CN104095765B - 包含鼠李糖脂的混合物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含鼠李糖脂的混合物组合物及其制备方法、以及其用于制备配制物的用途和包含所述混合物组合物的配制物。

Description

包含鼠李糖脂的混合物组合物
技术领域
本发明涉及包含鼠李糖脂的混合物组合物及其制备方法、以及其用于制备配制物的用途和包含所述混合物组合物的配制物。
背景技术
鼠李糖脂是由某些细菌例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)自然而然产生的糖脂。微生物通常产生包含单-鼠李糖脂和二-鼠李糖脂的鼠李糖脂的混合物,所述鼠李糖脂的混合物每分子含有一个或两个鼠李糖单元并可含有不同长度的脂质链。
EP153634描述了一种具有几乎平衡的重量比的单-鼠李糖脂和二-鼠李糖脂的混合物组合物。
同样地,EP0499434在实施例3中描述了具有平衡的重量比的双成分的鼠李糖脂组合物。
EP2410039描述了含有重量比为95:5至45:55的单-鼠李糖脂和二-鼠李糖脂的清洁组合物。
例如陈等人在Solution self-assembly and adsorption at the air-waterinterface of the monorhamnose and dirhamnose rhamnolipids and their mixtures,Langmuir.2010Dec7;26(23):18281-92中描述了纯的二-鼠李糖脂、纯的单-鼠李糖脂及它们的混合物的表面活力特征。
迄今已知的通过简单的发酵方法可制备的鼠李糖脂的缺点是它们相对小含量的二-鼠李糖脂。
除此之外,这些鼠李糖脂组合物相对通常包含具有仅一个酰基链的鼠李糖脂作为不希望的副产物。
通过分馏法纯化的纯的二-鼠李糖脂组合物的特征在于用作粗糙干燥的皮肤感觉的化妆品。
本发明的一个目的是提供鼠李糖脂组合物,当用作皮肤护理组合物或皮肤清洁组合物时,其具有良好的泡沫性能而且提供皮肤清爽的感觉。
发明内容
出人意料地,已发现下述的混合物组合物能够实现本发明提出的目的。
因此本发明提供包含具有限定的重量比的特定鼠李糖脂的混合物组合物。
本发明还提供一种利用遗传修饰的细胞来制备根据本发明的混合物组合物的方法。
本发明还提供包含根据本发明的混合物组合物的配制物。
根据本发明的混合物组合物的一个优点是其在含水条件下卓越的泡沫稳定性。
根据本发明的混合物组合物的另一个优点是其在含水条件下突出的泡沫体积。
根据本发明的混合物组合物的另一个优点是其优越的发泡行为。
根据本发明的混合物组合物的另一个优点是在任何理想的含水表面活性体系中其简单的可配制性(formulatability)。
根据本发明的混合物组合物的另一个优点是其与传统的增稠剂在配制物中良好的可增稠性。
另一个优点是其对皮肤和头发良好的清洗能力。
根据本发明的混合物组合物的另一个优点是其温和的和良好的生理兼容性,特别地,其特征在于在红血球细胞(RBC)测试中的高数值。
另一个优点是其在清洗过程中和清洗后良好的皮肤感觉。
根据本发明的混合物组合物的又一个优点是在清洗后其留下柔软的皮肤感觉。
根据本发明的混合物组合物的又一个优点是在清洗后其留下光滑的皮肤感觉。
根据本发明的混合物组合物的又一个优点是其对皮肤具有赋酯效果(refattingeffect)。
根据本发明的混合物组合物的又一个优点是其基本上可以以不含油的形式来合成。
在本发明的上下文中,术语“鼠李糖脂”被理解为特别地意指通式(I)的化合物或其盐,
其中
m=2、1或0,
n=1或0,
R1和R2=彼此独立为具有2-24个碳原子、优选5-13个碳原子的相同或不同的有机基团,特别是任选地支化的,任选地取代的,特别是被羟基取代的,任选地不饱和的,特别是任选地单-、双-或三-不饱和的烷基,优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基以及(CH2)o-CH3,其中o=1-23、优选4-12。
在本发明的上下文中,术语“二-鼠李糖脂”被理解为意指其中n=1的通式(I)的化合物或其盐。
在本发明的上下文中,术语“单-鼠李糖脂”被理解为意指其中n=0的通式(I)的化合物或其盐。
根据下述命名对不同的鼠李糖脂进行简写:
“二RL-CXCY”被理解为意指通式(I)的二-鼠李糖脂,其中基团R1和R2中的一种=(CH2)o-CH3,其中o=X-4,另一种基团R1或R2=(CH2)o-CH3,其中o=Y-4。
“单RL-CXCY”被理解为意指通式(I)的单-鼠李糖脂,其中基团R1和R2中的一种=(CH2)o-CH3,其中o=X-4,另一种基团R1或R2=(CH2)o-CH3,其中o=Y-4。
因此所用的命名不区分“CXCY”和“CYCX”。
对于m=0的鼠李糖脂,则相应使用单RL-CX或二RL-CX。
如果上述的指数X和/或Y中的一个带有“:Z”,则意指各自基团R1和/或R2=未支化的、具有Z个双键的带有X-3或Y-3个碳原子的未取代的烃基。
在本发明的上下文中,“pH”被定义使用根据ISO4319(1977)校准的pH电极在搅拌5分钟后在25℃下对相应物质测量的数值。
在本发明的上下文中,术语“含水介质”被理解为意指基于所考虑的全部的组合物,包含至少5重量%的水的组合物。
除非另有说明,所有阐述的百分数(%)是质量百分数。
具体实施方式
本发明提供一种包含鼠李糖脂的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
51重量%-95重量%、优选70重量%-90重量%、特别优选75重量%-85重量%的二RL-C10C10和
0.5重量%-9重量%、优选0.5重量%-3重量%、特别优选0.5重量%-2重量%的单RL-C10C10,
其中的重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和,
前提条件是二-鼠李糖脂与单-鼠李糖脂的重量比大于91:9、优选大于97:3、特别优选大于98:2。
根据本发明的一个优选的混合物组合物的特征在于所述混合物组合物包含:
0.5重量%-15重量%、优选3重量%-12重量%、特别优选5重量%-10重量%的二RL-C10C12:1,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
根据本发明的另一优选的混合物组合物的特征在于所述混合物组合物包含:
0.5重量%-25重量%、优选5重量%-15重量%、特别优选7重量%-12重量%的二RL-C10C12,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
如果根据本发明的混合物组合物包含:
0.1重量%-5重量%、优选0.5重量%-3重量%、特别优选0.5重量%-2重量%的单RL-C10C12和/或,优选地和
0.1重量%-5重量%、优选0.5重量%-3重量%、特别优选0.5重量%-2重量%的单RL-C10C12:1,
也是优选地,其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
如果根据本发明的混合物组合物包含:
0.1重量%-25重量%、优选2重量%-10重量%、特别优选4重量%-8重量%的二RL-C8C10,
可以是有利的并因此是优选的,其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
根据本发明的一种特别优选的混合物组合物的特征在于所述混合物组合物包含:
0.5重量%-15重量%、优选3重量%-12重量%、特别优选5重量%-10重量%的二RL-C10C12:1,
0.5重量%-25重量%、优选5重量%-15重量%、特别优选7重量%-12重量%的二RL-C10C12,
0.1重量%-5重量%、优选0.5重量%-3重量%、特别优选0.5重量%-2重量%的单RL-C10C12和
0.1重量%-5重量%、优选0.5重量%-3重量%、特别优选0.5重量%-2重量%的单RL-C10C12:1,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
除了上述这些,如果根据本发明的混合物组合物包含仅少量的式单RL-CX或二RL-CX的鼠李糖脂是优选地。特别是,根据本发明的混合物组合物优选包含0重量%-5重量%、优选0重量%-3重量%、特别优选0重量%-1重量%的二RLC10,其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和,并且术语“0重量%”被理解为意指没有可检测的量。
根据本发明的混合物组合物优选包含至少60重量%、优选至少80重量%、特别优选至少90重量%、特别是至少95重量%的鼠李糖脂,其中重量百分数是基于全部混合物组合物的干物质。
根据本发明优选的是,根据本发明的混合物组合物基本上不含脂肪油(在20℃酰基甘油液体),因此,基于全部混合物组合物,包含特别是低于0.5重量%、特别是低于0.1重量%、特别优选没有可检测的量的脂肪油。
根据本发明的混合物组合物可通过将纯物质混合来制备,其中对于纯物质可以是来自常规制备的鼠李糖脂混合物的纯化。相应的纯化方法是,例如选择性结晶和色谱法。相应的方法描述于Heyd等人,Development and trends of biosurfactant analysis andpurification using rhamnolipids as an example,Anal Bioanal Chem.2008Jul;391(5):1579-90中。
