CN104114710B - 由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组合物、其获得方法及其用途 - Google Patents

由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组合物、其获得方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及芽孢杆菌属的菌株。本发明还涉及由芽孢杆菌属的菌株产生的生物表面活性剂及其用途。本发明还涉及包含所述生物表面活性剂的组合物以及用于产生所述生物表面活性剂的方法。本发明还涉及用于获得生物表面活性剂的方法以及用于实施所述方法的设备。特别地，本发明可用在用于植物卫产生业的生物农药或生物表面活性剂的产生中，还可用在食品、化妆品、制药和石油工业领域。

Description

由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组 合物、其获得方法及其用途
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的菌株。
本发明还涉及由芽孢杆菌属的菌株产生的生物表面活性剂及其用途。本发明还涉及包含这些生物表面活性剂的组合物以及用于产生这些生物表面活性剂的方法。
本发明还涉及用于获得生物表面活性剂的方法以及用于实施该方法的设备。
特别地，本发明可应用在用于植物健康产业的生物农药或生物表面活性剂的生产中，还可应用在食品、化妆品、化学、制药和石油工业以及环境保护领域。
在下文的描述中，([])之中的参考文献是指在实施例结尾处给出的参考文献的列表。
现有技术
常规农业生产体系根据市场预期并且以消费者可接受的成本使用农药类型的植物健康产品以确保在数量和质量方面的充足生产。尽管使用这些产品给农业体系带来了益处，但是其可对人的健康以及环境造成负面影响。地下水和地表水质量的下降以及农业环境中生物多样性的下降是最常列举的后果。
已知生物表面活性剂特别是细菌来源的生物表面活性剂具有许多令人感兴趣的性能，特别是能够应用在植物健康领域的表面活性、抗病毒、抗细菌和抗真菌特性。这些生物表面活性剂可以单独使用或者以若干种表面活性剂的混合物使用。已表明，当生物表面活性剂以混合物的形式使用时具有协同效应(Ongena and Jacques，2008Bacilluslipopeptides：versatile weapons for plant disease biocontrol.TrendsMicrobiol.16，115-125[1]；CZ20011620[2]；DE102005050123[3])。
与化学来源的农药相比，这些生物表面活性剂具有更好的可生物降解性、更低的毒性和更大的物理化学抗性。另外，化妆品市场特别集中于组合了抗微生物活性和物理化学性质的生物来源分子，例如乳化剂。
生物表面活性剂也用于辅助回收包含于沉积物中的油，其中生物表面活性剂的注入降低油的黏度并大幅提高所回收的油的比例。其还用于抵抗烃对水的污染，并且比化学表面活性剂有效得多。而且，这些生物表面活性剂对所处理水的生态系统没有毒性。
因此，在过去几年特别在食品、化妆品、化学、制药和石油工业以及环境保护中对生物表面活性剂的需求提高。已经研究和使用了许多生产方法并且这些生产方法已经成为出版物或专利申请(FR2578552[4])的主题。
但是，目前可用的生物表面活性剂并不非常有效并且具有有限的生物和/或化学特性。
因此，确实需要提供作为替代的生物表面活性剂，其优选地具有与现有技术的生物表面活性剂相比改进的特性。
此外，目前确实需要具有可用于获得生物表面剂的有效方法。
已经特别对用于产生由芽孢杆菌属产生的生物表面活性剂的方法进行了研究。但是，这些方法由于以气泡形式添加氧而导致形成泡沫。第一种方法是使用机械搅拌的通气反应器并连续提取由生物表面活性剂造成的并且包含所述生物表面活性剂的泡沫。该方法很费力并且在使用上并不十分开放，特别是对于大规模使用而言(Guez et al.，2007.Setting up and modelling of overflowing fed-batch cultures of Bacillussubtilis for the production and continuous removal of lipoeptides.JBiotechnol，131，67-75([5])。
为了避免该泡沫问题，进行了在无氧条件下工作并使用硝酸盐作为最终电子受体的尝试(Davis，Lynch and Varley.1999.The production of surfactin in batchculture by Bacillus subtilis ATCC21332is strongly influenced by theconditions of nitrogen metabolism.Enzyme Microb.Technol.25，322-329.[6]；WO0226961[7]；EP1320595[8])。生物表面活性剂的产生很大程度上取决于菌株适应或不适应这些无氧条件的能力。迄今为止尚未开发出能够以工业数量产生生物表面活性剂的有效解决方案。而且，化学来源农药的使用越来越受到质疑，有必要研究和使用生物来源的分子以代替化学来源的农药并且开发以工业规模产生这些生物来源分子的方法。
因此，确实需要开发克服现有技术的这些缺点、缺陷和障碍的方法和设备，包括用于以低生产成本大量连续生产生物表面活性剂的方法。
发明内容
本发明通过提供枯草芽孢杆菌菌株、抗霉枯草菌素(mycosubtiline)、包含这些抗霉枯草菌素的组合物以及用于获得这些抗霉枯草菌素的方法确切地满足上述需求。
本发明还提供了特别是通过消除或限制泡沫的形成来以工业规模产生生物表面活性剂的方法和设备。
因此，本发明的主题是用于获得生物表面活性剂的方法，其包括步骤(a)：在包含有机基质的培养基中培养能够产生生物表面活性剂的微生物，所述微生物的培养在气/液膜接触器(contacteur membranaire air/liquide)的表面上进行。
本发明人实际上最早实施了该方法，并且出乎意料地发现将细胞固定在气/液膜接触器上特别有利于连续产生生物表面活性剂，同时避免形成泡沫。此外，本发明的方法提高了生物表面活性剂的产率。另外，在本发明的方法中使用气/液膜接触器使得可以连续产生生物表面活性剂。
在下文中，“生物表面活性剂”意指两性的并且由微生物产生的表面活性分子。其可以是例如选自包含以下的组的化合物：脂肽、磷脂、糖脂、脂蛋白或脂肪酸酯。例如，脂肽选自包含以下的组：伊枯草菌素(iturine)、表面活性素(surfactine)、抗霉枯草菌素、丁香霉素(syringomycine)、芬荠素(fengycine)(或制磷脂菌素(plipastatine))、地衣素(lichenysine)、芽孢菌霉素(bacillomycin)、kurstakine、托拉氏霉素(tolaasine)、节杆菌脂肽(arthrofactine)、沙雷菌脂肽(serrawettine)、putisolvine和massetolide。磷脂可以选自例如包含磷脂酰胆碱的组。酯可以选自例如包含以下的组：脱水山梨糖醇酯或鼠李糖酯、肉豆蔻酸单甘油酯(monomyristine)、亚油酸单甘油酯(monolinoléine)和亚麻酸单甘油酯(monolinolénine)。糖脂可以是例如鼠李糖脂。
“培养微生物”意指所有用于培养微生物和/或使其产生一种或更多种分子的技术。
“能够产生生物表面活性剂的微生物”意指无组织分化并且具有合成生物表面活性剂之能力的任何单细胞或多细胞微生物。其可以是例如细菌、酵母、霉菌或藻类。
例如，细菌可属于选自包含以下的组的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷菌属(Serratia)、伯克菌属(Burkholderia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡菌属(Nocardia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、棒状杆菌属(Coryn ebacterium)、梭菌属(Clostridium)、硫杆菌属(Thiobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、食烷菌属(Alcanivorax)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。例如，酵母可属于选自包含以下的组的属：念珠菌属(Candida)、二形性酵母属(Pseudozyma)、黑粉菌属(Ustilago)、裂孢黑粉菌属(Schizonella)、克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)和拟威克酵母属(Wickerhamiella)。优选地，能够产生生物表面活性剂的微生物属于芽孢杆菌属。
当所述能够产生生物表面活性剂的微生物属于芽孢杆菌属时，其可以选自例如包含以下的组：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。其可以是例如选自包含枯草芽孢杆菌之组的菌株的情况，例如于2011年3月10日在巴斯德研究所(法国巴黎)的国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，CNCM)以编号CNCM I-4451提交的枯草芽孢杆菌。也称为枯草芽孢杆菌BBG125，以及枯草芽孢杆菌ATCC21332、枯草芽孢杆菌BBG21、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌BBG100、枯草芽孢杆菌ATCC9943、枯草芽孢杆菌S499、枯草芽孢杆菌BBG116、枯草芽孢杆菌BBG131、地衣芽孢杆菌BAS50、来自地衣芽孢杆菌ATCC14580和苏云金芽孢杆菌BBG300的菌株。
优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物选自包含以下的组：枯草芽孢杆菌BBG125、枯草芽孢杆菌BBG100和枯草芽孢杆菌BBG1116，优选地选自包含以下的组：枯草芽孢杆菌BBG125和枯草芽孢杆菌BBG100。
优选地，就产生表面活性素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌BBG131。
优选地，就产生芬荠素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物选自包含以下的组：枯草芽孢杆菌ATCC21332和枯草芽孢杆菌BBG21。
还优选地，根据本发明，所述能够产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌BBG125。
当所述能够产生生物表面活性剂的微生物属于假单胞菌属时，其可以选自例如包含以下的组：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和托氏假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)。
在下文中，“有机基质”意指任何可以培养微生物和/或使其产生一种或更多种分子的物质或物质的混合物。例如，有机基质可选自包含以下的组：淀粉、葡萄糖、谷氨酸、蔗糖、木糖、甘油、有机酸、氨基酸以及这些有机基质的混合物。例如，有机基质可以是具有如下组成的Landy培养基：葡萄糖，20g/升；谷氨酸，5g/升；酵母提取物，1g/升；K2HPO4，1g/升；MgSO4，0.5g/升；KCl，0.5g/升；CuSO4，1.6mg/升；Fe2(SO4)3，1.2mg/升；MnSO4，0.4mg/升(Landy et al.1948.Bacillomycin；an antibiotic from Bacillus subtilis activeagainst pathogenic fungi.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.67，539-541)[9]。有机基质还可以是例如改良Landy培养基，例如补充有2.3g/升硫酸铵和/或2g/升浓度的谷氨酸的Landy培养基(Guez et al，2008.Respiration activity monitoring system(RAMOS)，anefficient tool to study the influence of the oxygen transfer rate on thesynthesis of lipopeptide by Bacillus subtilis.J.Biotechnol.134，121-126[10])。
在下文中，“气/液接触器”意指用于使用含氧的气体向液体介质供氧的设备。气/液接触器特别地包括气/液膜接触器。其可以是例如包含气/液膜接触器的反应器的情况。通过对气/液接触器举例，可提到以下接触器：根据由以CFP开始的参考文献定义的模型，来自GE Healthcare的“中空纤维盒”，以及根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来自Spectrum Labs的“中空纤维模块”。
气/液膜接触器还将液相与气相分离：气相在膜的一侧循环，而液相在另一侧流动(Remize and Cabassud2003，A novel bubble-free oxidation reactor：the G/Lmembrane contactor.Recent progress in method engineering.Integration ofmembranes in the methods2.Lavoisier Tec and Doc.[11])，这两相不混合。
“气/液膜接触器”意指允许氧气在培养基中扩散的多孔膜。
例如，气/液膜接触器可以是由中空纤维制成的膜或平坦的膜。
气/液膜接触器可以例如具有大小为0.01μm至2μm(例如0.01μm至1μm，例如0.1μm至0.65μm)的孔。
气/液膜接触器的表面积可以例如具有0.1m2至20m2的表面积。气/液膜接触器的表面积优选地大于1m2。
气/液膜接触器可以是例如疏水膜，确保这两相的较好分离。例如，气/液膜接触器可以由选自包含以下聚合物的组的材料制成：聚醚砜、聚丙烯、聚砜、再生纤维素和纤维素酯。
气/液膜接触器可以是例如平坦的、圆柱形的、圆锥形的或者任何优化微生物的培养以及与氧气的交换的几何形状。
通过对气/液膜接触器举例，可特别提到以下膜：
-来自GE-Healthcare Europe GmbH(德国慕尼黑)的(CFP-6-D-45)；
-根据由以CFP开始的参考文献定义的模型，来自GE Healthcare的中空纤维过滤模块(中空纤维盒)；
-根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来自Spectrum Labs的中空纤维过滤模块(中空纤维模块)。
根据本发明，可以使能够产生生物表面活性剂的微生物完全地或部分地主动固定在气/液膜接触器的表面上。换言之，存在于气/液接触器中的微生物大部分固定在该接触器的膜的表面上，其余部分在其释放后悬浮在培养基中。
因此，本发明的方法可包括步骤(a)：在包含有机基质的培养基中培养能够产生生物表面活性剂的微生物，微生物培养在气/液膜接触器的表面上。换言之，本发明的方法有利地可以无需培养皿或发酵罐。本发明的方法有利地可以以高度令人满意的量连续产生抗霉枯草菌素。有利地，连续实施本发明的方法。可任选地添加培养皿或发酵罐，但并非必需。添加培养皿或发酵罐相当不明智，因为其会降低产率。因此，有利地，在不包含培养皿或发酵罐的设备中实施本发明的方法。换言之，本发明的方法可以仅在气/液膜接触器的表面上实施能够产生生物表面活性剂的微生物的培养。
能够产生生物表面活性剂的微生物所必需的氧通过扩散经过固定所述微生物的气/液膜接触器的孔来传递。换言之，根据本发明，不是通过位于反应器中的鼓泡系统也不是通过位于微生物培养反应器外部的供氧系统来向微生物培养基供氧。
可以将气/液膜接触器的氧气流调节为使得可以向能够产生生物表面活性剂的微生物供氧的任何流量。本领域技术人员能够根据需要添加的氧气来确定气/液膜接触器的氧气流量。本发明人发现，每体积液体0.2体积至2体积/分钟(vvm)空气的通气流量对于向培养基和微生物供氧而言特别有效。因此，气/液接触器的空气流量可以为例如0.5vvm至2vvm。优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，气/液接触器的通气流量为0.25vvm。优选地，就产生表面活性素而言，气/液接触器的通气流量为1vvm。优选地，就产生芬荠素而言，气/液接触器的通气流量为0.5vvm。
根据本发明的方法，可以在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤(a)。例如，可以在两个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤(a)，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或甚至更多个气/液膜。本领域技术人员能够根据待产生的生物表面活性剂的量来确定气/液膜接触器的数目。
本发明的一个目的是提高固定在气/液膜接触器的表面上的微生物的量。这可以通过提高气/液膜接触器的表面积和/或气/液膜接触器的数目来完成。
当在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤(a)时，气/液膜接触器可以例如串联或平行设置。优选地，当在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤(a)时，气/液膜接触器平行设置。
本发明方法还可包括从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的步骤。该分离步骤可以通过本领域技术人员已知的任何能够分离包含在液体培养基中的物质的方法来进行。
例如，从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的步骤可包括一个或更多个选自包含以下的组的步骤：微滤、超滤、纳滤和离心。
例如，从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的步骤包括以下步骤：
(b)对步骤(a)所得培养基进行微滤，以从培养基中分离微生物，和/或
(c)对在步骤(a)或(b)中获得的培养基进行超滤，以从步骤(a)或(b)所得培养基中分离生物表面活性剂。
优选地，分离步骤包括步骤(b)和(c)中的每一个。
微滤步骤(b)和超滤步骤(c)使得能够从在步骤(a)和/或(b)中获得的培养基中连续提取生物表面活性剂。
因此，将气/液膜接触器与微滤(b)和超滤(c)步骤组合使得能够由能够产生生物表面活性剂的微生物连续产生和提取生物表面活性剂。
微滤步骤(b)可以利用任何能够从包含微生物的培养基中分离微生物的微滤装置进行。例如，所述微滤装置可以是微滤膜。例如，所述微滤装置可以是有机微滤膜或无机微滤膜，例如，中空纤维膜。
微滤步骤(b)可以例如利用由中空纤维制成的孔径为0.1微米至0.45微米(μm)的膜进行。优选地，在步骤(b)中使用的中空纤维膜的孔径为0.2μm。
通过对可用于进行微滤步骤(b)的膜举例，可列举以下膜：
-中空聚砜或聚醚砜纤维，孔径为0.2μm，参考CFP-2-E-4X2MA(GE-HealthcareEurope GmbH，德国慕尼黑)；
-中空聚砜或聚醚砜纤维，孔径为0.45μm，参考CFP-4-E-4X2MA，或中空聚砜或聚醚砜纤维，孔径为0.65μm，参考CFP-2-E-6X2MA(GE-Healthcare Europe GmbH，德国慕尼黑)；
-根据由以CFP开始的参考文献定义的模型，来自GE-Healthcare的中空纤维微滤或超滤模块(中空纤维盒)；
-根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来自Spectrum Labs(RanchoDominguez，CA，USA)的中空纤维过滤模块(中空纤维模块)；
-根据由以SPC20开始的参考文献定义的模型，来自Sartorius Stedim(法国欧巴涅)的Sartocon微滤盒。
超滤步骤(c)可以利用任何能够从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂并浓缩生物表面活性剂的过滤装置进行。例如，超滤装置可以是超滤膜，例如由再生纤维素制成的超滤膜。
例如，可以用截留阈值(seuil de coupure)为5千道尔顿至50千道尔顿(kDa)、例如5kDa至30kDa、例如5kDa至20kDa的膜进行超滤步骤(c)。在步骤(c)中使用的膜的截留阈值优选地为10kDa。
通过对可用于进行超滤步骤(c)的膜举例，可列举以下膜：
-由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜，参考3051443901E-SW(Sartorius，德国哥廷根)；
-由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜，参考P2C010C01(MilliporeHeadquarters，290Concord Road，Billerica，MA，USA)。
优选地将在步骤(a)、(b)和(c)中使用的膜在121℃下灭菌20分钟。
本发明的方法与用于由分泌生物表面活性剂的微生物生物降解有机物质的已知方法的区别在于，可以在从微生物中除去来自培养基的有机物质残余物和所产生的生物表面活性剂之后再循环或不再循环全部微生物。这使得可以在生物反应器中获得高浓度的微生物。
