CN1041419C

CN1041419C - 丝裂霉素ｃ－右旋糖酐的制备方法

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Publication number: CN1041419C
Application number: CN93112087A
Authority: CN
Inventors: 齐春莲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-07-21
Filing date: 1993-07-21
Publication date: 1998-12-30
Anticipated expiration: 2013-07-21
Also published as: CN1097767A

Abstract

丝裂霉素C-右旋糖酐的制备方法，是一种预防和治疗恶性肿瘤淋巴结转移的药物制备方法，该方法制出的药物能够改善患者的预后和生存质量，通过本发明的方法制备出的MMC-D，减轻了MMC的副作用。如骨髓抑制、胃肠损害。不发生局部坏死。MMC-D有淋巴组织分布多，释放缓慢维持作用时间长，不降低抗肿瘤活性的特点，可消除淋巴组织中的微小转移灶和淋巴管中的游离癌细胞，为预防和治疗恶性肿瘤淋巴转移开辟了一个新的途径。

Description

丝裂霉素Ｃ－右旋糖酐的制备方法

本发明涉及一种预防和治疗恶性肿瘤的药物的制备方法，尤其是用于恶性肿瘤的淋巴转移的药物的制备方法。

恶性肿瘤的淋巴转移与患者预后有很大关系。如胃癌无淋巴转移者根治后的生存率是有淋巴转移者的二倍。胃癌复发死亡病例中以淋巴组织复发为死因者占20％。将抗癌药直接注入到淋巴管中的方法因技术上的困难，临床应用价值有限，常规的全身给药方法也没有很好解决淋巴转移的问题。大量抗癌药不能转运并集中于胃周淋巴结，高血浓度产生严重副作用。目前，国内外对消化道恶性肿瘤的治疗的研究多集中于5-FU及博莱霉素的乳化剂和脂质体，以及活性碳吸附MMC，这些药物与载体的结合力属于物理因素。MMC为乙撑亚胺类抗生素混合物中的一种成份，其结构包括醌环吲哚、氮丙啶环及甲氧甲酰胺侧链，作用机制是烷化作用，两个活性的烷化基团氮丙啶环及甲氧甲酰胺侧链结合在DNA的双螺旋大沟上抑制DNA的复制。MMC存在的问题是静脉给药后，由于血中脂蛋白及其它物质的作用而迅速裂解，并迅速由网状内皮系统，如肝脾吞噬而清除，这对化疗中靶组织非肝脾者是不利的，如骨髓抑制，胃肠道损害和不可避免的局部坏死，不能通过改变用药途径解决。药物在淋巴组织中的含量聚集是一种预防淋巴转移及术后淋巴组织癌复发的可靠方法，并可通过检测组织中的抗肿瘤药物浓度来决定可能的抗肿瘤活性。

本发明的目的在于提供一种在不降低抗肿瘤活性的前提下，具有向淋巴管、淋巴结集中，并且释放缓慢维持时间长，可消除淋巴组织中微小转移灶，也就是提出一种通过改变药代动力学特性，使其浓度宜于聚集在淋巴系统的药物制备方法。

为了实现上述目的，丝裂霉素C-右旋糖酐依据如下原理：MMC的分子量为334.34，是一个小分子物质。由于毛细血管中血液的流速为淋巴管内淋巴液流速的500倍，如果没有淋巴管选择吸收的机制，组织中的药物主要通过被动扩散和滤过作用经血液吸收并清除，而不经过淋巴管道，故治疗肿瘤的淋巴转移是困难的。毛细血管壁上存在半径为40_左右的细孔最多，尚有少数半径大40_4～19倍的细孔，当药物分子量从2万(半径为32_)向4万(半径为49_)过渡时，淋巴液药物浓度/血浆浓度比值增加。将MMC与7万分子量的右旋糖酐相连接，合成的MMC-D半径为74_。所说的MMC-D在Drug Metab.Dispos.(1984)，12(4)，492-9中有过记载，其结构式如下：

本发明是这样实现的：由丝裂霉素C-右旋糖酐、6-氨基己酸、1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐及溴化氰合成MMC-D。氢氧化钠、丙酮及碳酸钠均为分析纯化剂。本发明的制备方法是：将120mg(效价)MMC除盐，放入100ml的圆底容器中，加入60ml的丙酮摇匀；将红色上清倒入250ml的容器中，用H-B循环水或真空干燥机干燥；将250ml的容器放到磁力搅拌器上，内加磁力搅拌子，通电，向容器中加入双蒸馏水10ml及右旋糖酐(T₇₀)1克，待溶解后，分三次加入0.2、0.2、0.15克溴化氰，同时测定PH值，滴入1N NaOH使PH值保持于10.7，加入1克6-氨基己酸，用1N HCl使PH值保持于9.0，反应24小时；把反应所得溶液倒入透析袋中，置于0.1 mol/LNa₂CO₃溶液中，10分钟换一次Na₂CO₃溶液，重复六次；将100Mg MMC加入透析后的溶液中，放入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，调定PH值为5-6，反应24小时，加入丙酮，将沉淀物置于G₆玻璃纤维漏斗上过滤，真空干燥，所得物置于4℃冰箱内保存。