特别是,下述方法,其同样是本发明的主题,适合于制备根据本发明的混合物组合物。
根据本发明的方法包括以下步骤:
Ia)提供恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)细胞,所述恶臭假单胞菌细胞已被遗传修饰使得在每种情况下其过表达rhlA、rhlB和rhlC中的至少一种基因,
IIa)使根据本发明的所述细胞与包含至少一种碳源的介质接触,
IIIa)在使所述细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下培养所述细胞,和
IVa)任选地分离形成的鼠李糖脂,
其特征在于与基因rhlB相比,基因rhlC更被过表达,特别是更被过表达至少1.5倍或以上、优选至少2倍或以上、特别优选至少10倍或以上。
上述的过表达的相对强度可以在例如RT-PCR的帮助下测定,其中对各自基因测定形成的mRNA的量。
本领域技术人员以目标方式例如通过启动子的选择或通过诱导型启动子与一定量的诱导剂联合使用,或通过基因倍增(gene multiplication)的方式可实现对表达强度的调节。
同样优选地,根据本发明的另一方法包括以下步骤:
Ib)提供恶臭假单胞菌细菌,所述恶臭假单胞菌细菌已被遗传修饰使得在每种情况下其含有rhlA、rhlB和rhlC中的至少一种外源基因,所述外源基因的至少一种在诱导型启动子的控制下,
IIb)使根据本发明的细胞与包含至少一种碳源的介质接触并进行培养,实现细胞密度为每升发酵液中1-30克的细胞干重、优选每升发酵液中2-20克的细胞干重、特别优选每升发酵液中5-15克的细胞干重,
IIIb)在使所述细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下诱导所述至少一种诱导型启动子并培养所述细胞,和
IVb)任选地分离形成的鼠李糖脂。
在本发明的上下文中,术语“诱导型启动子”被理解为意指通过改变包围所述细胞的介质而改变其活性的启动子。改变可包括例如温度变化和特定物质的浓度变化。
在本发明的上下文中,术语“诱导所述至少一种诱导型启动子”被理解为意指通过改变包围所述细胞的介质,所述诱导型启动子的活性被增加。
在本发明的上下文中,合适的诱导型启动子是,例如通过添加化学诱导剂(例如乳糖、IPTG、双环丙基酮、四环素、多西环素、丙酸酯、二甲氨基二硫代甲酸铜(cumate)、苯甲酸盐、阿拉伯糖、鼠李糖、烟酸等)被诱导的启动子、通过改变的环境条件(例如磷酸盐或硫的缺失、改变的温度或pH等)被诱导的启动子、或通过特定生理状态(例如特定细胞密度或生长速率或阶段)被诱导的启动子。
在该方法中特别优选使用的诱导型启动子选自通过双环丙基酮、四环素、多西环素、丙酸酯、二甲氨基二硫代甲酸铜、苯甲酸盐、磷缺乏、硫缺乏或降低的生长速率可诱导的启动子。
在根据本发明的两种方法中,基因rhlA、rhlB和rhlC优选选自来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的那些。
根据本发明的两种方法优选不作为生物转化进行,这是指不会从脂肪酸或含脂肪酸的化合物(例如从外部引入该方法的油脂)形成鼠李糖脂,而是在该方法中限定的碳源特别地被理解为意指除脂肪酸或含脂肪酸的化合物之外主要含有至少一种含碳化合物的那些。
根据本发明的混合物组合物可特别有利地加入至化妆品配制物中。
因此,本发明的另一个主题是根据本发明的混合物组合物用于制备配制物、特别是化妆品配制物的用途,以及包含根据本发明的混合物组合物的配制物、特别是化妆品配制物。
除了根据本发明的混合物组合物之外,根据本发明的优选配制物包含至少一种其他表面活性剂,其可以使用例如阴离子型、非离子型、阳离子型和/或两性表面活性剂。优选地,从涉及应用的角度看,优选阴离子型和非离子型表面活性剂的混合物。基于总的配制物,含水配制物中的全部表面活性剂的含量优选为5重量%-60重量%,并且特别优选为15重量%-40重量%。