本发明的方法与用于由分泌生物表面活性剂的微生物生物降解有机物质的已知方法的区别还在于，约95％的所产生生物表面活性剂保留在培养基中，而不会形成泡沫。约5％的生物表面活性剂吸附在膜接触器的气/液界面上，但可通过例如洗涤该膜来解吸附。
可通过本领域技术人员已知的任何方法来洗涤气/液膜接触器以回收产生并吸附在膜接触器的气/液界面处的生物表面活性剂。例如，可以用一种或更多种选自包含以下的组的洗涤溶液进行气/液膜接触器的洗涤：蒸馏水、NaOH溶液、NaOCl溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液、或者碳酸钠溶液或碳酸钾溶液。可以将洗涤溶液调节为能够提高回收的生物表面活性剂之量的任意pH。例如，将洗涤溶液调节为pH＝10。
可以将洗涤溶液调节为能够提高回收的生物表面活性剂的量的任意温度。例如，可以将洗涤溶液调节为20℃至50℃的温度。
根据本发明，可通过本领域技术人员已知的任何加热装置来调节培养基的温度。例如，加热装置可以是热交换器。例如，热交换器可以选自包含U形管式热交换器、具有横向管束的热交换器、具有纵向管束的热交换器、螺旋式热交换器、板式热交换器、Bouhy柱或块式热交换器的组。加热装置优选为管式热交换器。
因此，本发明的方法可以在使能够产生生物表面活性剂的微生物可以产生生物表面活性剂的任意温度下实施。例如，可以在0℃至70℃、有利地在20℃至37℃的温度下实施该方法。优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，可以在22℃的温度下实施该方法。就产生芬荠素而言，可以优选地在30℃的温度下实施该方法。优选地，就产生表面活性素而言，可以在37℃的温度下实施该方法。
此外，本发明的方法可以在使能够产生生物表面活性剂的微生物可以产生生物表面活性剂的任意pH下实施。可以借助于向培养基中受控添加碱溶液或酸溶液来调节pH。
碱溶液可以例如选自包含碳酸钠、碳酸钾和氨水的组。
酸溶液可以例如选自包含磷酸、硫酸和硝酸的组。
例如，可以将pH调节为使能够产生生物表面活性剂的微生物能够存活的任意值。例如，可以将pH调节为pH6至pH8之间的值，优选pH7的值。本领域技术人员能够确定用于将pH调节为所需值的碱溶液和酸溶液的量。
本发明的方法可有利地连续实施，即可以不中断地实施气/液膜接触器的供应和由微生物产生的生物表面活性剂的提取。本发明的方法可以以能够从能够产生生物表面活性剂的微生物中提取生物表面活性剂的任意小时速率进行。本领域技术人员可容易地调整实施该方法的速率，即向气/液膜接触器添加的培养基的流量。本发明人发现，以0.05h-1至0.5h-1的稀释速率进行该连续方法对于微生物产生生物表面活性剂特别有效。所述稀释速率定义为供应速率或提取速率除以培养基体积。因此，可以例如以对应于稀释度为0.05h-1至0.5h-1的循环小时速率、有利地以0.1h-1的小时速率进行本发明的方法。
本发明的另一主题是用于实施本文描述的方法的设备，所述设备包含气/液膜接触器。例如，本发明的设备包含至少一个气/液接触器，其包括气/液膜接触器。
气/液膜接触器和气/液接触器可以是上文中定义的那些。
气/液膜接触器和气/液接触器的数目可以如上文所定义。
本发明的设备不包含除膜或多个气/液膜接触器以外的任何通气装置。换言之，本发明的设备不包含位于反应器中的鼓泡系统。该设备也不包含位于微生物培养反应器外部的供氧系统。本发明的设备还可包含微滤装置和/或超滤装置。本发明的设备优选地包含微滤装置和超滤装置。微滤装置和超滤装置可以是例如上文描述的那些。
有利地，本发明的设备包含连续实施本发明的方法所必需的装置。换言之，该设备有利地包含用于引入培养基的装置和用于移出由微生物产生的生物表面活性剂的装置。可以使用本领域技术人员已知用于获得用于连续实施本发明方法之设备的任意引入装置和移出装置。
本发明的设备还可包含蒸发装置。在下文中，“蒸发装置”意指任何用于浓缩包含表面活性剂的培养基中的表面活性剂的装置。其可以是例如选自包含Rotavapor VV2000型真空蒸发器(Heidolph Instruments GmbH&Co，德国施瓦巴赫)和升膜式蒸发器的组的蒸发装置。本发明的设备还可包含用于调节培养基的温度的加热装置。加热装置可以是例如上文中描述的那些。加热系统可通过管系统连接至气/液接触器。
“管系统”意指流体或气体可以在其中循环的任意装置。例如，流体可以是液体或凝胶。管系统特别可以将根据本发明的设备的多个元件连接在一起。例如，管系统可以是任意类型的硅树脂型柔性或刚性管道(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，USA)或由316S不锈钢(Swagelok Company，Solon，OH，USA)制成。
可以通过一个或更多个泵和/或一个或更多个阀来调节流体或气体在管系统中的循环。
本发明的设备还可包含至少一个泵。
在本发明的含义中，“泵”意指用于对本发明设备中的液体例如培养基施加流量的装置。其可以是例如蠕动泵、凸轮泵或隔膜泵。可提到例如Masterflex L/S蠕动泵紧凑驱动模型(Cole Parmer Vernon Hills，IL，USA)、Millipore Corporation(Millipore，Bedford，MA，USA)、Sartojet pump(Sartorius，Sartorius Stedim法国SAS，Aubagne)和Watson-Marlow323(Watson Marlow,Falmouth，英国康沃尔)。此外，泵可以手动控制或自动控制。
本发明的设备还可包含至少一个阀。
在下文中，“阀”意指用于终止或调节本发明设备中的液体(例如培养基)流的装置。其可以是例如调节阀、“双态”阀或电磁阀。可提到例如由聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、全氟烷氧基(PFA)或不锈钢制成的调节阀。另外，阀可以手动控制或自动控制。
本发明人在下文中描述了本发明的设备用于实施本发明方法的用途。
本发明的另一主题是由枯草芽孢杆菌ATTC6633菌株获得的枯草芽孢杆菌菌株，其中编码表面活性素合成酶的操纵子srfA被中断，编码抗霉枯草菌素合成酶的操纵子myc的启动子被组成型强启动子PrepU替换。
优选地，该枯草芽孢杆菌菌株是于2011年3月10日在巴斯德研究所(法国巴黎)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)以编号CNCM I-4451提交的枯草芽孢杆菌菌株。该菌株还称为枯草芽孢杆菌BBG125。
本发明的另一主题是用于产生抗霉枯草菌素的方法，其包括培养本发明的枯草芽孢杆菌菌株的步骤和回收所得抗霉枯草菌素的步骤。
枯草芽孢杆菌BBG125菌株可以例如用在任何用于产生生物表面活性素的方法中，特别是用在上述用于产生C18和C17Gln3抗霉枯草菌素的方法中。例如，用于产生生物表面活性剂的方法可包括培养枯草芽孢杆菌BBG125菌株的步骤和回收所得生物表面活性剂的步骤。例如，用于产生生物表面活性剂的方法可以是本发明上文描述的方法。
由本发明人开发的枯草芽孢杆菌BBG125菌株特别出乎意料。该菌株可以产生抗霉枯草菌素而不产生表面活性素。而且，其可以产生从未被描述过的抗霉枯草菌素。
因此，本发明还涉及以下抗霉枯草菌素：
-C18抗霉枯草菌素：脂肪酸链包含18个碳原子的抗霉枯草菌素，如下式(I)所示：
-C17抗霉枯草菌素Gln3：脂肪酸链包含17个碳原子并且在其肽环(cyclepeptidique)3位处天冬酰胺被替换为谷氨酰胺的抗霉枯草菌素，如下式(II)所示：
上述C18和C17Gln3抗霉枯草菌素可用作抗真菌剂。而且，其具有等同于或甚至大于目前用作抗真菌剂的抗霉枯草菌素的抗真菌作用。
在下文中，“抗真菌剂”意指能够治疗和/或预防真菌和/或酵母感染的物质。
本发明人还生产了包含抗霉枯草菌素的混合物的组合物。
因此，本发明的另一主题是包含至少一种C18抗霉枯草菌素和/或至少一种C17Gln3抗霉枯草菌素的组合物。
例如，该组合物还可包含一种或更多种选自包含异C16抗霉枯草菌素、正C16抗霉枯草菌素、反异C17抗霉枯草菌素和异C17抗霉枯草菌素的组的其他抗霉枯草菌素。
当组合物中存在C18抗霉枯草菌素时，其可以以组合物重量的1％至5％的浓度存在。
当组合物中存在C17抗霉枯草菌素Gln3时，其可以以组合物重量的1％至20％的浓度存在。
当组合物中存在异C16抗霉枯草菌素时，其可以以组合物重量的1％至60％的浓度存在。
当组合物中存在正C16抗霉枯草菌素时，其可以以组合物重量的1％至10％的浓度存在。
当组合物中存在反异C17抗霉枯草菌素时，其可以以组合物重量的20％至95％的浓度存在。
当组合物中存在异C17抗霉枯草菌素时，其可以以组合物重量的5％至30％的浓度存在。
例如，本发明的组合物可包含相对于该组合物的重量百分比：1％至60％的异C16抗霉枯草菌素、1％至20％的C17抗霉枯草菌素Gln3、1％至10％的正C16抗霉枯草菌素、20％至95％的反异C17抗霉枯草菌素、5％至30％的异C17抗霉枯草菌素和1％至5％的C18抗霉枯草菌素。
该组合物优选地包含相对于该组合物的重量百分比：26％的异C16抗霉枯草菌素、1％的C17抗霉枯草菌素Gln3、2％的正C16抗霉枯草菌素、44％的反异C17抗霉枯草菌素、23％的异C17抗霉枯草菌素和1％的C18抗霉枯草菌素。
该组合物可用作例如抗真菌组合物。换言之，其可以是用作抗真菌剂的组合物。
包含本发明的抗霉枯草菌素的混合物的组合物具有4μm至32μm的最小抑制浓度的抗真菌能力。
可以将本发明的抗霉枯草菌素和包含抗霉枯草菌素的混合物的组合物在选自包含以下的组的溶液中混合：水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、碳酸钠、Tris-HCl以及这些溶液的混合物。
这些溶液的混合物可以是二元混合物或三元混合物。当溶液的混合物是二元时，水/乙醇、水/甲醇、水/DMSO、水/碳酸钠、水/Tris-HCl、乙醇/甲醇、乙醇/DMSO、乙醇/碳酸钠、乙醇/Tris-HCl、甲醇/DMSO、甲醇/碳酸钠或甲醇/Tris-HCl的比可以为例如4/1至1/4，例如3/1至1/3，例如2/1至1/2，例如1/1、2/1、3/1或4/1的比例。当溶液的混合物是三元时，水/乙醇/甲醇、水/乙醇/DMSO、水/乙醇/碳酸钠、水/乙醇/Tris-HCl、水/甲醇/DMSO、水/甲醇/碳酸钠、水/甲醇/Tris-HCl、乙醇/甲醇/DMSO、乙醇/甲醇/碳酸钠、乙醇/甲醇/Tris-HCl或DMSO/碳酸钠/Tris-HCl的比可以为例如1/1/1、2/1/1、1/2/1、1/1/2、3/1/1、1/3/1、1/1/3、3/2/1、3/1/2、2/3/1、2/1/3、1/2/3或1/3/2。
本发明的抗霉枯草菌素和包含抗霉枯草菌素的混合物的组合物可以用作例如抗真菌剂。
因此，本发明还涉及本发明的抗霉枯草菌素或本发明的组合物，其用作抗真菌剂。
