CN104090062B - 叶黄素单顺式、双顺式异构体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叶黄素单顺式、双顺式异构体的检测方法。采用二极管阵列检测器，YMC？Carotenoid？C30色谱柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20为流动相，时间13min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL，扫描波长300～500nm，检测波长450nm，该方法能够很好地分离叶黄素单顺式、双顺式异构体；同时利用APCI正离子质谱，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z＝80～900，气化温度350℃，干燥气体流速5L/min，电晕电流4μA，破碎电压150v，毛细管电压2500V。根据质谱和光谱信息确定叶黄素的单顺式、双顺式异构体分别为13，15-双顺式、9，15-双顺式、15-顺式、13-顺式、13′-顺式、9，9′-双顺式、9-顺式和9′-顺式叶黄素。该方法具有快速有效、重现性好、回收率高等特点，可以对叶黄素单顺式和双顺式异构体进行定性和定量分析。
Description
一、技术领域
本发明涉及叶黄素单顺式、双顺式异构体的检测方法，属于分析技术领域。
二、背景技术
叶黄素又名“植物黄体素”，是一种无VA活性的含氧类胡萝卜素，广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中。十几年的科学研究表明叶黄素是构成人眼视网膜黄斑色素的主要组成部分。叶黄素不仅可以过滤对黄斑损伤作用最强的蓝光，而且能够淬灭和捕获高能量蓝光诱导产生的活性氧自由基，从而起到保护视力和抗氧化的作用。因此，经常补充叶黄素可以降低老年性黄斑退化病(Age-relatedMacularDegeneration，简称AMD)的患病风险。另外，叶黄素还具有预防白内障和人体衰老、抗癌、抗诱变、延缓早期动脉硬化等生理功能，是一种营养健康的功能性天然色素。
自然界中叶黄素以全反式构象为主，富含或强化叶黄素制品在加工贮藏过程中，全反式叶黄素会受到光、氧和热等外界条件的影响产生很多顺式异构体，顺式结构在物化性质和生理功能上与全反式差别较大。因此，建立一种准确快速的叶黄素顺反异构体的定性、定量分析方法对叶黄素在食品工业中的生产和应用具有重要意义。
由于灵敏、准确、快速等优点，高效液相色谱和质谱联用技术已成为叶黄素定性定量分析的主要方法。C30柱是继C18柱之后又一广泛应用的反相吸附色谱固定相，在分离类胡萝卜素几何异构体方面显示出独特的优势，又称类胡萝卜素柱。张艳等报道了一种YMC-C30色谱柱分离叶黄素及其异构体的方法，使用的流动相为甲基叔丁基醚、甲醇和乙腈，叶黄素异构体分离效果不是很好，并且甲基叔丁基醚价格较贵；李秀霞等报道了用YMC-C30色谱柱分离鉴定玉米蛋白粉中的全反式叶黄素及其顺式异构体，使用的流动相为甲醇和丙酮，但洗脱时间较长。国外有报道使用水-甲醇、水-乙腈为流动相对叶黄素顺、反异构体进行分离，但这两种方法所用时间都较长，分别为70min和45min，效率较低。尚未见叶黄素双顺式异构体检测方面的报道。因此，建立一种快速经济有效的叶黄素单顺式、双顺式异构体的定性定量分析方法显得十分必要。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种快速、准确的叶黄素单顺式、双顺式异构体的检测方法，可以对叶黄素单顺式、双顺式异构体进行准确的定性和定量分析。
技术方案
本发明包括以下步骤：
1.叶黄素单顺式、双顺式异构体样品的制备
吸取大豆油4.6mL于具塞刻度试管中，分别在130～190℃下于恒温油浴锅中避光加热。称取10mg反式叶黄素于试管中并加入400μL正己烷，超声溶解30s，频率为40kHz。将正己烷-叶黄素溶液注入油脂中，制成工作溶液，这一过程须在1min内完成。定时移取200μL样品于小试管中，与2mL丙酮混合均匀后，迅速置于-20℃冰箱保存24h，使油脂中的三酰甘油酯结晶。通过0.45μm膜过滤于样品瓶中待用。整个实验过程中，试管敞口不密封，所有操作均在避光下完成。
