6Mo7O24、130nM CoCl2、1μM CuSO4母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。
所述-Mo固体培养基为去除(NH4)6Mo7O24成分的+Mo培养基组分。
所述步骤(1)中拟南芥M2种子消毒处理是指将拟南芥M2种子先用质量分数75％的酒精浸泡30s，然后在质量分数1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明采用EMS作为化学诱变剂，它具有突变频率高、易获得基因突变的多种效应(功能完全缺失、功能部分缺失、功能的数量性变化、功能的组成性表达)等特点，能够基本满足筛选出各种功能基因缺陷的突变体。另外，Mo是植物生长发育的必需矿质元素，如果植物缺Mo，会产生专一的病症。同时拟南芥具有生长周期短、容易培养等优点，为本筛选方法奠定了理论基础。此外，拟南芥基因组小且成功测序为基因功能分析和遗传改良奠定了坚实的基础，继而可以通过图位克隆等方法分离鉴定突变体的功能基因。
本发明所筛选出的拟南芥Mo敏感变异株可利用图位克隆技术分离突变体功能基因，并验证其吸收与转运Mo的功能，为从分子水平阐明植物吸收与运输Mo的机理以及改良植物品种提供依据。
附图说明
图1：M2代种子在初筛中的根系生长状况。
图2：M3代种子在+Mo和-Mo中的生长情况。
图3：Mo敏感变异株的表型。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步解释说明。
(1)二种筛选培养基配制
培养基母液配方：①磷酸钠缓冲液(pH5.8)，1.75mM；②MgSO4，1.5mM；③Ca(NO3)2，2.0mM；KNO3，3.0mM；④Na2EDTA，67μM；FeSO4，8.6μM；MnSO4，10.3μM；H3BO4，30μM；ZnSO4，1.0μM；(NH4)6Mo7O24，24nM；CoCl2，130nM；CuSO4，1μM。
表1 培养基母液配方
制备过程：依次取上述母液各5mL；蔗糖，10g；结冷胶，5g，加入980mL蒸馏水，调pH至5.8，置于1L三角瓶中。将三角瓶置于灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件：121℃,20min。灭菌结束后，在超净工作台近火焰无菌条件中，将上述溶液立即倒平板，在室温、无菌条件下静置、冷却、凝固。+Mo固体培养基中含有上述所有成分，-Mo固体培养基中不含(NH4)6Mo7O24成分。
筛选方法步骤如下：
(1)用EMS诱变处理的野生型拟南芥Col-0种子，即为M1；将M1种子种植，收获拟南芥种子M2；其中拟南芥种子M2可通过直接购买获得，也可以将市购的野生型拟南芥Col-0种子经现有EMS诱变处理方法得到M1种子，然后将M1种子种植，收获拟南芥种子M2；
(2)将32000多粒拟南芥M2种子先用75％的酒精浸泡30s，然后在1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次，消毒后的种子接种于-Mo培养基上。经过4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养。
(3)将在-Mo培养基上培养一周后的根系较短的5000株幼苗挑选出来，转移到+Mo培养基上。在22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养4-5天后，把根系伸长较好的3200多株幼苗再转移到-Mo培养基上。同样条件下培养一周后，将根系生长停滞或几乎不生长的576株幼苗移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株收获300多株拟南芥种子(M3)。
图1所示的为部分经步骤(2)筛选得到的根系较短的拟南芥种子M2幼苗在+Mo培养基上的根长生长状况，其中同一株幼苗根部靠上的横线为幼苗在-Mo培养基上的伸长长度，靠下的横线为在+Mo培养基上的伸长长度，而整个幼苗的根长是经步骤(2)、以及步骤(3)+Mo培养基和-Mo培养基培养后的总根长，图中可以看出，有多株幼苗在+Mo培养基培养时根伸长较好，但再次转入-Mo培养基后，根系生长停滞或几乎不再生长。
(4)再将步骤(3)所得的拟南芥种子M3消毒后，分别取同一单株的5粒种子接种于-Mo和+Mo培养基上，在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中同时垂直培养进行第二次筛选，若M3种子在-Mo培养基上根长相对较短，且在+Mo培养基根长相对较长，则该单株植株为Mo敏感的突变体植株，总共筛选出31株Mo敏感变异株。
如图2所示，6株经步骤(2)和(3)筛选的M3种子取5粒分别接种于-Mo和+Mo培养基上幼苗的生长状况。其中，-Mo和+Mo培养基上，自左向右各为5株筛选株，第6株为野生型对照，从图中可以看出，自左向右第2、3株为本发明所筛选获得的Mo敏感突变体植株。
(5)针对筛选出的Mo敏感突变体植株，移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，收获拟南芥种子(M4)。将每个单株收获的M4种子取10粒消毒后分别接种于含0nM、1.7nM、170nM Mo的+Mo培养基中(所述培养基与+Mo培养基组份相同，仅将(NH4)6Mo7O24调整为相应的浓度)，以Col-0野生型种子为对照(图3)，比较其根系的长度和形态以及叶片的生长情况，分析变异株与野生型在表型上的差异；培养2-3周后，结果显示，与野生型拟南芥相比，在-Mo培养基中变异株生长明显受到抑制，主要表现为：植株矮小，根系较短，叶片失绿，叶缘卷曲。而在+Mo培养基中野生型与变异株的生长状况没有明显差异。且随着培养基中Mo浓度的增加，Mo敏感变异株的缺钼症状在不断恢复。从比对结果可以进一步验证本发明方法所筛选的突变体植株确为Mo敏感突变体植株。
Claims (3)
1.一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基，其特征在于由+Mo培养基和-Mo培养基组成；
所述+Mo培养基组成为每升+Mo培养基中含有pH5.8的1.75mM磷酸钠缓冲液、1.5mM MgSO4、2.0mM Ca(NO3)2、3.0mM KNO3、67μM Na2EDTA、8.6μM FeSO4、10.3μMMnSO4、30μM H3BO3、1.0μM ZnSO4、24nM(NH4)6Mo7O24、130nM CoCl2、1μM CuSO4母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。
所述-Mo固体培养基为去除(NH4)6Mo7O24成分的+Mo培养基。
2.一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0种子，即为拟南芥种子M1；将种子M1种植，收获拟南芥种子M2；
(2)将经消毒处理的拟南芥种子M2接种于-Mo培养基上；在4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养；
(3)将在-Mo培养基上培养一周后的根系较短的幼苗选出，转移到+Mo培养基上；在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中垂直培养4-5天后，把根系伸长较好的幼苗再转移到-Mo培养基上；同样条件下培养一周后，将根系生长停滞或几乎不生长的幼苗移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株收获拟南芥种子M3；
(4)再将步骤(3)所得的拟南芥种子M3消毒后，分别取5粒接种于-Mo和+Mo培养基上在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中同时垂直培养进行第二次筛选，若在-Mo培养基上根生长较短，而在+Mo培养基上根生长较长，则该植株为Mo敏感的拟南芥变异株；