因此，本发明人提供了可避免形成泡沫并提高产率的连续产生生物表面活性剂的方法。本发明人还提供了用于实施该方法的设备以及显著之处在于在该方法中能够产生抗霉枯草菌素的枯草芽孢杆菌菌株，所述抗霉枯草菌素从未被描述过，并且其抗真菌效果等同于或甚至优于目前用作抗真菌剂的抗霉枯草菌素。本发明人还提供了抗真菌效果优于目前使用的抗霉枯草菌素之效果的抗真菌组合物。
通过阅读由以举例的方式给出的附图说明的以下实施例，其他优点对于本领域技术人员而言也可以是明显的。
附图简述
-图1是示出用于不形成泡沫地连续产生并提取由微生物产生的脂肽的设备的图。在该图中，M1表示由中空纤维制成的气/液膜接触器，其具有隔室C1和C2，分别表示空气在其中流通的外隔室和培养基在其中流通的内隔室。M2表示具有隔室C3和C4的微滤装置的微滤构件。M3表示具有隔室C5和C6的超滤装置的超滤膜。B1、B2和B3分别表示秤。B表示用于驱动盘2中的搅拌装置的电机。P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7表示容积泵。“Mi”意指“培养基”。“De”表示“废料”，“Et”表示“热交换器”。
-图2是表示用于不形成泡沫地连续产生、提取和纯化由微生物产生的脂肽之设备的图。在该图中，C1、C2、C3、C4、C5、C6、M1、M2、M3、B1、B2、B3、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、“Mi”、“De”和“Et”具有与图1中相同的含义。M4表示具有隔室C7和C8的超滤装置的超滤膜。B4、B5、B6和B7分别表示秤。B表示用于驱动盘2或盘4中的搅拌装置的电机。P8、P9、P10、P11和P12表示容积泵。V1、V2、V3、V4和V5表示阀。“Co”表示“冷凝器”，“X”对应于包含由微生物产生的脂肽的液体溶液。
-图3是表示图1的设备的图，其中用虚线示出了作为替代的回路。P13和P14表示容积泵。V6、V7和V8表示阀。B7表示秤。
-图4是表示图2的设备的图，其中用虚线示出了作为替代的回路。P13和P14表示容积泵。V6、V7和V8表示阀。B7表示秤。图5示出了图1至图4中描述的设备的第一部分，其中有多个平行设置的气/液接触器。在该图中，示出了三个气/液接触器。
-图6是具有pBGB106质粒的序列εpbp-PrepU-neo-εfenF的2.6kb片段、由枯草芽孢杆菌ATCC6633通过PCR产生的εpbp和εfenF片段同源重组片段从而形成了质粒pBG200的示意图。在该图中，“Sphl”、“Xbal”、“BspEl”和“Xmal”表示各自同名酶的限制性位点。“εpbp”和“εfenF”表示用于同源重组的盒。“pbp”表示编码与青霉素结合的蛋白质的基因。“Pmyc”表示枯草芽孢杆菌ATCC6633的原始启动子。“fenF”、“mycA”、“mucB”和“mycC”表示构成抗霉枯草菌素的操纵子的四个基因。“yngL”表示编码具有未知功能的蛋白质的基因。“PrepU”表示pUB110的复制基因的启动子。“neo”表示赋予对新霉素/卡那霉素的抗性的基因。
-图7是pBG144质粒在BBG116菌株的srfA操纵子处同源重组产生BBG125菌株的示意图。“EcoRi”、“BstEII”和“Mfel”表示各自的同名酶的限制性位点。“εsrfAA”和“εsrfAA”’表示用于同源重组的盒。“hxlR”表示位于srfA操纵子上游的基因。“PsrfA”表示srfA操纵子的天然启动子。“cat”表示用于抗氯霉素的基因。“tet”表示用于抗四环素的基因。
实施例
实施例1：枯草芽孢杆菌BBG125菌株的构建
枯草芽孢杆菌BBG125菌株于2011年3月10日在巴斯德研究所(法国巴黎)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)以编号CNCM I-4451提交。
其由ATCC6633野生型枯草芽孢杆菌菌株(Duitman et al，1999.Themycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633：a multifunctionalhybrid between a peptide synthetase，an amino transferase，and a fatty acidsynthase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，13294-13299[12])根据下述方案构建而成。
1.1包含εpbp-P repU -neo-εfenF和rep(R6K)的pBG200杂种质粒的构建方案。
根据在Sambrook and Russell，2001.Molecular cloning：a laboratorymanual，3rded.，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York[14]中描述的方案，用限制酶SphI(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER0601)和SacI(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER1131)消化pBG106质粒(Leclère et al，2005.Mycosubtilin overproduction by Bacillus subtilis BBG100enhances theorganism's antagonistic and biocontrol activities.Appl.Environ.Microbiol.，71，4577-4584[13])以分离和纯化序列SEQ ID NO：11的2.6千碱基对(kb)的片段εpbp-PrepU-neo-εfenF。
该序列携带有两个用于与枯草芽孢杆菌ATCC6633菌株的染色体进行同源重组的盒(εpbp和εfenF)。
同时，用限制酶Nspl(Fermantas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER1471)和SacI(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER1131)处理plasposon pTnMod-RKm’(Dennis and Zylstra，1998.Plasposons：modular self-cloning minitransposonderivatives for rapid genetic analysis of gram-negative bacterialgenomes.Appl.Environ.Microbiol.64，2710-2715[15])产生5个片段的混合物，包括携带451个碱基对(pb)的rep(R6K)的片段，其序列已经被分离和纯化(Sambrook and Russell，2001[14])。
然后使包含序列εpbp-PrepU-neo-εfenF和rep(R6K)的片段连接在一起(Sambrookand Russell，2001[14])。
所用限制酶的位点如下：
-Sphl：GCATGC(在序列SEQ ID NO：11的第1位)；
-Xbal：TCTAGA(在序列SEQ ID NO：11的第743和2088位)；
-Sacl：GAGCTC(在序列SEQ ID NO：11的第2630位)。
以如下方式包含盒εpbp、PrepU-neo和εfenF：
-盒εpbp：Sphl至Xbal(SEQ ID NO：12)；
-盒PrepU-neo：Xbal至Xbal(SEQ ID NO：13)；
-盒εfenF：Xbal至Sacl(SEQ ID NO：14)。
使用获得的连接物来转化大肠杆菌CC118(λpir)菌株(Herrero，de Lorenzo andTimmis，1990.Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selectionmarkers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes ingram-negative bacteria.J.Bacteriol.172：6557-67[16])，在包含20μg/ml新霉素的Luria-Bertani培养基(或者LB或Luria肉汤培养基)(Bertani，2004，Lysogeny at mid-twentieth century：P1，P2and other experimental systems.J.Bacteriol.186，595-600[17])上选择。在大肠杆菌(λpir)中获得的质粒被称为pBG200(3.1kb)。
图6示意性地示出了该构建。
1.2用于获得BBG116的方案
通过在amyE中插入Pspac-comK盒获得枯草芽孢杆菌RFB102菌株(来源于枯草芽孢杆菌ATCC6633的菌株)。Pspac表示由可通过IPTG诱导的质粒pA-spac(Bacillus GeneticStock Center,Columbus，OH，USA)产生的启动子，comK表示对于在芽孢杆菌中的天然感受态必需的基因。将其与被整合在染色体基因amyE中的抗大观霉素的基因相连(Pspac-comk-spc)。菌株RFB103具有提高的通过天然感受态转化的能力，其通过IPTG(异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷)诱导。其被预先通过质粒扩增系统TempliPhi(GE Healthcare)处理的pBG200转化，然后通过对新霉素的抗性进行选择，根据Dubnau，1982(Genetic transformation ofBacillus subtilis p148-178.In D.Dubnau(Ed)The molecular biology of theBacilli，vol.I.Bacillus subtilis.Academic Press，Inc.New York[18])中描述的方案。
在Nm-R克隆中，通过PCR使用引物PBP-F02：AATAACGGACATGCCGAAGTG(SEQ ID NO：1)和FENF-REV2：AATAGGCCGACCAAGACGTTC(SEQ ID NO：2)来验证RFB102染色体中通过盒εpbp-PrepU-neo-εfenF的双互换的插入。
根据在以下实施例2中描述的操作方法验证在22℃下在Landy/MOPS培养基中抗霉枯草菌素的过量产生。
因此，获得了枯草芽孢杆菌BBG116菌株。
1.3pBG144质粒的构建方案
按照下述构建用于使枯草芽孢杆菌的srfA操纵子插入失活(“敲除”)的6.5kb的pBG212质粒：