2.叶黄素单顺式、双顺式异构体的HPLC检测
取20μL制备的叶黄素单顺式、双顺式异构体样品进行检测，二极管阵列检测器，YMCCarotenoidC30色谱柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20为流动相，时间13min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL，扫描波长300～500nm，检测波长450nm。
3.叶黄素单顺式、双顺式异构体的质谱检测
采用大气压化学电离源，正离子质谱(APCI+/MS)扫描模式，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z＝80～900，气化温度350℃，干燥气体流速5L/min，电晕电流4μA，破碎电压150v，毛细管电压2500V。
4.建立全反式叶黄素标准曲线
准确称取1mg全反式叶黄素标准品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混匀，制成浓度为40μg/mL的标准液。再分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准液置于10mL容量瓶中，混匀，制成2、4、6、8、10μg/mL的全反式叶黄素系列标准液。按照上述的色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。
有益效果
1.本发明在国内外文献的基础上，遴选出流动相甲醇A、流动相乙腈B、流动相二氯甲烷C对叶黄素单顺式、双顺式异构体进行分离，依据叶黄素单顺式和双顺式异构体的分离效果和最低洗脱时间，确定了较优的流动相配比。不同A-B-C配比(v/v/v)：①20∶60∶20；②30∶50∶20；③40∶40∶20；④50∶30∶20；⑤60∶20∶20后叶黄素异构体分离效果见图1。由图可知在由流动相①逐渐调整至流动相⑤的过程中，样品中各物质全部洗脱所用的时间是逐渐缩短的，其中流动相①、②未使样品中各组分较好分离，流动相③、⑤得到的色谱峰对称性稍差，峰形欠满意，流动相④使样品中各物质达到有效分离，拖尾现象有明显改善，峰形较好，因此，选择流动相比例为甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20，时间缩短为13min。
2.对含有叶黄素的高温油脂样品进行了正离子模式的HPLC-APCI-MS和电子吸收光谱分析，通过与标准品保留时间比对、最大吸收波长、紫外-可见光谱特性、质谱特性、Q值(顺式吸收峰“高度值”与最大吸收峰“高度值”之比)及文献中相关报道分离鉴定得到9种化合物。图2至图5分别为全反式叶黄素标准品色谱图、叶黄素顺式异构体HPLC分离色谱图、光谱特征图和质谱特征图。
叶黄素分子量均为568.88，质谱结果中主离子峰应为569.4[M+H]+，但因叶黄素两侧紫罗酮环的不对称性，使得叶黄素在质谱电离过程中容易失去一个水分子，所以叶黄素在质谱图中的主离子峰为551.4[M+H]+。图3中峰6与全反式叶黄素标准品洗脱时间和最大吸收波长均一致，确定峰6为全反式叶黄素。因顺式异构体没有标准品可利用，可以通过以下程序对其进行分析：(1)单顺式异构体的最大吸收波长相对全反式结构有4～6nm的蓝移，双顺式异构体则有10～14nm的蓝移；(2)顺式异构体在330～340nm之间有一个新的吸收，顺式双键越靠近分子中心顺式吸收越强，而双顺式异构体吸收较小，甚至无吸收；(3)叶黄素与β-胡萝卜素均为类胡萝卜素，有相同的异戊二烯结构主链性质，因此在相应位置异构体的洗脱顺序与β-类胡萝卜素应一致。由此可以确定异构体混合物中的单顺式和双顺式异构体。图5显示叶黄素的所有顺式异构体和全反式结构一样有相同的主离子峰，即m/z551.4[M+H]+。图4显示15-、13-、13’-、9-和9’-顺式-叶黄素最大吸收波长分别为442、440、440、442和442nm，与全反式有2～6nm蓝移。其Q值和洗脱顺序与文献报道值相符合。13，15-双顺式、9，13-双顺式和9，9’-双顺式-叶黄素的最大吸收波长为432、434和434nm，相对全反式叶黄素有10-14nm蓝移，符合双顺式异构体特征。三种叶黄索双顺式异构体洗脱顺序与β-胡萝卜素双顺式异构体洗脱顺序相一致。
表1样品中叶黄素单顺式、双顺式异构体的鉴定
a：流动相为甲醇和甲基叔丁基醚，65min内由100∶0到30∶70的线性梯度洗脱。
3.本发明具有简便、准确性和灵敏度高、重现性好等特点，尤其是能够快速分离出叶黄素的单顺式、双顺式异构体。通过全反式叶黄素拟合标准曲线(图6)，得到回归方程为Y＝6.224X+0.731，R2＝0.9998，顺式异构体含量根据全反式叶黄素标准曲线进行定量计算。反式叶黄素含量在40～200ng范围内峰面积和进样量呈良好的线性关系，在信噪比为3的条件下，使用二极管阵列检测器的绝对检出量为16ng，最低检出限为0.8μg/mL。
取两份供试样品溶液按照上诉色谱条件重复进样6次，叶黄素峰面积积分值的RSD值分别为0.88％和0.21％，小于5％，说明该方法具有较好的精密度。稳定性试验结果，叶黄素峰面积RSD值为1.77％，小于5％，表明本方法具有较好的稳定性。样液的加标回收率分别为95.10％、96.40％、95.36％，在95％～97％之间，且RSD分别为2.49％、2.01％、2.13％，都小于5％，表明本方法具有良好的回收率。
附图说明
图1流动相甲醇-乙腈-二氯甲烷不同配比条件下单顺式、双顺式叶黄素的HPLC图
图2全反式叶黄素标准品HPLC图
图3全反式、单顺式、双顺式叶黄素HPLC图
图4全反式、单顺式、双顺式叶黄素的光谱特征
图5叶黄素全反式、顺式异构体的质谱特征
图6全反式叶黄素标准曲线
具体实施方式
下面的实施例可以更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
1.实验仪器与试剂
1)实验仪器
Agilent6530四极杆-飞行时间串联质谱(6530Q-TOF，APCI源)、Agilent1200HPLC色谱仪(美国Agilent公司)、YMC-C30柱(日本YMC公司)
D10氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
2)实验试剂
全反式叶黄素标准品(纯度97％)，美国Sigma公司；
色谱级甲醇、乙腈，美国天地公司；
色谱级二氯甲烷，美国ACS恩科化学。
2.实验方法
1)叶黄素单顺式、双顺式异构体样品的制备
吸取大豆油4.6mL于具塞刻度试管中，在170℃下于恒温油浴锅中避光加热。称取10mg全反式叶黄素于试管中并加入400μL正己烷，超声溶解30s，频率为40kHz。将正己烷-叶黄素溶液注入油脂中，制成工作溶液，这一过程须在1min内完成。定时移取200μL样品于小试管中，与2mL丙酮混合均匀后，迅速置于-20℃冰箱保存24h，使油脂中的三酰甘油酯结晶。通过0.45μm膜过滤于样品瓶中待用。整个实验过程中，试管敝口不密封，所有操作均在避光下完成。
2)叶黄素单顺式、双顺式异构体的HPLC检测
取20μL制备的叶黄素单顺式、双顺式异构体样品进行检测，二极管阵列检测器，YMCCarotenoidC30色谱柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20为流动相，时间13min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL，扫描波长300～500nm，检测波长450nm。
3)叶黄素单顺式、双顺式异构体的质谱检测
采用大气压化学电离源，正离子质谱(APCI+/MS)扫描模式，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z＝80～900，气化温度350℃，干燥气体流速5L/min，电晕电流4μA，毛细管电压2500V，破碎电压150v。
叶黄素单顺式、双顺式异构体的HPLC-APCI-MS检测结果如图3至图5所示，其中包括HPLC分离图谱、光谱特征图和质谱特征图。通过最大吸收波长、紫外-可见光谱特性、质谱特性、Q值及文献中相关报道对分离所得化合物进行分析鉴定，判定这9种化合物分别为①13，15-双顺式叶黄素、②9，15-双顺式叶黄素、③15-顺式叶黄素、④13-顺式叶黄素、⑤13’-顺式叶黄素、⑥全反式叶黄素、⑦9，9’-双顺式叶黄素、⑧9-顺式-叶黄素、⑨9’-顺式叶黄素。