(5)将筛选出的Mo敏感变异株，移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株收获拟南芥种子M4；将每个单株收获的M4种子取10粒消毒后分别接种于含0nM、1.7nM、170nM Mo的+Mo培养基中，以Col-0野生型种子为对照，通过比较其根系的长度和形态以及叶片的生长情况分析，进一步验证其为Mo敏感的拟南芥变异株；
所述+Mo培养基组分为每升+Mo培养基中含有1.75mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)、1.5mM MgSO4、2.0mM Ca(NO3)2、3.0mM KNO3、67μM Na2EDTA、8.6μM FeSO4、10.3μMMnSO4、30μM H3BO4、1.0μM ZnSO4、24nM(NH4)6Mo7O24、130nM CoCl2、1μM CuSO4母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。
所述-Mo固体培养基为去除(NH4)6Mo7O24成分的+Mo培养基组分。
3.根据权利要求2所述的一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中拟南芥M2种子消毒处理是指将拟南芥M2种子先用质量分数75％的酒精浸泡30s，然后在质量分数1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410406815.XA CN104145811B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410406815.XA CN104145811B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104145811A true CN104145811A (zh) | 2014-11-19 |
| CN104145811B CN104145811B (zh) | 2016-04-20 |
Family
ID=51871619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410406815.XA Active CN104145811B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104145811B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101449657A (zh) * | 2008-12-30 | 2009-06-10 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 一种ems诱变花椰菜小孢子获得抗寒dh突变体的方法 |
| CN102047844A (zh) * | 2010-12-13 | 2011-05-11 | 湖北省烟草科研所 | 一种用于烟草花粉的高效诱变方法 |
-
2014
- 2014-08-18 CN CN201410406815.XA patent/CN104145811B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101449657A (zh) * | 2008-12-30 | 2009-06-10 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 一种ems诱变花椰菜小孢子获得抗寒dh突变体的方法 |
| CN102047844A (zh) * | 2010-12-13 | 2011-05-11 | 湖北省烟草科研所 | 一种用于烟草花粉的高效诱变方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘峰 施卫明: ""拟南芥室内水培方法的改进"", 《土壤》 * |
| 曹树青等: ""一个耐受镉毒害的拟南芥突变体的筛选"", 《环境科学学报》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104145811B (zh) | 2016-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113337520B (zh) | 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用 | |
| CN112941086B (zh) | OsPIL15基因在调控水稻耐盐性中的应用 | |
| WO2022135246A1 (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
| CN111718935A (zh) | 葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途 | |
| CN102719433B (zh) | osa-MIR167a基因在调控水稻株型中的应用 | |
| CN102732528A (zh) | Oxhs4基因在控制水稻抗旱性中的应用 | |
| CN101171915B (zh) | 脱落酸处理提高青蒿中青蒿素含量的方法 | |
| Tamayo-Ramos et al. | Old and new horizons on Persea americana transformation techniques and applications | |
| CN103865806A (zh) | 内生真菌菌株r5-6-1的应用 | |
| CN114703198A (zh) | 一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用 | |
| Bouharmont | Application of somaclonal variation and in vitro selection to plant improvement | |
| Ebadi et al. | Investigating the most effective factors in the embryo rescue technique for use with ‘Flame Seedless’ grapevine (Vitis vinifera) | |
| CN118240841A (zh) | Srz3基因及其在提高水稻耐盐性方面的应用 | |
| CN103789325B (zh) | 棉花细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用 | |
| CN104145811B (zh) | 一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法 | |
| CN117327729A (zh) | AtWRKY41基因在提高植物根结线虫病抗性中的应用 | |
| CN114958906B (zh) | 与烟草低钾胁迫相关的基因、启动子及其应用 | |
| CN116103272A (zh) | 控制大豆共生固氮效率的蛋白质、基因及其载体和应用 | |
| CN112779270B (zh) | 一种增强植物缺铁耐受及铁积累的功能基因及应用 | |
| CN1644026A (zh) | 一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法 | |
| CN116656718A (zh) | Amt4基因及其在调控水稻籽粒粒型、粒重中的应用 | |
| CN107723301A (zh) | 一种棉花抗旱基因及其表达载体与应用 | |
| CN116121266B (zh) | 水稻基因qSS7在抗旱中的应用 | |
| CN103361371A (zh) | 一种番茄硫代腺苷甲硫氨酸合酶基因SlSAMS1的克隆及其应用 | |
| CN102140138A (zh) | 一种植物抗旱相关蛋白TaNAC2742及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |