CN103018351A

CN103018351A - 叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的hplc-ms检测方法

Info

Publication number: CN103018351A
Application number: CN2011102863562A
Authority: CN
Inventors: 李大婧; 黄占华; 王闯; 李德海
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明属分析技术领域，涉及叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法。将全反式叶黄素光碘异构化反应制得叶黄素顺式异构体，采用YMC Carotenoid C₃₀色谱柱，以甲醇/水＝98/2为流动相，时间70min，流速1.0mL/min，DAD检测器，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm，显著分离叶黄素异构体，正离子质谱(APCI⁺/MS)，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z 200-800，毛细管温度150℃，气化温度450℃，毛细管电压10V，干燥气体流速8mL/min。根据质谱和光谱信息将叶黄素异构体分别确定为全反式、9-顺式、9’-顺式、13-顺式和13’-顺式叶黄素。该分析方法快速有效、重现性好、回收率高，可以对叶黄素制品中的叶黄素顺反异构体含量进行定量分析。

Description

叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法

技术领域

本发明涉及叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，属于液相色谱分析技术领域。

背景技术

叶黄素，是一种含氧类胡萝卜素，广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中，尤其在万寿菊花中含量最高。因为叶黄素能大量吸收近于紫外光的蓝光，因此可过滤损害光感受器和视网膜色素上皮的蓝光，及时补充叶黄素可以防治老年黄斑变性病(AMD)引起的视力下降与失明。另外叶黄素还具有抗氧化，抗癌、抗诱变、延缓动脉硬化等生理功能，是一种天然营养健康的功能性色素。

目前商品叶黄素主要是从万寿菊油树脂中提取分离出的。但是叶黄素不溶于水，在油中也是微溶的，另外叶黄素本身又极易氧化，而且，作为类胡萝卜中一种，与其它种类胡萝卜素一样，叶黄素晶体的生物利用率很低，这些特性决定了叶黄素晶体的应用受到很大的限制。在实际应用中，往往根据不同的食品特性或应用要求，将叶黄素制成不同的产品，如油悬浮液、水分散性干粉等，提高叶黄素的稳定性和生物利用率，以满足食品不同的加工需要。然而在叶黄素产品的制备过程中，反式叶黄素会不可避免地受到光照、加热和空气氧化等作用的影响，并因此产生很多顺式异构体和副产物。叶黄素全反式的化学构象最为稳定，在生物体内反式构象的活性也较顺式构象高很多。因此，叶黄素顺反异构体准确高效的定性、定量分析体系对叶黄素制品的生产和应用具有重要的意义。

HPLC方法由于其灵敏、准确等优点，已经成为叶黄素定性定量检测的主要方法。色谱柱的类型对于分离结果的影响很大，迄今为止，用于类胡萝卜素HPLC分离检测的色谱柱固定相主要有硅胶、C₁₈及C₃₀等，其中，正相硅胶柱不能从其他类胡萝卜素中彻底分离叶黄素；反向C₁₈色谱柱在类胡萝卜素的色谱分离中应用广泛，但不能彻底分离类胡萝卜素及其各种顺式异构体；C₃₀固定相是20世纪90年代研发的一种反相吸附固定相，在类胡萝卜素色谱分离中有良好性能，又称为类胡萝卜素柱。张艳等报道了一种YMC-C₃₀色谱柱分离叶黄素及其异构体的方法，使用流动相为甲基叔丁基醚、甲醇和乙腈，叶黄素异构体分离效果不是很好，并且乙腈和甲基叔丁基醚价格较贵。因此，建立一种快速经济有效的定性定量分析叶黄素顺反异构体的方法尤为重要。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，显著分离叶黄素5种顺反异构体。

技术方案

本发明将全反式叶黄素光碘异构化反应制得叶黄素顺式异构体，经HPLC分离，应用液质联用、光谱对其进行定性分析，同时绘制标准曲线，测定了精密度、稳定性和加标回收率，可以对叶黄素制品中的异构体含量进行定量分析。

包括以下步骤：

(1)叶黄素异构体的制备

叶黄素异构体由全反式叶黄素光碘异构化反应制得。将1mg全反式叶黄素标品溶解于几滴甲苯溶液中，加入10mL碘-己正烷溶液(c＝2μg/mL)，最终碘含量为叶黄素质量的1-2％。将混合溶液放在4盏40w日光灯60cm处照射30min，然后用硫代硫酸钠溶液(1mol/L)洗涤2次，去除多余的碘。有机相用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发至干(T＜30℃)，复溶于甲醇后定容至25mL容量瓶中。

(2)色谱及质谱条件

C₁₈-HPLC分析条件：色谱柱C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)，流动相：甲醇/水＝98/2，时间45min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm。

C₃₀-HPLC分析条件：色谱柱为YMC Carotenoid C₃₀(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇/水＝98/2，时间70min，流速1.0mL/min，DAD检测器，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm。

LC-MS色谱条件与上述色谱条件相同，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，正离子质谱(APCI⁺/MS)，扫描范围m/z 200-800，毛细管温度150℃，气化温度450℃，毛细管电压10V，干燥气体流速8mL/min。

(3)标准溶液的配制

准确称取1mg反式叶黄素标准品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混匀，制成浓度为40μg/mL的标准液。再分别取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL标准液置于10mL容量瓶中，混匀，制成2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的反式叶黄素系列标准液。

(4)精密度试验

吸取叶黄素含量分别为2.5、4.8、8.0μg/mL的供试样品溶液20μL，按照上述色谱条件重复进样6次，计算叶黄素峰面积积分值的RSD值。

(5)稳定性试验

取供试样品溶液，分别于-18℃保存0，12，24，48h后测定，计算叶黄素峰面积积分值的RSD值。

(5)加标回收率试验

分别精密称取3份不同含量的供试样品溶液，添加适量的叶黄素标准溶液，使样品含叶黄素在4～10μg/mL之间，进行液相色谱分析，每份样液重复进样三次，计算加标回收率。

(6)样品的制备

称取一定量的叶黄素制品于锥形瓶中，加入30mL提取剂(己烷-丙酮-乙醇-甲苯)，塞上塞子并充分旋转振摇。用移液管加入2mL 40％KOH甲醇溶液到锥形瓶中，旋转振摇1min，密封一夜(12h)，转移样液至分液漏斗中，用10％硫酸钠洗涤，洗多次去除碱液。取上清液，减压浓缩至干，用甲醇定容至10mL，将样液经0.45μm微孔膜过滤后备用。

本发明中步骤(1)中所述全反式叶黄素标准品购自美国Fluka公司，纯度为97％。

本发明中步骤(6)中所述提取剂己烷/丙酮/乙醇/甲苯比例为10/7/6/7。

以上试验过程均注意避光。

有益效果

1.本发明将异构化样品用C₃₀-HPLC分离，至少分离得到七个峰，且分离效果良好，如图4。这是由于C₃₀烷基的链长与类胡萝卜素分子的长度接近，因而二者的相互作用得到了增强。另外，C₃₀固定相较长的烷基链增加其疏水性，导致非极性类胡萝卜素的保留时间延长，柱效提高，近年来常应用于分离类胡萝卜素几何异构体。甲醇相对于其他色谱洗脱液价格便宜，在流动相中加入少量的水可以使待测组分晚些出峰。碘是一个活跃的催化剂，可以作用于分子的二级结构使其发生弯曲，改变构型，因此常选用碘诱导全反式类胡萝卜素生成顺式异构体。然而将叶黄素标品光-碘异构化后经C₁₈-HPLC分离，得到峰的分离效果不好，如图2所示。

2.本发明对异构化样品进行了正离子模式的LC-APCI-MS和电子吸收光谱分析，以此确定图4中各个峰的归属。LC-APCI-MS检测结果如图5所示，其中包括HPLC分离图、总离子流量图和叶黄素母离子[M+H⁺](m/z 569.1)的提取图。同时对响应较强的几个峰进行了质谱分析，结果显示峰1、2、4、5的质谱图(图7)均与峰3(全反式叶黄素)的质谱图(图6)类似，皆具备[M+H⁺](m/z 569)、[M+H⁺-H₂O](m/z 551)、[M+H⁺-2H₂O](m/z 533)、[M+H⁺-6CH₃](m/z 476)和[M+H⁺-C₉H₁₅O](m/z 431)，为叶黄素共轭双烯链加上一个H⁺失去一个紫罗兰酮环)离子片段，可以判断出以上皆为叶黄素异构体。

但根据质谱图不能具体说明是哪种叶黄素顺式结构。反式叶黄素及其异构体的电子吸收光谱不同，顺式异构体的主吸收峰与反式异构体的主吸收峰相比，其电子吸收光谱发生“紫移”，同时在330～340nm处会出现一个吸收峰，这些光谱特征可作为判断叶黄素异构体的重要依据。由表1可以看出13-顺式和13’-顺式叶黄素与9-顺式、9’-顺式叶黄素光谱最大吸收峰与全反式叶黄素相比分别发生了6～8nm和4nm左右的“紫移”。经计算得到的Q值，与文献值接近。13-顺式通常比13’-顺式更早出峰，这可能是由于13-顺式的极性相对稍强些，9-顺式和9’-顺式呈同样规律。光谱精细结构[100III/II]，为近红团的峰的高度III与中间吸收峰(通常为最大吸收峰λ_max)高度II的比值。全反式叶黄素的精细结构[100III/II]，经测量为63，与乙醇溶液中60相近。由Q值和精细结构可以看出流动相的差异并未引起叶黄素异构体光谱特征发生太大的变化。

表1 叶黄素顺反异构体的鉴定

^a黑体数值表示最大吸收波长，括号中的数值表示拐点。

^bQ值为近紫外区顺式峰与最大吸收峰吸收强度的比值。

^c流动相为甲醇-二氯甲烷(99∶1，v/v)。

3.本发明检测方法具有简便经济、准确性、灵敏度高，重现性好等特点。通过全反式叶黄素拟合标准曲线，得到回归方程为Y＝171.78X-59.24，R²＝0.9992。由于没有顺式叶黄素标准品，其含量根据全反式叶黄素标准曲线进行定量计算。供试样品溶液按照上述色谱条件重复进样6次，叶黄素峰面积积分值的RSD值分别为2.20％、0.63％、1.54％，稳定性试验结果叶黄素峰面积RSD值为2.13％，说明样品溶液-18℃下48h稳定，并且样液的加标回收率在97.1～101.2％之间，平均回收率为99.7％，RSD为2.3％。

附图说明

图1反式叶黄素C₁₈-HPLC色谱图

图2反式叶黄素经碘诱导的C₁₈-HPLC色谱图

图3反式叶黄素C₃₀-HPLC色谱图

图4反式叶黄素经碘诱导的C₃₀-HPLC色谱图

图5反式叶黄素经碘诱导后的C₃₀-HPLC-APCI-MS检测图

图6全反式叶黄素质谱图

图7顺式叶黄素质谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不因此而限制本发明。

实施例1

称取0.01g的叶黄素软胶囊内容物于锥形瓶中，加入30mL提取剂(己烷-丙酮-乙醇-甲苯)，塞上塞子并充分旋转振摇。用移液管加入2mL 40％KOH甲醇溶液到锥形瓶中，旋转振摇1min，密封一夜(12h)，转移样液至分液漏斗中，用10％硫酸钠洗涤，洗多次去除碱液。取上清液，减压浓缩至干，用甲醇定容至10mL，将样液经0.45μm微孔膜过滤后备用。HPLC-MS检测软胶囊中的叶黄素异构体，其中全反式叶黄素含量3.68mg/g、9-顺式叶黄素含量0.056mg/g、9’-顺式叶黄素含量0.06mg/g、13-顺式叶黄素含量0.12mg/g和13’-顺式叶黄素含量0.128mg/g。

C₃₀-HPLC分析条件：色谱柱为YMC Carotenoid C₃₀(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇/水＝98/2，时间70min，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm。正离子质谱(APCI⁺/MS)，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z 200-800，毛细管温度150℃，气化温度450℃，毛细管电压10V，干燥气体流速8mL/min。

实施例2

将叶黄素片剂打粉，称取0.01g粉末于锥形瓶中，加入30mL提取剂(己烷-丙酮-乙醇-甲苯)，塞上塞子并充分旋转振摇。用移液管加入2mL 40％KOH甲醇溶液到锥形瓶中，旋转振摇1min，密封一夜(12h)，转移样液至分液漏斗中，用10％硫酸钠洗涤，洗多次去除碱液。取上清液，减压浓缩至干，用甲醇定容至10mL，将样液经0.45μm微孔膜过滤后备用。HPLC-MS检测片剂中的叶黄素异构体，其中全反式叶黄素含量13.76mg/g、9-顺式叶黄素含量0.35mg/g、9’-顺式叶黄素含量0.37mg/g、13-顺式叶黄素含量0.77mg/g和13’-顺式叶黄素含量0.82mg/g。

Claims

1.叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征在于将全反式叶黄素光碘异构化反应制得叶黄素顺式异构体，经HPLC分离，应用液质联用(HPLC-DAD-MS)、光谱对其进行定性分析，同时绘制标准曲线，测定了精密度、稳定性和加标回收率，可以对叶黄素制品中的异构体含量进行定量分析。

2.权利要求1所述叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征在于HPLC条件为色谱柱YMC Carotenoid C₃₀(4.6mm×250mm，5μm)，流动相甲醇/水＝98/2，时间70min，流速1.0mL/min，DAD检测器，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm。

3.权利要求1所述叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征在于LC-MS色谱条件与上述色谱条件相同，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，正离子质谱(APCI⁺/MS)，扫描范围m/z 200-800，毛细管温度150℃，气化温度450℃，毛细管电压10V，干燥气体流速8mL/min。

4.权利要求1所述叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征在于叶黄素顺反异构体质谱图皆具备[M+H⁺](m/z 569)、[M+H⁺-H₂O](m/z 551)、[M+H⁺-2H₂O](m/z 533)、[M+H⁺-6CH₃](m/z 476)和[M+H⁺-C₉H₁₅O](m/z 431)，为叶黄素共轭双烯链加上一个H⁺失去一个紫罗兰酮环)离子片段。

5.权利要求1所述叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征是，在上述HPLC条件下，有5种叶黄素异构体中能够得到显著分离，并根据质谱和光谱信息这几种物质分别确定为全反式、9-顺式、9’-顺式、13-顺式和13’-顺式叶黄素。全反式叶黄素标准曲线为Y＝171.78X-59.24(R²＝0.9992)，方法重现性好、回收率高。

6.权利要求1所述叶黄素制品中叶黄素顺反异构体的HPLC-MS检测方法，其特征在于叶黄素制品为叶黄素油悬浮液、乳液、水分散性干粉等以叶黄素为主要原料的加工产品。