通过PCR使用引物SRF-FO ACAGGAATATGCTCAATCGAAG(SEQ ID NO：3)和SRF-REVAAATTCGCTTCCAGGCTTCTG(SEQ ID NO：4)由预先插入在质粒pGEN-T Easy(Promega Corp，Charbonnières，法国)中的枯草芽孢杆菌亚种枯草菌株168(NCBI登录号：PRJNA76)的基因组DNA产生εsrfAA(2.2kb)盒。
随后将该扩增子亚克隆在载体pUC19(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)的位点EcoRI(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER0271)处。
然后通过在位点MfeI(Fermentas参考ER0751)处插入tet基因中断εsrfAA盒，所述tet基因预先通过PCR使用引物TETP1GTTGTATCGATGATGAAATACTGAATTTTAAACTTAG(SEQ IDNO：5)和TETT1TTTAATGGATCTAGAAGATTTGAATTCCTGTTAT(SEQ ID NO：6)由作为蜡样芽胞杆菌(登录号：NC_001705.1)的来源质粒pBC16(DSMZ GmbH，Brunswick，德国)产生。
通过在位于基因tet末端的位点BstEII(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER0391)处插入基因cat获得质粒pBG144，所述基因cat预先通过PCR使用来源于金黄葡萄球菌的质粒pC194(DSMZ GmbH，Brunswick，德国，登录号：NC_002013.1)的引物pC194cmfwd AGAAAGCAGACAGGTAACCCTCCTAA(SEQ ID NO：7和pC194cmrevGCAGGTTAGTGACATTAGGTAACCGA(SEQ ID NO：8)产生。
图7示意性地示出了该构建。
1.4用于获得枯草芽孢杆菌BBG125的方案
根据在Dubnau，1982(Genetic transformation of Bacillus subtilis p148-178.In D.A.Dubnau(Ed)The molecular biology of the Bacilli，vol I.Bacillussubtilis.Academic Press，Inc.New York[18])中描述的方案，利用预先通过AatII(Fermentas，Villebon sur Yvette，法国；参考ER0991)线性化的质粒pBG144新转化枯草芽孢杆菌BBG116。
在含有合适的抗生素的琼脂糖LB培养基上分离6个Cm-R Tc-R克隆。通过PCR使用如下引物实施检查：SRFAA5-FWD；AAGGAATCTCGCAATCATTTATCG(SEQ ID NO：9)和SRFAA5REV；CTTGGTGTAAGCGGAATTTCTGTC(SEQ ID NO：10)。根据在以下实施例2中描述的操作方法验证在37℃下在Landy/MOPS培养基中不产生表面活性素。
采用突变体枯草芽孢杆菌BBG125作为抗霉枯草菌素的单一产生菌株。
两种枯草芽孢杆菌菌株BBG116和BBG125在包含5％血液的琼脂糖上具有溶血活性，并且在PDA培养基上对酵母和霉菌具有抗真菌活性。
由于产生的表面活性剂和过量产生抗霉枯草菌素之间的协同作用，这些活性在枯草芽孢杆菌BBG116菌株的情况下更为显著。由于琼脂糖培养基表面张力的降低，这些性能与该菌株在琼脂糖培养基的表面上形成菌落的能力密切相关。
下表1示出了枯草芽孢杆菌BBC125及其亲本菌株的特征总结：
表1：枯草芽孢杆菌BBG125及其亲本菌株的特征总结
[Com：用于转化的天然感受态；Myc：抗霉枯草菌素的产生；Srf：表面活性素的产生；Amy：淀粉分解活性；SpcR、NmR、TcR、CmR：分别为对大观霉素、新霉素/卡那霉素、四环素和氯霉素的抗性]
与枯草芽孢杆菌ATCC6633菌株相比，枯草芽孢杆菌BBG125菌株产生更大量的抗霉枯草菌素但是不产生任何表面活性素。
实施例2：培养基的制备
2.1Landy培养基
Landy培养基的组成如下：葡萄糖，20g/L；谷氨酸，5g/L；酵母提取物，1g/L；K2HPO4，1g/L；MgSO4，0.5g/L；KCl，0.5g/L；CuSO4，1.6mg/L；Fe2(SO4)3，1.2mg/L；MnSO4，0.4mg/L。
2.2储液
为了确保培养基组成的再现性，制备了无菌浓溶液。通过在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟对10×葡萄糖溶液(200g/L)进行灭菌。用5M KOH溶液将4×谷氨酸溶液(20g/L)调节至pH8并通过在孔隙度为0.2μm的过滤器上进行过滤来灭菌。通过在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟对20×酵母提取物溶液(20g/L)进行灭菌。用浓H2SO4酸化40×no1矿物质的溶液(K2HPO4，40g/L；MgSO4，20g/L；KCl，20g/L)至盐全部溶解并通过在0.2μm过滤器上进行过滤来灭菌。用浓硫酸酸化40×no2矿物质盐的溶液(CuSO4，64mg/L；Fe2(SO4)3，48mg/L；MnSO4，16mg/L)至盐全部溶解并通过在孔隙度为0.2μm的过滤器上进行过滤来灭菌。
2.3制备1升Landy培养基
除了无菌且一次性使用的移液管外，所用材料均预先通过在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟来进行灭菌，以无菌方式取出250mL谷氨酸溶液然后倾倒入锥形瓶中。以无菌方式向其中添加100mL葡萄糖溶液，然后添加50mL酵母提取物溶液，最后添加25mL每一种矿物质溶液。用无菌的5M KOH溶液将pH调节到7.0。用无菌水将体积补充到1升。
2.4制备用100mM MOPS缓冲的Landy培养基
通过将20.93g3-[N-吗啉代]丙磺酸(MOPS)(M1254，Sigma，St Louis，MO，USA)溶解在50mL水中来制备20×MOPS缓冲液(2M)。在层流净化罩下于孔隙度为0.2μm的过滤器上对溶液进行灭菌。向在实施例2.3中制备的混合物中添加50mL20×MOPS以制备用MOPS缓冲至100mM的1升Landy培养基。
实施例3：在锥形瓶中培养枯草芽孢杆菌BBG125
3.1菌株保藏品的制备
用枯草芽孢杆菌BBG125的原代菌株保藏品的菌落接种含有5mL改良E培养基(通过将葡萄糖浓度由40g/L降低至20g/L来改良Clark E培养基。该培养基的组成如下：KH2PO4，2.7g/L；K2HPO4，18.9g/L；酵母提取物，0.5g/L；葡萄糖，20g/L；EDTA，0.05g/L；MgSO4，0.61g/L；MnSO4，0.056g/L；NaCl，0.1g/L；CaCl2，0.012g/L；ZnZO4，0.018g/L；FeSO4，0.018g/L；CuSO4，0.002g/L；Na2MoO4，0.001g/L；H3BO3，0.001g/L；Na2SO3，0.001g/L；NiCl2，0.0037g/L；NH4NO3，4g/L；MgSO4，1g/L。溶液的pH用10％HCl溶液调节到6.5)的螺旋形管并在300转/分钟(rpm)的搅拌下于30℃孵育48小时。然后通过涡流使溶液均质化。将之前获得的1.5mL体积的培养物添加到包含在500mL锥形瓶中的48.5mL改良E培养基中。将其整体在120rpm的搅拌下于30℃孵育12至24小时。将该第一预培养物P1备份。
然后通过涡流使该培养物均质化，接着用分光光度计(SECOMAN Prim，SECOMAN，Domont，法国)测量DO600nm，直到枯草芽孢杆菌BBG125菌株处于对数生长期的开始/中期。
用1.5mL的最好的烧瓶培养物P1接种预培养物P2并备份。500mL锥形瓶包含终体积为50mL的改良E培养基，并在120rpm搅拌下于30℃孵育。当DO600nm指示培养物处于对数生长期的开始/中期时(1<DO600nm<5)使生长停止。通过用显微镜观察以及通过用补充有100μg/ml大观霉素的营养Luria-Bertani琼脂糖(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；NaCl，10g/L，pH7.2和Mossel琼脂糖(肉膏，1g/L；蛋白胨，10g/L；D-甘露醇，10g/L；NaCl，10g/L；酚红，0.025g/L；琼脂，12g/L；蛋黄，10mL/l；多黏菌素，5mL/l，pH7.1)(更具体地，杆菌的)接种来检查P2的纯度和质量。将皿在30℃孵育24小时。
应注意的是，枯草芽孢杆菌产生不规则形状(轮廓为波浪状并可呈现细丝)的菌落，膏状稠度，直径为2mm至4mm。在老培养物中，菌落采取干燥粗糙外观，并且在琼脂糖中变得包有外壳(encrusted)。
最后，用最好的烧瓶P2以5％接种含有200mL如上所定义的改良E培养基的2升烧瓶。将该烧瓶在120rpm搅拌下于30℃孵育，当DO600nm指示培养物处于对数生长期的开始/中期(1<DO600nm<5)时使生长停止。按照P2所述检查培养物的质量和纯度。将培养物在25℃下以2000g离心10分钟。在无菌的生理水中洗涤残余物，然后将悬液在25℃下以2000g离心10分钟。将残余物置于一定体积的不含抗生素的E培养基中，以获得每个管25的最终DO600nm。使悬液以0.9mL培养物对0.6mL甘油的比例分布在冷冻管中。通过涡流对该管进行均质化并储存在-80℃下。用100μg/ml大观霉素补充E培养基。
3.2接种物的制备
由在40％甘油中保持于-80℃的含细胞的菌株保藏品制备接种物。用10％HCl溶液(v/v)将包含5mL如下文所定义的改良E培养基的管调节至pH7.0并用0.5mL的菌株保藏品的细菌悬液接种。将该整体在300rpm搅拌下于30℃孵育10至14小时。然后通过涡流对该管进行均质化并测量DO600nm。然后以包含在500mL锥形瓶中的pH7.0、终体积50mL的改良E培养基中制备预培养物P1。将该整体在140rpm搅拌下于30℃孵育，当菌株处于对数生长期的开始/中期(1<DO600nm<5)时停止预培养。将该第一预培养物P1备份。
以与预培养物P1相同的方式制备第二预培养物P2，用第一烧瓶P1接种第二预培养物P2并备份。然后将在烧瓶中开始培养所必需的体积在25℃下以2000g离心10分钟。将残余物放回10mL无菌生理水中的悬液中。再将获得的悬液以2000g离心10分钟。最后将残余物置于10mL无菌生理水中。然后将悬液做好接种准备。
3.3在锥形瓶中培养
实验持续至少72小时，并且从这些培养物中采集多个样品。初始DO600nm为0.1至0.4。锥形瓶的容积为500mL，营养培养基的体积为100mL。在层流净化罩下以无菌方式对采集的样品进行以下测量：通过在营养琼脂糖和Mossel琼脂糖+大观霉素(100μg/ml)上分离来检查纯度、测量600nm处的光密度、测量pH、测量干重并取出培养物上清液用于通过HPLC定量分析脂肽：在4℃下将3mL培养物以10,000g离心10分钟并将培养物上清液储存在-20℃。