检测MMC-D交联情况：合成完毕后及保存一年时二次检测，判断交联情况及稳定性。采用美国Waters液相色谱系统，高效液相色谱法检测MMC-D的交联，分析柱：TSR-GEL3,000W，流动相：PH 7.0磷酸缓冲液，流速：0.8ml/min，检测波长：365nm，灵敏度：0.2AUFS。

动物实验：

大白鼠，由中国医科大学实验动物部提供，Wistar系，雄性，体重248+20.6克，按组间一致的原则将动物随机分为MMC给药组及MMC-D给药组，(1)用乙醚开放麻醉；(2)用生理盐水配制1mg当量MMC/ml的MMC及MMC-D溶液，用1ml注射器按2ml/Kg鼠重抽取溶液，注入到大鼠左大腿肌肉内；(3)注射MMC组于5’、15’、30’取左侧腹腔髂淋巴结，注射部位肌肉及心脏取血。血离心5000rpm10分钟。淋巴结及肌肉以CPS-I型超声波粉碎机粉碎后离心8000rpm 5分钟，取上清测浓度；(4)MMC-D给药组于5’、30、1h、2h、4h、8h、24h取样送检同上。离心前90℃、5分钟加热，使MMC-D裂解为MMC；(5)制备标准曲线：菌种为沈阳药学院提供的大肠杆菌1093，把MMC制备成5、10、15、20、30、35、40ug/ml溶液，管碟法加入100微升，培养12小时，测抑菌圈大小，以浓度对抑菌圈直径作图，绘制标准曲线，(6)加样测样品抑菌圈直径，从标准曲线查样品浓度，绘制样品药物浓度--时间变化曲线，将数值输入到3p88程序的电子计算机系统得出并比较药代动力学参数；(7)结果：MMC-D注入大鼠左大腿肌肉内，引流的腹腔淋巴结中药物2小时达185.2mg/g，是MMC组淋巴结药物浓度峰值的八倍，MMC-D组24小时浓度仍为55.6mg/g，MMC组30分钟内药物消失，注射MMC-D局部24小时仍有33.5％以结合方式存在，血中未测出药物浓度，MMC组注射局部药物30分钟内消失，5分钟时血浆浓度为3ug/g、淋巴结内MMC-D的AuC为901.16ug/g.h，MMC为4.095ug/g.h，前者为后者的220倍。故MMC-D为预防和治疗淋巴结转移的理想药物。

抗肿瘤细胞活性测定：(1)胃癌细胞系MGC-803由山东师范大学建株，中国医大肿瘤研究所提供；(2)将MMC-D及MMC配制成4、3、2、1、0.5、0.1、0.25ug当量/ml的1640培养液为溶剂的溶液，加入MGC-803细胞，以10⁵个细胞/ml孔加入24孔细胞培养板中，每个样本加三个孔，另外，将细胞加入1640培养液中，为对照组。5％CO₂，37℃下培养三天，台盼蓝染色，计数，算出抑制率，计算公式为：

T--代表药物作用后的瘤细胞数

C--代表对照组的瘤细胞数结果证实MMC-D的抗肿瘤细胞活性与MMC基本相等。这是因为MMC-D带阳电荷，可吸附到带阴电荷的肿瘤细胞表面，不断释放完整的MMC表现出细胞毒性。MMC-D由化学水解作用水解，而不由细胞内的溶酶体酶降解，其分解速率是恒定的，半衰期为30小时。在72小时培养中，大部分MMC-D均裂解为MMC，故MMC-D的抗肿瘤活性与MMC相近。

MMC为乙撑亚胺抗生素混合物中的一种成分，其结构包括醌环引哚、氮丙啶环及甲氧甲酰胺侧链，作用机制是烷化作用，两个活性的烷化基团氮丙啶环及甲氧甲酰胺侧链结合在DNA的复制。右旋糖酐分子量可以自由改变，常用的有T₁₀、分子量1万；T₇₀，分子量7万；T₅₀₀，分子量50万。本实验是采用淋巴组织趋向性较好的T₇₀大分子右旋糖酐，与MMC通过6-氨基己酸相连接。在MMC-D的合成过程中，使反映溶液始终保持要求的PH值，合成后及保存一年时的交联率均为90％，其高度的稳定性，提高了MMC-D的实用可靠性。

与已有技术比，MMC-D具有淋巴结内浓度高、缓释性、不降低MMC的抗肿瘤活性等优点，是预防恶性肿瘤淋巴转移和腹膜转移的有效药物。

Claims

1.丝裂霉素C-右旋糖酐的制备方法，其特征在于：

制备步骤如下：

a.将MMC除盐，将容器放在磁力搅拌器上，内加磁力搅拌子，通电，再向该容器中加入双蒸馏水及右旋糖酐，待溶解后，分三次加入溴化氰，同时测定PH值，滴入1NNaOH保持PH值保持于10.7，加入6-氨基己酸，用1N HCl保持PH值保持于9.0，反应24小时；

b.把反应所得溶液倒入透析袋中，置于Na₂CO₃溶液，10分钟换一次，Na₂CO₃溶液重复6次；

c.将MMC加到透析后的溶液中，放入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，调定PH值为5～6，反应24小时；

d.加入丙酮，将沉淀物置于漏斗上过滤；

e.真空干燥，所得物冷藏保管。