4)叶黄素标准曲线的建立与叶黄素单顺式、双顺式异构体含量的检测
准确称取1mg全反式叶黄素标准品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混匀，制成浓度为40μg/mL的标准液。再分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准液置于10mL容量瓶中，混匀，制成2、4、6、8、10μg/mL的反式叶黄素系列标准液。按照上述的色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。通过全反式叶黄素拟合标准曲线，得到回归方程为Y＝6.224X+0.731(R2＝0.9998)，顺式异构体含量根据全反式叶黄素标准曲线进行定量计算。得到标准曲线方程为Y＝6.224X+0.731(R2＝0.9998)，见图6。反式叶黄素含量在40～200ng范围内峰面积和进样量呈良好的线性关系，在信噪比为3的条件下，使用二极管阵列检测器的绝对检出量为16ng，最低检出限为0.8μg/mL。在170℃大豆油中加热120min后得到9种化合物的含量分别为①13，15-双顺式叶黄素(0.49μg/mL)、②9，15-双顺式叶黄素(0.56μg/mL)、③15-顺式叶黄素(1.44μg/mL)、④13-顺式叶黄素(3.78μg/mL)、⑤13’-顺式叶黄素(1.74μg/mL)、⑥全反式叶黄素(8.43μg/mL)、⑦9，9’-双顺式叶黄素(0.48μg/mL)、⑧9-顺式-叶黄素(2.78μg/mL)、⑨9’-顺式叶黄素(2.08μg/mL)。
5)精密度、稳定性和加标回收率实验
精密度实验：取2份供试样品溶液，并使上样液中反式叶黄素含量在40～200ng之间，按照上述色谱条件重复进样6次，得到叶黄素的峰面积，经计算叶黄素峰面积积分值的RSD值分别为0.88％和0.21％，小于5％，说明该方法具有较好的精密度。
稳定性实验：取供试样品溶液，于-18℃保存分别在0、2、4、6、8、10h后按照上述的色谱条件进样测定，经计算叶黄素峰面积积分值的RSD值为1.77％，小于5％，表明本方法具有较好的稳定性。
加标回收率实验：分别精密称取3份相同的供试样品溶液，添加相同体积的叶黄素标品溶液，加标水平分为2、4、10μg/mL，使上样液中反式叶黄素含量在40～200ng之间，按照上述色谱条件进样分析，每份样液重复进样三次，经计算样液的加标回收率分别为95.10％、96.40％、95.36％，在95％～97％之间，且RSD分别为2.49％、2.01％、2.13％，都小于5％，表明本方法具有良好的回收率，测定结果准确、可信。
Claims (1)
1.叶黄素单顺式、双顺式异构体的检测方法，其特征在于HPLC条件为采用二极管阵列检测器，YMCCarotenoidC30色谱柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20为流动相，时间13min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL，扫描波长300～500nm，检测波长450nm；同时利用APCI正离子质谱，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z＝80～900，气化温度350℃，干燥气体流速5L/min，蒸发器温度400℃，电晕电流4μA，毛细管电压2500V ；在上述HPLC条件下，13，15-双顺式、9，15-双顺式、15-顺式、13-顺式、13′-顺式、全反式、9，9′-双顺式、9-顺式和9′-顺式叶黄素得到显著分离，根据色谱、质谱和光谱信息，对这9种化合物进行了定性分析；建立了全反式叶黄素标准曲线用于定量分析，Y＝6.224X+0.731，R2＝0.9998。
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