实施例4：脂肽的纯化和分析
4.1脂肽的纯化
在1g Maxi-clean C18凝胶盒(Grace Davison-Alltech，Deerfield，IL，USA)上提取脂肽。
用100％甲醇调节1g ODS的盒，首先通过20mL，然后8mL。接着用8mL的milli-Q水(Millipore)冲洗该盒。然后在柱上加载pH为6.5±0.1的1ml培养物上清液。接着用8mL的milli-Q水洗涤该盒。在用20mL空气干燥该盒之后，用4mL100％甲醇洗脱脂肽。通过真空浓缩器干燥洗脱物。随后将样品置于4℃下的200μl100％甲醇中以使得能够进行HPLC分析。
4.2通过高效液相色谱(HPLC)分析
借助完整的HPLC系统(Waters制造，在线脱气器、717自动进样器、660S控制器、626泵、2996光电二极管阵列)(Waters SAS，Guyancourt，法国)使用C18柱(5μm，250×2.5mm，VYDAC218TP)对样品进行分析。进行两项分析。
第一项分析为抗霉枯草菌素分析：以0.6mL/分钟的流量注入10μl经纯化的样品并与500mg/分钟的伊枯草菌素A标准品(I1774，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)进行比较。使用60/40/0.1(v/v/v)的水/乙腈/三氟乙酸溶剂以无梯度模式进行洗脱。
第二项分析为表面活性素分析。以0.6mL/分钟的流量注入10μl经纯化的样品并与500mg/L的表面活性素标准品(S3523，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)进行比较。使用20/80/0.1(v/v/v)的水/乙腈/三氟乙酸溶剂以无梯度模式进行洗脱。
借助Millennium软件对保留时间和各峰的200nm至400nm之间的光谱的第二漂移(二极管阵列，PDA2996，Waters)进行自动化分析以识别洗脱出来的分子。
4.3通过半制备型HPLC分析
通过应用上文实施例4.1描述的纯化方案使用10g Maxi-clean C18凝胶盒(GraceDavison-Alltech，Deerfield，IL，USA)制备样品。使用10g盒使得可以加载10mL的培养物上清液而不是之前的1mL。除了甲醇的体积外，所有体积均乘以系数10。用于调节盒然后洗脱脂肽的甲醇的最小体积为10mL。将样品手动装载(100μl)到半制备型HPLC(Waters制造，660控制器、626泵、486吸收检测器)的进样系统中。所用的柱是C18(5μm，300×10mm，ACE)。根据下表2中给出的梯度以3mL/分钟的速率进行洗脱：
表2：根据缓冲液A和缓冲液B的各自浓度进行洗脱
时间(分钟) 缓冲液A(％) 缓冲液B(％)
0 65 35
4 65 35
54 50 50
60 0 100
61 65 35
65 65 35
所使用的溶剂如下：由水和三氟乙酸以99.9/0.1(v/v)构成的溶剂A以及由乙腈和三氟乙酸以99.9/0.1(v/v)构成的溶剂B。
4.4通过MALDI-TOF质谱分析
根据需要使用以下物质通过MALDI-TOF质谱(Bruker Ultaflex)进行分析：培养物上清液，或者在ODS盒(Grace Davison-Altech，Deerfield，IL USA)上纯化的样品或在ODS盒上并通过半制备型HPLC纯化的样品。通过制备33/67/0.1(v/v/v)的CH3CH/水/三氟乙酸混合物来制备TA缓冲液。CHCA缓冲液是α-氰基-4-羟基肉桂酸在TA缓冲液中的饱和溶液。该缓冲液通过回收α-氰基-4-羟基肉桂酸/TA缓冲液离心后的上清液来制备。通过将1μl样品与9μlHCA缓冲液混合来制备待分析样品。通过MALDI-TOF分析沉积的样品的溶液占0.5μl的体积。在开放空气中进行干燥。利用标准肽的混合物对质量进行校正。
获得的抗霉枯草菌素和表面活性素的多种同系物的离子[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+的计算质量示于下表3中：
表3：抗霉枯草菌素和表面活性素的多种同系物的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+离子的计算质量
HPLC分析显示了10个峰，这些峰所检测的分子的分子质量示于下表4中：
表4：通过HPLC分析检测的10个峰的质量
峰编号 质量 峰编号 质量
1 1056 6 1098
2 1084 7 1098
3 1084 8 1084
4 1070 9 1084
5 1070 10 1098
4.5通过MS-MS分析新抗霉枯草菌素的结构
为了精确确定BBG125菌株产生的多种形式的抗霉枯草菌素的结构，在通过用浓度相当于抗霉枯草菌素的70％醋酸溶液中的N-溴代琥珀酰亚胺处理起始肽环之后，通过具有直接进样模式的电喷射型电离的串联质谱(MS-MS)对经纯化的样品进行分析。
对经纯化的C17反异抗霉枯草菌素(峰8)进行第一分析。获得的光谱(MS1)由于Br的两种同位素而复杂化。因为Asn和Gln氨基酸的存在，光谱MS2由于存在缺少1、2或3个-NH3基团的片段而复杂化。初始产物的MS光谱具有峰1085[M+H]+、1107[M+Na]+和1123[M+K]+，明显对应于C17抗霉枯草菌素。
由于存在相当近似数量的同位素79BR和81Br，1260附近观察到的确对应于预期漂移的峰分布。例如，1257.4处的峰对应于具有两个79Br的[M+H]+，1259.4处的峰对应于具有79Br和81Br的[M+H]+或者具有两个13C和两个79Br的[M+H]+等。
下表5中给出了由1257.4处的离子的片段获得的提高的质量的顺序。
表5：由1257.4处的离子的片段获得的提高的质量
在上表中，“m/z”意指质荷比。
4.6包含在峰6中的1274.4处的峰的MS-MS分析
处理前的同位素质量：M＝1098.6。
处理后的同位素质量(具有79BR2)：M＝1270.4。
片段y与C17反异抗霉枯草菌素相同。
片段b比C17反异抗霉枯草菌素的片段b大14。
这意味着开放序列中的前两个氨基酸之一(NQPSNvNw的N或Q)非常有可能已经被修饰。
4.7包含在峰10中的1274.4处的峰的MS-MS分析
处理前的同位素质量：M＝1098.6。
处理后的同位素质量(具有79Br2)：M＝1270.4。
片段y与抗霉枯草菌素反异C17相同但多出14，在1029处而非对于所有其他样品而言的1015处包括强y6峰。
小于b6的片段b与反异C17抗霉枯草菌素相同。
大于或等于b6的片段b与抗霉枯草菌素相同但是多出14。
这些结果表明该分子可能是具有C18而非C17脂肪酸的抗霉枯草菌素。
基于各个峰洗脱顺序，本发明人由此推断存在5种新形式的抗霉枯草菌素：形式Gln3、异C16、正C16、反异C17、异C17和C18形式。下表6中给出了这些形式与具有通过实施例4.5的HPCL分析检测的分子之分子质量的十个峰的对应关系：
表6：通过HPLC分析检测的10个峰的质量与抗霉枯草菌素形式的对应关系
峰编号 质量 形式 峰编号 质量 形式
1 1056 C15 6 1098 反异IC17
GLN
2 1084 异C16GLN 7 1098 异C17GLN
3 1084 正C16GLN 8 1084 反异C17
4 1070 异C16 9 1084 异C17
5 1070 正C16 10 1098 C18
该新C18抗霉枯草菌素的结构式如下：
该新C17Gln3抗霉枯草菌素的结构式如下：
实施例5：抗霉枯草菌素(MS)的多种同种型对多种微生物的生物活性
根据以下文献中描述的方案通过在液体培养基中连续稀释C18同种型(C18MS)来针对抗真菌活性进行测试：Besson et al.1979.Antifungal activity upon Saccharomycescerevisiae of iturin A，mycosubtilin，bacillomycin L and of their derivatives；inhibition of this antifungal activity by lipid antagonists.J.Antiobiot.(Tokyo)32，828-833)[19]。在96孔微孔板中于丰富培养基中进行培养，所述丰富培养基包含：葡萄糖，40g/L；蛋白胨，10g/L；酵母提取物，2g/L；pH＝7.2。以0.55DO600mm接种酿酒酵母并在24小时后读取吸光度，然后确定最小抑制浓度(MIC)。
还利用抗霉枯草菌素(MS)的以下同种型进行该实验：MS异C16、MS正C16、MS反异C17、MS异C17。还利用抗霉枯草菌素的组合物(MS comp.)进行，所述抗霉枯草菌素的组合物包含相对于组合物的重量百分比：26％的MS异C16、1％的MS Gln3C17、2％的MS正C16、44％的MS反异C17、23％的MS异C17和1％的MS C18。
还针对以下微生物用每一种前述抗霉枯草菌素的同种型和组合物进行该实验：灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、黑曲霉(Aspergillus niger)、核盘菌(Sclerotiniasclerotium)、白色念珠菌(Candida albicans)。
下表7中给出了这些实验中的每一种获得的MIC：
表7：多种抗霉枯草菌素同种型和组合物对于多种微生物的MIC
这些结果表明组合物MS comp.具有等于或甚至优于目前使用的抗霉枯草菌素的效果。
实施例6：在气/液膜接触器上实施产生、提取和浓缩由枯草芽孢杆菌产生的脂肽的综合方法
该实施例的描述参考图1至5。
在该实施例中：
-泵P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13和P14是Masterflex L/S蠕动泵紧凑驱动模型(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，U.S.A.)，
-泵P11是N820.3FT.18型(KNF Neuberger Laboport，Freiburg，德国)，
-阀V1、V4和V5是由PTFE制成的截止阀(W3250Y，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国)，
-阀V2、V3、V6和V7是由PTFE制成的三通截止阀(W3250Z，Thermo FisherScientific，Roskilde，德国)，
-容器2和容器4是由高密度聚丙烯制成的具有4升有效容积的Nalgene容器(2125-4000Heavy Duty Bottles，Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国)，
-容器1、容器3、容器5、容器6和容器7是由高密度聚丙烯制成的具有10升或20升有效容积的Nalgene容器(2250Autoclavable Carboys，Nalgene，Thermo FisherScientific，Roskilde，德国)，