使用的非离子型表面活性剂优选是烷氧基化的、有利地乙氧基化的,特别是优选具有8-18个碳原子的伯醇并且每摩尔醇中具有平均1-12摩尔的环氧乙烷(EO),其中,醇基可以是线性或优选2-位甲基支化的或可在混合物中含有线性和甲基支化的基团,如在羰基合成醇(oxo alcohol)基团中通常存在的那些。但是,特别是具有来自天然来源的具有12-18个碳原子的醇,例如来自椰子、棕榈树、牛脂脂肪或油醇的线性基团的并且每摩尔醇平均具有2-8个EO的乙氧基化的醇是优选的。优选的乙氧基化的醇包括,例如具有3个EO、4个EO或7个EO的C12-C14-醇,具有7个EO的C9-C11-醇,具有3个EO、5个EO、7个EO或8个EO的C13-C15-醇,具有3个EO、5个EO或7个EO的C12-C18-醇和它们的混合物,例如具有3个EO的C12-C14-醇和具有7个EO的C12-C18醇的混合物。所规定的乙氧基化的程度是统计学平均值,对于特定产物其可以是整数或分数。优选的乙氧基化的醇具有窄的同系物(homolog)分布。除了这些非离子型表面活性剂之外,还可使用具有超过12个EO的脂肪醇。其实例为具有14个EO、25个EO、30个EO或40个EO的牛脂脂肪醇。还可以使用在分子中同时含有EO和PO(环氧丙烷)基团的非离子型表面活性剂。在这种情况下,还可使用具有EO-PO嵌段单元或PO-EO嵌段单元的嵌段共聚物,以及EO-PO-EO共聚物或PO-EO-PO共聚物。
当然还可以使用混合的烷氧基化的非离子型表面活性剂,其中EO和PO单元不是嵌段分布,而是随机分布。这些产物可通过环氧乙烷和环氧丙烷在脂肪醇上的同时作用而获得。
此外,烷基糖苷还可以用作其他的非离子型表面活性剂。
优选使用的其他类型的非离子型表面活性剂,其或者作为唯一的非离子型表面活性剂使用或与另外的非离子型表面活性剂联合使用,是烷氧基化的、优选乙氧基化的或乙氧基化且丙氧基化的脂肪酸烷基酯,优选在烷基链中具有1-4个碳原子,特别是脂肪酸甲酯,如在日本专利申请JP58/217598中描述的或优选通过在国际专利申请WO-A-90/13533中描述的方法制备的。
氧化胺类型的非离子型表面活性剂,例如N-椰油烷基-N,N-二甲基氧化胺和N-牛脂烷基-N,N-二羟基乙基氧化胺,和脂肪酸链烷醇酰胺类型的非离子型表面活性剂也是适合的。这些非离子型表面活性剂的量优选不超过乙氧基化的脂肪醇的量,特别是不超过其量的一半。
其他合适的表面活性剂是多羟基脂肪酸酰胺,该多羟基脂肪酸酰胺是通常可通过还原性糖与氨、烷基胺或链烷醇胺的还原胺化反应并随后与脂肪酸、脂肪酸烷基酯或脂肪酸酰氯的酰化而获得的物质。
使用的阴离子型表面活性剂例如是磺酸盐和硫酸盐类型的那些。本发明合适的磺酸盐类表面活性剂优选是C9-C13-烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐,即烯烃磺酸盐和羟基链烷磺酸盐的混合物,以及二磺酸盐,其例如从具有端基双键或内部双键的C12-C18-单烯烃与气态三氧化硫通过磺化反应并随后磺化产物的碱性水解或酸性水解而获得。烷基磺酸盐也是合适的,其从C12-C18-烷烃,例如通过磺氯化或磺氧化作用和随后水解或中和可获得。同样地,α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)例如氢化的椰子、棕榈仁或牛脂脂肪酸的α-磺基甲酯也是合适的。
其他合适的阴离子型表面活性剂是硫酸化的脂肪酸甘油酯。脂肪酸甘油酯被理解为意指单酯、二酯和三酯,以及它们的混合物,通过单甘油与1-3摩尔的脂肪酸的酯化制备而获得或通过甘油三酯与0.3-2摩尔的甘油的酯交换制备而获得。本发明优选的硫酸化脂肪酸甘油酯是具有6-22个碳原子的饱和脂肪酸例如己酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或山嵛酸的硫酸化产物。
优选的烷基(烯基)硫酸盐是C12-C18-脂肪醇的硫酸半酯的碱金属盐、特别是钠盐和这些链长度的仲醇的那些半酯,C12-C18脂肪醇例如来自椰子脂肪醇、牛脂脂肪醇、月桂醇、豆蔻醇、十六醇或硬酯醇或C10-C20-羰基合成醇。此外,优选在石油化工的基础上制备的含有合成的直链烷基的规定链长度的烷基(烯基)硫酸盐,其对基于脂肪化学原料的合适的化合物具有类似的降解行为。从清洗的角度来看,优选C12-C16-烷基硫酸盐和C12-C18-烷基硫酸盐以及C14-C18-烷基硫酸盐。例如根据美国专利说明书3,234,258或5,075,041制备的并且可作为壳牌石油公司的商品以名称获得的2,3-烷基硫酸盐,也是合适的阴离子型表面活性剂。
由1-6摩尔的环氧乙烷乙氧基化的直链或支化的C7-C20-醇的硫酸单酯也是合适的,上述C7-C20-醇例如具有平均3.5摩尔的环氧乙烷(EO)的2-甲基-支化的C9-C11-醇或具有1-4个EO的C12-C18-脂肪醇。由于它们高的发泡行为,其可以相对小的量例如1-5重量%的量用在清洁组合物中。
烷基磺基琥珀酸的盐也是其他合适的阴离子型表面活性剂,其还被称作为磺基琥珀酸酯或磺基琥珀酸的酯并且与醇优选脂肪醇、特别是乙氧基化的脂肪醇构成磺基琥珀酸的单酯和/或二酯。优选的磺基琥珀酸酯包含C8-C18-脂肪醇基团或它们的混合物。特别优选的磺基琥珀酸酯包含源自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇基团。在这种情况下,特别优选其脂肪醇基团源自具有窄的同系物分布的乙氧基化的脂肪醇的磺基琥珀酸酯。同样还可以使用在烷基(烯基)链上优选具有8-18个碳原子的烷基(烯基)琥珀酸或其盐。
特别优选的阴离子型表面活性剂是皂(soap)。饱和的和不饱和的脂肪酸皂也是合适的,例如月桂酸盐、豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、(氢化的)芥酸盐和山嵛酸盐,以及源自特别是来自天然的脂肪酸,例如椰油、棕仁油、橄榄油或牛脂脂肪酸的皂混合物。
包括皂的阴离子型表面活性剂可以是其钠盐、钾盐或铵盐形式、以及有机碱的可溶性盐例如单-、二-或三乙醇胺形式。优选地,阴离子型表面活性剂是其钠盐或钾盐形式,特别是其钠盐形式。
根据本发明可使用的两性表面活性剂是在分子中带有至少一个季铵基团和至少一个-COO-或-SO3 -基团的那些表面-活性的化合物。在这种情况下,特别优选的两性表面活性剂是甜菜碱表面活性剂例如烷基甜菜碱或烷基酰氨丙基甜菜碱。甜菜碱特别是诸如N-烷基-N,N-二甲基铵氨基乙酸盐例如椰油烷基二甲基铵氨基乙酸盐、N-酰氨基丙基-N,N-二甲基铵氨基乙酸盐例如椰油酰氨基丙基二甲基铵氨基乙酸盐、C12-C18-烷基二甲基乙酰基甜菜碱、椰油酰氨基丙基二甲基乙酰基甜菜碱、2-烷基-3-羧甲基-3-羟基乙基咪唑啉和在各自情况下在烷基或酰基上具有8-18个碳原子的磺基甜菜碱,以及椰油酰氨基乙基羟乙基羧甲基氨基乙酸盐是本发明优选地。特别优选的两性离子表面活性剂是根据INCl名称已知为椰油酰氨丙基甜菜碱的N,N-二甲基-N-(月桂酰氨丙基)乙酰甜菜碱铵。
其他合适的两性表面活性剂是通过两性乙酸盐和两性二乙酸盐的基团,两性丙酸盐和两性二丙酸盐的基团,和氨基酸基表面活性剂的基团形成,上述两性乙酸盐和两性二乙酸盐特别是例如椰油-或月桂基两性乙酸盐或二乙酸盐,氨基酸基表面活性剂例如是酰基谷氨酸盐,特别是椰油酰基谷氨酸二钠和椰油酰基谷氨酸钠、酰基甘氨酸盐,特别是椰油酰基甘氨酸盐和酰基肌氨酸盐,特别是月桂酰基肌氨酸铵和椰油酰基肌氨酸钠。
此外,根据本发明的配制物可包含至少一种选自以下的附加成分:
润肤剂,
乳化剂,
增稠剂/粘度调节剂/稳定剂,
UV光保护过滤剂,
抗氧化剂,
助水溶物(或多元醇),
固体和填料,
成膜剂,
珠光(pearlescent)添加剂,
除臭剂和止汗剂活性成分,
杀虫剂,
仿晒剂,
防腐剂,
调理剂,
香料,
染料,
气味吸收剂,
化妆品活性成分,
护理添加剂,
富脂剂,
溶剂。
作为各个类别的典型代表可使用的物质是本领域技术人员已知的,并且可在例如德国申请DE1020080017884中找到。该专利申请在此援引加入并因此形成本公开内容的一部分。
至于其他任选的成分和这些成分所用的量,本领域技术人员可参考已知的相关手册,例如K.Schrader,“Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals andFormulations of Cosmetics]”,2nd edition,page329to341,Hüthig Buch VerlagHeidelberg。
各个添加剂的量取决于预期用途。
现有技术已知用于各自的应用的典型的指导配制物,该典型的指导配制物包含在例如各自的基础材料和活性成分的制造商的手册中。这些存在的配制物可通常是原样适用的。但是如果需要,为了适应和优化通过简单的实验可进行所需的改变而不复杂化。
根据本发明的混合物组合物和包含根据本发明的混合物组合物的根据本发明的配制物可有利地用于表面清洁。在根据本发明的用途这种形式中,所述表面优选是生物表面,特别是人,该表面特别优选选自皮肤和头发。
以下列出的实施例通过举例描述了本发明但没有任何意图限定本发明,本发明的范围源自全部说明书和权利要求书,而不是在实施例中阐述的实施方案。
附图说明
下图形成说明书的一部分:
图1:用SITA测量显示的发泡行为。
实施例
实施例1:二RL-C10C10和单RL-C10-C10的制备
通过制备的色谱柱进行各种纯的RL形式的制备。为此,将750克的二氧化硅60凝胶(200-500μm,35-70目,Sigma-Aldrich,德国)悬浮在水饱和的乙酸乙酯中(用1重量%的乙酸酸化),并装入柱中(直径=65mm,最大填充量=600mm,1升溶剂储存器)。在固定相上涂覆2-3厘米的酸处理的海沙(Riedel de Haen,Seelze,德国)作为保护层。所用的洗脱液同样地是含有1重量%乙酸的水饱和的乙酸乙酯。将商购的RL混合物(JBR505,JeneilBiosurfactants,~5重量%总的鼠李糖脂浓度)冻干。