-秤B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7是CKW-55type型(Ohaus Corporation，Pine Brook，NJ，U.S.A.)，
-枯草芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌BBG125菌株。
6.1用于培养的环境条件和传感器
除非相反地指出，否则分别通过泵P2和泵P3受控地添加预先通过在121℃高压蒸汽灭菌20分钟来灭菌的0.66M H3PO4或3M NaOH的溶液来将pH调节至7±0.1。
在对容器进行高压蒸汽灭菌之前使用缓冲至pH4.0和pH7.0并储存在4℃的商业溶液校准pH电极。该过程借助Alpha Laval1m2管式热交换器(104878，Alpha LavalCorporate AB，Lund，Sweden)在22℃±0.1℃进行。借助氧传感器(Mettler Toledo，Viroflay,法国)测量溶解氧的浓度pO2。在每次实验时更新氧传感器的电解质。在对容器进行高压蒸汽灭菌之后，当培养基达到实验的设定温度和pH时校准氧传感器。通过将传感器的电缆接地得到0％的pO2，通过利用空气使培养基达到饱和(1000rpm和1vvm)得到100％pO2。
通气速率(Fe)固定为每体积液体每分钟0.25体积空气(vvm)，也就是说对于3升Landy培养基为0.75升/分钟(实施例2.1)。通过0.2μm杀菌过滤器过滤进入的空气。
用于过程控制和数据获取的软件是AFS Biocommand(New BrunswickScientific，Edison，NJ，U.S.A.)。在培养48小时后以及培养结束时检查培养物的纯度。定期获取10mL培养物样品并离心，确定光密度和干重，并在分析之前储存上清液。分析进入和排出的气体以获得微生物呼吸的数据。顺磁性传感器使得可以分析氧气的量，而红外传感器使得可以分析二氧化碳的量(Xentra4400；Servomex Company Inc.，Sugar Land，TX，U.S.A.)。分析仪整合在复用设备中，所述复用设备提供在6个通道上的依次分析，在Naflon膜(Permapur,Saint-Léonard，魁北克)上干燥气体并自动校准。
6.2气/液膜接触器
在本实施例中使用的气/液膜接触器M1由GE-Healthcare提供，参考CFP-6-D-45(GE-Healthcare Europe GmbH，德国慕尼黑)。其由包含两个隔室C1和C2的外部模块组成。含氧的无菌气体在隔室C1中循环。在隔室C2中，包含接种物的培养基通过泵P4以24升/小时/m2的速率在膜上循环。
膜M1具有2.5m2的表面积，并且在使用之前通过在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟进行灭菌(该标准并非穷举)。该膜由孔隙率为0.65μm的一组中空聚醚砜纤维组成。
6.3.用于连续培养枯草芽孢杆菌的设备：将用于提取/浓缩生物表面活性剂的系 统与气/液膜接触器偶联
6.3.1.将用于提取/浓缩脂肽的系统与气/液膜接触器偶联
用于连续培养枯草芽孢杆菌的设备包含由中空纤维制成的气/液膜接触器M1，枯草芽孢杆菌BBG125在所述膜接触器M1中的Landy培养基中培养。固定在膜M1的表面上的枯草芽孢杆菌BBG125通过分泌生物表面活性剂来降解该基质。该设备还包含用于在包含膜M1的产生设备中连续供应和排放给定流量的所述基质的装置。
膜M1借助于氧扩散经过其孔在无菌环境中提供培养基中微生物的生长所必需的氧气。
蠕动泵P1以流量F1连续地为膜M1供应储存在容器1中的新鲜Landy培养基，同样，蠕动泵P5以流量F2连续地从包含上述膜1的产生设备中排出培养基。
接种物和发酵条件保持与之前描述的那些相同。为了保持环境无菌，将设备的所有组件和所用多个膜在121℃灭菌20分钟。
该设备的一个特征源于如下事实：在已经从微生物中移出有机物的残余物和生物表面活性剂后，可以再循环或不再循环所述包含膜M1的生产设备中的所有微生物细胞，这使得可以在生产设备中获得微生物的高速生长。
此外，该设备能够使氧扩散到培养基中而不形成气泡或泡沫。
6.3.2.通过微滤提取脂肽并再循环细胞
因此，前述设备的特征在于以下事实：其包含位于产生设备的排出口(discharge)处的切向微滤装置和超滤装置，所述微滤装置和超滤装置将液体分离成数个级分。
在膜M2上进行第一微滤步骤，所述膜M2由中空聚醚砜纤维制成，其孔径为0.2μm，表面积为0.4m2(GE Healthcare)，称作残余物的包含细胞的培养基借助上述容积泵P4在膜M2的隔室C3中循环。在容积泵P5的作用下，培养基通过切向过滤经过膜M2的孔到达膜M2的隔室C4。通过这种方式，从包含生物表面活性剂的培养基中除去细胞，并进行提取然后在通过电机B驱动的刀片或磁力搅拌(磁力搅拌器，W10512，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国)以160rpm的速度搅拌的容器2中收集。
连续地从包含膜M1的产生设备中排出培养基到容器2中。为了补偿该排出并保持膜M1中的恒定容积，泵P1向生物反应器供应包含在容器1中的新培养基。
此外，容器2和容器3分别安置在秤B2和B3上。后者控制蠕动泵P1(CKW-55；OhausCorporation，Pine Brook，U.S.A.)的输出，使得可以保持膜M1内部的恒定体积，从而获得F1＝F2。在进行的每一个实验中，在通过至少四个包含膜M1的气/液膜接触器容积后改变稀释度。
泵P1和P5的输出相等并且调节该输出以在包含膜M1的设备中获得0.1h-1的稀释度，也就是说小时流量等于包含于包含膜M1的产生设备中的水相之体积的0.1倍。
还实施了该方法的变化形式。其由再循环或不再循环膜M1内部的细胞组成。于是其为图3和图4中以虚线表示的开放的连续模式。在不通过一组阀V6、V7和V8再循环的情况下，可以通过泵P13将培养基从膜M1泵出培养基并收集在容器7中。排出阀使得可以间歇地清除细胞浓缩物。在这种情况下，直接在容器7中包含的培养基上通过膜M1进行微滤步骤，然后将细胞在容器7中而不是在包含膜M1的产生设备中浓缩。
6.3.3.通过超滤浓缩脂肽
包含在容器2中的滤液最终被借助泵P6驱动到不锈钢切向超滤系统(Sartocon2plus，17546---202，Sartorius，德国哥廷根)的隔室C5中，所述超滤系统包括由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜M3(Hydrosart Ultrafilter,3021443930E-BSW，Sartorius，德国哥廷根)。在高于临界胶束浓度时，生物表面活性剂在隔室C5中浓缩，其被称为残余物，从而返回容器2。在泵P7的控制下以等于泵P5的速率将培养基提取到隔室C6中，其被称为超滤液，并收集在容器3中。流量取决于由泵P7施加的流量并借助通过多个秤B2、B3和B4收集的信息进行调节。
6.4.脂肽的纯化
6.4.1.通过超滤/渗滤纯化
本实施例所示脂肽的纯化基于通过不锈钢切向超滤系统(Sartocon2plus，17546---202，Sartorius，德国哥廷根)进行的超滤步骤的串联，所述不锈钢切向超滤系统包括由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜M4(Hydrosart Ultrafilter,3021443930E-BSW，Sartorius，德国哥廷根)。该步骤的目的是从培养物肉汤中除去大部分的残余物质，例如葡糖糖、谷氨酸盐和多种初级代谢产物。当抗霉枯草菌素形成的胶束和胶束复合物大于其CMC时，通过使用超滤膜M4，可以将其保留从而在残余物中浓缩。
该步骤在25℃和0.5巴的压力下进行。这一纯化步骤在容器2中的浓缩脂肽上进行。在打开阀V1后，泵P8将浓缩物驱动到容器4(Nalgene，由高密度聚丙烯制成，有效容积为4升(2125-4000Heavy Duty Bottles，Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国))中，与电机B相同，其通过由电机C驱动的刀片或磁力搅拌(磁力搅拌器，W105112，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国)进行搅拌。
依次进行以下步骤：
-超滤：在Masterfiex L/S蠕动泵P8紧凑驱动模型(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，U.S.A.)的控制下将浓缩物转移到容器4中，然后在Masterfiex L/S蠕动泵P9紧凑驱动模型(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，U.S.A.)的控制下在膜M4上纯化并收集在容器4中。Masterflex L/S蠕动泵P10紧凑驱动模型(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，U.S.A.)使得培养基的剩余成分通过隔室C8和容器5(Nalgene，由高密度聚丙烯制成，有效容积为10升或20升(2250Autoclavable Carboys，Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国))。该过程持续到容器4中包含的体积降低到容器4中初始体积的10％。
-渗滤：该步骤稀释培养物肉汤以有助于残余物质通过超滤膜M4。然后通过打开阀V2向容器4中添加水直到容器4中的体积恢复其原来的水平。接着如上文所述进行超滤步骤。该渗滤步骤相继进行4次。
-在甲醇(MeOH)的存在下进行超滤：在渗滤步骤之后，通过Masterflex L/S蠕动泵P12紧凑驱动模型(Cole Parmer,Vernon Hills，IL，U.S.A.)和阀V2将MeOH从容器6(Nalgene，由高密度聚丙烯制成，有效容积为10升或20升(2250Autoclavable Carboys，Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Roskilde，德国))添加到容器4中。通过秤B4、B5和B6控制这一MeOH添加从而使此时存在于容器4中的溶液包含70％MeOH(v/v)。接着如上所述进行超滤步骤。该步骤将破坏胶束并使抗霉枯草菌素单体通过膜M4的孔。
过滤之后，借助一组阀V3和V4将由抗霉枯草菌素和70％甲醇组成的溶液收集在超滤液一侧，但这一次超滤液收集在Rotavapor VV2000蒸发器(Evapo)(HeidolphInstruments GmbH&Co.，德国施瓦巴赫)的容器中。
在每一步骤的最后，从滤液侧和残余物侧收集样品。从而可以建立纯化的平衡。这使得可以通过计算超滤后获得的浓缩抗霉枯草菌素的量与容器4中初始存在的抗霉枯草菌素的量之比来确定超滤步骤和渗滤步骤造成的抗霉枯草菌素的损失。这些步骤的产率大于70％。