将10克冻干的RL混合物溶解在5重量%浓度的洗脱液中。将该溶液置于制备的柱上。调整洗脱液流速至15ml/min。将洗脱液收集在100ml的洗脱部分并通过薄膜气相色谱和HPLC分析。以该方式可以分离各种RL形式。合并相同组成的部分并在旋转蒸发仪上除去溶剂。然后,将残渣溶解在水中,冻干并以粉末形式用于应用测试。为了获得足够的量,多次进行该过程。经1H-NMR和HPLC测定所得部分的纯度>99重量%。
实施例2:二RL-C10C10和单RL-C10C10的混合物的制备
将实施例1中描述的纯的RL形式以二RL-C10C10与单RL-C10C10的比例为97.5:2.5的粉末形式混合。
实施例3:在恶臭假单胞菌(P.putida)中用来自铜绿假单胞菌PAO1的rhlABC制备鼠李糖脂,其中编码鼠李糖基转移酶RhlC的基因的表达比编码鼠李糖基转移酶RhlB的基因rhlB的表达高很多倍
为了在恶臭假单胞菌菌株中用来自铜绿假单胞菌PAO1的rhlABC制备鼠李糖脂,其中,编码鼠李糖基转移酶RhlC的基因的表达在比编码鼠李糖基转移酶RhlB的基因rhlB的表达高得多的程度下进行,构建质粒pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T(Seq IDNo.1)。为此,合成以下DNA片段:
铜绿假单胞菌PAO1基因rhlA、rhlB和rhlC,然后是终止子,随之是合成的tac启动子、然后是铜绿假单胞菌PAO1基因rhlC和终止子,侧翼是HindIII限制位点(5’端)或Bsu36I限制位点(3’端)(Seq ID No2)。
由DNA合成提供商提供的并且含有上述合成的DNA片段的载体用HindIII和Bsu36I切割,并通过Fast Link Ligation试剂盒(Epicentre Technologies,Madison,WI,美国)连接至同样用HindIII和Bsu36I切割的载体pBBR1MCS-2(Seq ID3)。得到的目标载体pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T(具有合成的片段Seq ID No.2的pBBR1MCS-2)大小为9336个碱基对。
用如上述的载体pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T(Seq ID No.1)转化恶臭假单胞菌KT2440(Iwasaki et al.Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)。在每种情形中,分离并分析10个克隆的质粒DNA。将得到的携带质粒的菌株称为恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T。
在LB-琼脂-卡那霉素(50μg/ml)平板上培养重组菌株恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T。
为了生产鼠李糖脂,使用如下称为M9培养基的培养基。该培养基由2%(w/v)葡萄糖、0.3%(w/v)KH2PO4、0.679%Na2HPO4、0.05%(w/v)NaCl、0.2%(w/v)NH4Cl、0.049%(w/v)MgSO4×7H2O和0.1%(v/v)的微量元素溶液组成。该微量元素溶液由1.78%(w/v)FeSO4×7H2O、0.191%(w/v)MnCl2×7H2O、3.65%(w/v)HCl、0.187%(w/v)ZnSO4×7H2O、0.084%(v/v)Na-EDTA×2H2O、0.03%(v/v)H3BO3、0.025%(w/v)Na2MoO4×2H2O和0.47%(w/v)CaCl2×2H2O组成。用NH4OH将培养基的pH调整至7.4,并随后通过高压灭菌(121℃,20min)对培养基进行灭菌。在培养期间不需要调整pH。
为了研究鼠李糖脂在摇瓶中的生产,首先制备预培养物。为此,使用在LB-琼脂平板上新划线的菌株的菌落,并将10毫升的LB培养基接种在100毫升的锥形瓶中。在添加50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中培养所有重组恶臭假单胞菌株。在30℃和200rpm下将恶臭假单胞菌株培养过夜。
预培养物用于接种在250毫升的锥形瓶中的50毫升的M9培养基(+50μg/ml卡那霉素)(起始OD6000.1)。在200rpm和30℃下对该培养物进行培养。24小时后,从培养瓶中移取1毫升的培养液的样品。
发酵和纯化
同样地,将无机培养基(M9)用于主培养基。在接种10%体积的预培养物和最初引入的葡萄糖的消耗后的发酵在具有1.2升操作体积的2升发酵罐中通过葡萄糖补加的碳源限制而进行。葡萄糖补加通过参考溶解的氧信号进行。该溶解的氧通过搅拌速率调整至20%饱和。经pH电极和添加NH4SO4调节pH至7。经进行4天发酵至15克/升的干生物量。经HPLC确定鼠李糖脂的浓度,其为9.8克/升。通过10000g离心分离掉细胞后,通过添加浓缩的HCl调整发酵液的pH至4.0。然后用相同体积的乙酸乙酯进行提取。分离出含鼠李糖脂的有机相并进一步处理。通过添加50重量%浓度的KOH(含水的)调整溶液的pH至7。这导致两个液相形成。较低相含有高纯度的不含亲脂性和亲水性杂质的鼠李糖脂。结果是RL混合物的组成未受影响。排出较低相,在旋转蒸发仪上除去大部分溶剂。再次加水,冻干含水RL溶液。经HPLC对得到的粉末进行分析并定性以应用。
鼠李糖脂的定量
用于以下色谱分析的样品制备如下进行:
用移液管(Combitip)首先将1毫升的丙酮加入至2毫升的反应容器中,并将反应容器立即封闭以使蒸发最小化。然后添加1毫升的培养液。将培养液/丙酮混合物涡旋后,在13000rpm下离心3分钟,将800μl的上清液转移至HPLC容器中。
为了鼠李糖脂的检测和定量目的,使用蒸发光散射检测器(Sedex LT-ELSDmodel85LT)。通过Agilent Technologies1200Series(Santa Clara,California)和ZorbaxSB-C8Rapid Resolution Column(4.6×150mm,3.5μm,Agilent)来进行实际测量。注射体积为5μl,以及该方法的运行时间为20分钟。所用的流动相为含水0.1%TFA(三氟乙酸,溶液A)和甲醇(溶液B)。柱温度为40℃。ELSD(探测器温度60℃)和DAD(二极管阵列,210nm)作为检测器。该方法中使用的梯度是:
t[分钟] 溶液B体积% 流速[ml/min]
0.00 70% 1.00
15.00 100% 1.00
15.01 70% 1.00
20.00 70% 1.00
由上述方法从恶臭假单胞菌KT2440pBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T获得的鼠李糖脂组合物包含:
得到的二-鼠李糖脂与单-鼠李糖脂的重量比为99:1。
实施例4:通过手清洗试验测试皮肤护理性能和泡沫性能
为了评价本发明的产品实施例2和3在含水的表面活性剂组合物(表面活性剂配制物)中的皮肤护理性能和泡沫性能,进行与已知的鼠李糖脂组合物对比的手清洗感觉试验。
在水清洗试验中,一组10位经培训的测试者以限定的方式清洗他们的手,通过从1(差)至5(非常好)的分级评分来评价泡沫性能和手感。在各自情况下在标准的表面活性剂配制物(表1)中对所用产品进行测试。
使用没有添加第二种表面活性剂的表面活性剂配制物作为对照配制物A。不是根据本发明的表面活性剂配制物B和C是对照产品,表面活性剂配制物D和E是根据本发明的组合物(表1)。
表1:用于手清洗测试的测试配制物(数据以重量%表示)
表2显示了手清洗测试的结果。
表2:手清洗测试的结果
测试配制物 A B C D E
发泡行为 2.7 3.2 2.6 3.4 3.5
泡沫体积 2.6 2.7 2.3 2.7 2.7
泡沫乳脂性 2.1 2.7 2.4 2.9 3.0
清洗期间的皮肤感觉 2.9 3.2 3.0 3.4 3.4
容易清洗掉性 3.8 3.5 3.1 3.4 3.4
清洗后皮肤的即刻感觉 2.4 2.0 2.2 2.3 2.3
3分钟后皮肤的光滑度 2.8 3.3 3.1 3.5 3.7
3分钟后皮肤的柔软度 2.9 3.4 3.1 3.5 3.7
从表2的测量结果明显看出,相对于对照A和根据现有技术的对比组合物B和C,使用产品实施例2和3的根据本发明的组合物D和E在用配制物清洗期间具有更好的皮肤感觉,并且出人意料地还具有更好的发泡行为和增加的泡沫乳脂性。此外,明显的是,在清洗掉和干燥后,评价根据本发明的组合物D和E比对比配制物具有更好的皮肤感觉(皮肤光滑度和皮肤柔软度)。
出人意料地,生物表面活性剂中特定低含量的单-鼠李糖脂在本发明的配制物中对泡沫行为和皮肤感觉表现出积极的影响。
实施例5:通过SITA泡沫测试仪测试泡沫性质
表面活性剂溶液发泡的能力是重要参数。可由此推测其应用性能。在许多应用中由良好的表面活性剂期望快速的泡沫形成和大量的泡沫体积。评价该参数的方法是基于来自SITA Messtechnik GmbH的SITA Foam Tester R-2000。在此,将空气通过分散盘引入限定体积的表面活性剂溶液中,在此期间通过泡沫探针测量液体和所得的泡沫的总体积。
在pH=6和鼠李糖脂的总浓度为0.5重量%下在该仪器中测量三种不同的鼠李糖脂配制物。鼠李糖脂组分的含量列于下表。
对发酵获得的根据本发明的组合物E09-S6、纯的二RL-C10C10和购自Jeneil的商购产品进行研究。
在30℃的温度下和300毫升的液体体积以及1500rpm转速下进行关于起泡性的测量。