6.4.2.通过蒸发浓缩脂肽
蒸发器(Evapo)通过除去全部甲醇和一些水来使抗霉枯草菌素浓缩。这一蒸发在由N820.3FT.18型真空泵P11(KNF Neuberger Laboport，Freiburg，德国)施加的50毫巴的剩余压力下和50℃下进行。在这一步骤期间，甲醇被蒸发并且其蒸气通过冷凝器冷凝并在容器6中再循环。
6.4.3.脂肽的冷冻干燥
在本方法中提高任选的冷冻干燥步骤以改善产品的保存。使用由蒸发产生的浓缩溶液X直接进行脂肽的冷冻干燥并通过阀V5回收。首先在-20℃下冷冻，然后借助HetoPower Dry PL9000冷冻干燥器(Jouan Nordic，Allerod，Denmark)根据以下步骤进行冷冻干燥：-30℃下1小时；-10℃下5小时；在0℃下5小时；在-20℃下5小时；在35℃下5小时。在15毫巴的剩余压力下进行冷冻干燥。
实施例7：膜的洗涤和脂肽的回收
由于脂肽对界面的亲和力，研究并优化用于洗涤膜的方案。考虑膜的性质并结合最近出版的关于该主题的工作(Chen，Chen and Juang，2007.Separation of surfactinfrom fermentation broths by acid precipitation and two-stage dead-endultrafiltration processes.J.Membr.Sci.299，114-121[20]；Chen，Chen，and Juang，2008.Flux decline and membrane cleaning in cross-flow ultrafiltration oftreated fermentation broths for surfactin recovery.Sep.Purif.Technol.62，47-55[21])。这些洗涤不使脂肽或膜变性。尽管禁止使用溶剂，但是有一些例如甲醇对于脂肽的分离非常有效。对于pH的敏感性的测试确定pH＝10是脂质的降解极限。在搅拌和发酵条件下进行洗涤。以7个基于水的洗涤步骤实施该方案。
-用3升30℃的蒸馏水进行两次30分钟的洗涤。这些分离轻微固定的生物质。
-用30℃的蒸馏水进行第二洗涤，使得可以测量氧转移系数。
-用3升50℃的0.1M NaOH进行两次1小时的洗涤。这些分离高度固定的生物质并解吸附大部分脂肽。
-然后用50℃的0.5M NaOH溶液使膜再生1小时后用50℃的100ppm NaOCl溶液再生1小时，然后用25℃的蒸馏水清洗直到在膜中获得中性。
每个膜实施整个前述方法两次，从而使得其可以连续洗涤和再生。这使得可以不间断地实施所述方法。为了实施该作为替代的方法，向设备中提高包含0.1M和0.5M苏打溶液的容器(未示出)。
实施例8：产生的生物表面活性剂的量化
在本实施例中，进行了若干测试以在包含3升培养基并且气/液膜接触器的总表面积为2.5m2的产生设备中通过利用枯草芽孢杆菌发酵20g/L浓度的葡萄糖来产生生物表面活性剂，所述气/液膜接触器符合实施例6中描述的气/液膜接触器。每个实验重复两次。以下仅给出了这些双份的平均值。标准偏差为5％至15％。
实验条件调节如下：
-pH保持在7，
-气/液膜接触器中的空气流量为1vvm，
-培养基体积为3升，其以0.021m/s的速率在所述膜的纤维内循环，
-除了空气入口处外，整个系统的压强为大气压强，空气入口处的压强可能比大气压强稍微高出0.4巴，
-培养基的供氧条件固定为约40h-1的体积氧转移系数。
利用HPLC的色谱分析量化各容器中的基质和生物表面活性剂。
分析消耗的氧使得可以确定固定在膜上的细胞的量。
考虑到游离的细胞和固定的细胞具有不同的比氧消耗速率，相比于悬液中的细胞，氧气更容易接近固定在膜上的细胞，使用下式确定随着时间固定在膜上的生物质(g m-2)：
在给定时间固定在膜上的生物质(g m-2)＝(OUR-(X＊OURspe cl))＊V/(OURspeci＊a)
其中：
OUR＝氧消耗速率
OURspe cl＝游离细胞的比耗氧速率
OURspe ci＝固定细胞的比耗氧速率
V＝反应体积
X＝游离生物质的浓度
a＝膜的表面积
根据实施例7中描述的方法进行这些实施例中描述的膜的洗涤步骤。
8.1以分批方式由枯草芽孢杆菌BBG125产生抗霉枯草菌素
在该实施例中，以分批方式将枯草芽孢杆菌BBG125菌株在气/液膜接触器M1中于30℃培养48小时。
8.1.1产生的生物质的分析
在该方法中，观察到两种类型的生物质，一种游离在培养基悬液中，另一种固定在气/液膜接触器上。
将游离细胞以0.2h-1的比生长速率以指数方式培养至最多第18小时。游离生物质在培养1天后达到最大值2.6g L-1，然后保持恒定直到培养结束。
气体分析显示存在固定在膜上的生物质。该生物质在培养的第一天增长以达到1.2g m-2。在培养的第一天测量到葡萄糖的消耗速率为0.61g L-1h-1，然后其随着葡萄糖在培养基中耗尽而下降。
8.1.2产生的抗霉枯草菌素的分析
在培养2天后抗霉枯草菌素的产生达到10mg L-1。在洗涤膜的过程中解吸附了45mg，导致总共产生25mg L-1，并且平均产率为0.5mg L-1h-1。在通过微滤、超滤/渗滤和干燥步骤纯化后，得到了包含新形式的抗霉枯草菌素的粉末形式的抗霉枯草菌素混合物。该混合物的纯度超过94％。
8.2利用完全再循环细胞连续产生、提取和纯化由枯草芽孢杆菌BBG125产生的抗 霉枯草菌素
在本实施例中，在气/液膜接触器M1中将能够以组成型方式只产生抗霉枯草菌素的枯草芽孢杆菌BBG125菌株(于2011年3月10日在巴斯德研究所(法国巴黎)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)以编号CNCM I-4451提交)在22℃连续培养72小时。
除了可允许细胞生长和固定的气/液膜接触器外，本实施例中的方法的特征还在于存在：
-根据实施例6描述的那些，用于在所述反应器中连续供应和排放所述基质的给定流的设备，
-根据实施例6描述的微滤膜M2，其表面积为0.45m2，孔径为0.2μm，
-三个容器：根据实施例6描述的那些，供料(容器1)、浓缩(容器2)和废料(容器3)，
-根据实施例6描述的超滤膜M3，其表面积为0.1m2，截留阈值为10kDa。
此外，根据本实施例中描述的那些，泵P1的供料速率和泵P5的排放速率相等并且被调节以得到约0.1h-1的稀释度，也就是说小时速率等于产生设备中包含的水相之体积的0.1倍。
根据本发明的该方法的一个特征在于以下事实：在从微生物细胞中除去有机物质的残余物和生物表面活性剂之后再循环产生设备中的所有微生物细胞，这使得可以在膜上获得高生长速率的微生物。连续培养之前是20小时的分批培养。
8.2.1生物质的分析
在以0.1h-1的稀释度连续培养的前40小时期间，肉汤中的游离生物质持续提高至最多7.2g L-1。接下来，其浓度保持恒定，这无疑地显示存在抑制剂。另一方面，气体分析显示细胞大量固定在膜上，其在培养3天后达到3.1g m-2。在前两天的培养期间，葡萄糖的浓度随着1.5g L-1h-1的葡萄糖消耗速率而下降。
8.2.2所产生的表面活性素的分析
因此，通过微滤膜提取抗霉枯草菌素并确实通过10kDa超滤膜浓缩；观察到其在中间容器中积累。在培养的前40小时期间，抗霉枯草菌素的产生速率提高并达到最大值1.5mgL-1h-1。在该实验之后，洗涤膜，回收到84mg抗霉枯草菌素。在该实验最后，连续培养在溶液中产生895mg抗霉枯草菌素，也就是说消耗的每升培养基产生了平均产生浓度为48mg的抗霉枯草菌素。超滤/渗滤步骤在溶液中获得90％纯度的表面活性素。该连续方法显示的产生率是在实施例8.1中描述的分批模式获得的产生率的3倍。
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Claims (6)

1.抗霉枯草菌素，其脂肪酸链包含18个碳原子，并且所述抗霉枯草菌素是如下式(I)所示的C18抗霉枯草菌素：
2.抗霉枯草菌素，其脂肪酸链包含17个碳原子，并且其肽环3位处的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，并且所述抗霉枯草菌素是如下式(II)所示的C17Gln3抗霉枯草菌素：
3.组合物，其包含至少一种根据权利要求1所述的C18抗霉枯草菌素和/或至少一种根据权利要求2所述的C17Gln3抗霉枯草菌素。
4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含至少一种选自包含以下的组的抗霉枯草菌素：异C16抗霉枯草菌素、正C16抗霉枯草菌素、反异C17抗霉枯草菌素、异C17抗霉枯草菌素及其混合物。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其包含1％至60％的异16抗霉枯草菌素、1％至20％的C17Gln3抗霉枯草菌素、1％至10％的正C16抗霉枯草菌素、20％至95％的反异C17抗霉枯草菌素、5％至30％的异C17抗霉枯草菌素和1％至5％的C18抗霉枯草菌素，其中各组分含量之和为100％。
6.根据权利要求1或2所述的抗霉枯草菌素或者根据权利要求3至5中任一项所述的组合物，其用作抗真菌剂。
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High-level biosynthesis of the anteiso-C17 isoform of the antibiotic mycosubtilin in bacillus subtilis and characterization of its candidacical activity;Patrick Fickers et al;《Applied and Environmental Microbiology》;20090731;第75卷(第13期);4636-4640 *
Mycosubtilin overproduction by bacillus subtilis BBG100 enhances the organism’s antagonistic and biocontrol activities;Leclere V et al;《Applied and Environmental Microbiology》;20050801;第71卷(第8期);4577-4584 *
Production of surfactin and fengycin by bacillus subtilis in a bubbleless membrane bioreactor;Coutte F et al;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20100311;第87卷(第2期);499-507 *

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