图1显示了E09S6的起泡性显著好于其他样品,即更快速地实现最大体积的泡沫。

Claims (15)

1.包含鼠李糖脂的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
51重量%-95重量%的二RL-C10C10和
0.5重量%-9重量%的单RL-C10C10,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和,
前提条件是二-鼠李糖脂与单-鼠李糖脂的重量比大于97:3。
2.权利要求1的混合物组合物,其特征在于,二-鼠李糖脂与单-鼠李糖脂的重量比大于98:2。
3.权利要求1的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
0.5重量%-15重量%的二RL-C10C12:1,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
4.权利要求1或2的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
0.5重量%-25重量%的二RL-C10C12,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
5.权利要求1或2的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
0.1重量%-5重量%的单RL-C10C12和/或
0.1重量%-5重量%的单RL-C10C12:1,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
6.权利要求1的混合物组合物,其特征在于其包含:
0.5重量%-15重量%的二RL-C10C12:1,
0.5重量%-25重量%的二RL-C10C12,
0.1重量%-5重量%的单RL-C10C12和
0.1重量%-5重量%的单RL-C10C12:1,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
7.权利要求1或2的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含:
0重量%-5重量%的二RLC10,
其中重量百分数是基于所有存在的鼠李糖脂的总和。
8.权利要求1或2的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含至少60重量%的鼠李糖脂,其中重量百分数是基于全部混合物组合物的干重。
9.权利要求8的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含至少80重量%的鼠李糖脂,其中重量百分数是基于全部混合物组合物的干重。
10.权利要求8的混合物组合物,其特征在于所述混合物组合物包含至少90重量%的鼠李糖脂,其中重量百分数是基于全部混合物组合物的干重。
11.制备如权利要求1-10任一项所述的混合物组合物的方法,其包括以下步骤:
Ia)提供恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)细胞,所述恶臭假单胞菌细胞已被遗传修饰使得在每种情况下其过表达rhlA、rhlB和rhlC中的至少一种基因,
IIa)使所述细胞与包含至少一种碳源的介质接触,
IIIa)在使所述细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下培养所述细胞,和
IVa)任选地分离形成的鼠李糖脂,
其特征在于与基因rhlB相比,基因rhlC更被过表达。
12.制备如权利要求1-10任一项所述的混合物组合物的方法,其包括以下步骤:
Ib)提供恶臭假单胞菌细胞,所述恶臭假单胞菌细胞已被遗传修饰使得在每种情况下其具有rhlA、rhlB和rhlC中的至少一种外源基因,所述外源基因中的至少一种在诱导型启动子的控制下,
IIb)使所述细胞与包含至少一种碳源的介质接触并进行培养,实现每升发酵液中细胞干重为1-30克的细胞密度,
IIIb)在使所述细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下诱导所述至少一种诱导型启动子并培养所述细胞,和
IVb)任选地分离形成的鼠李糖脂。
13.权利要1-10任一项的混合物组合物的用途,用于制备配制物。
14.配制物,其包含权利要求1-10任一项的混合物组合物。
15.权利要求1-10任一项的混合物组合物的用途或权利要求14的配制物的用途,其用于清洁表面。
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