CN105675525B - 一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法。所述方法通过测定已知浓度的栀子黄样品水溶液的吸光值，推算总藏花酸衍生物的吸光系数，按郎伯比尔定律计算样品中藏花酸衍生物总量；根据各藏花酸衍生物组分的色谱峰面积和吸光系数计算样品中各藏花酸衍生物组分的相对质量；根据栀子黄样品的藏花酸衍生物总量和各藏花酸衍生物组分的相对质量计算样品中各藏花酸衍生物组分的质量。所述方法采用各含藏花酸结构组分的分子离子峰m/z值代替该组分的分子量，能够在部分藏花酸酯分子结构尚未澄清的情况下，实现对栀子黄产品中藏花酸酯含量和组成的定量分析。所述方法具有简单、易行、重复性良好等优点。

Description

一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物(主要包括酯)总量和组成的方法。

背景技术

栀子，学名Gardenia jasminoides Ellis，又名：黄果子、山黄枝、黄栀子、山栀子、水栀子、越桃、木丹、山黄栀、白蟾等，属茜草科植物。栀子的果实为传统中药材，是卫生部颁布的药食两用资源。栀子果实是秦汉以前应用最广的黄色染料。其中主要的色素为藏花酸衍生物，主要为一系列糖苷构成的酯类，含量最多的是藏花素(Crocin)。

栀子黄是中国(GB-2760)和日本两国均已批准合法使用的食品添加剂，属着色剂。其功能是给食品着色。

栀子黄是栀子果实的萃取物。其中主要的色素是一系列藏花酸(亦称西红花酸，Crocetin)衍生物(主要为酯)。藏花酸为化合物的中文习惯命名，Crocetin为化合物的英文习惯命名，8,8'-双阿朴胡萝卜素-8,8'-二酸为化合物的中文半系统命名，8,8'-Diapocarotene-8,8'-dioic acid为化合物的英文半系统命名。化合物分子式为C₂₀H₂₄O₄，分子量为328.402Da。由于藏花酸分子中存在7个共轭双键，在理论上它可存在多种几何异构体。在自然界中，全反式异构体的数量最多，最常见。全反式藏花酸分子的结构如下：

栀子黄由色素和非色素组分组成。其中的色素组分包含一系列藏花酸衍生物和少量非藏花酸衍生物组分，具有颜色。非色素组分不具颜色。在色素组分中，藏花酸衍生物占多数。在藏花酸衍生物中，藏花素(Crocin)占多数。藏花素是由两个龙胆二糖和藏花酸形成的酯化物。其熔点为186℃，结晶体为深橙色，在水溶液中显橘黄色。全反式藏花素分子的结构为：

中国和日本两国均已颁布了栀子黄产品的国家标准。这两份文件都描述了应用电子吸收光谱法(UV-VIS)测定产品吸光系数(以色价表示)的方法，但未涉及藏花酸衍生物含量的测定，只提出将藏花素作为产品的标志性成分来描述产品的着色功能。这种评价方法具有简便易行的优点，但不能全面反映产品的着色功能与色素间的量效关系，也不利于产品的安全性评估。

到目前为止，栀子黄中尚有部分藏花酸衍生物和非藏花酸衍生物组分的分子结构尚未被描述清楚。描述这些组分结构的努力仍在持续。在这种情况下，测定这些组分的浓度吸光系数(如)是可能的。已知这些未知组分的浓度吸光系数后，可以完成栀子黄样品中藏花酸衍生物组分总量和组成的测定。

发明内容

为了克服现有的标准中只对栀子黄色素着色功能定性描述的不足，实现对栀子黄色素着色物质的定量检测，全面反映产品的着色功能与色素间的量效关系，便于对产品的安全性进行评估，本发明提供一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法。所述方法可在部分藏花酸衍生物分子结构尚未明确的情况下使用，并具有简单、易行、重复性良好等优点。

为实现上述目标，本发明采用以下技术方案：

一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，所述方法包括测定已知浓度的栀子黄样品水溶液的吸光值，推算总藏花酸衍生物吸光系数，按郎伯比尔定律计算样品中藏花酸衍生物总量；根据各藏花酸衍生物组分的色谱峰面积和吸光系数计算样品中各藏花酸衍生物组分的相对质量，根据栀子黄样品的藏花酸衍生物总量和各藏花酸衍生物组分的相对质量计算样品中各藏花酸衍生物组分的质量。

一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，所述方法包括以下步骤：

1)测定栀子黄样品的吸光值。称取M克栀子黄样品，溶解并定容于V毫升水中，将溶液稀释N倍，在紫外-可见光(UV-VIS)分光光度计上测定稀释液在440nm波长下的吸光值A。

2)获得样品的色谱图。在高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)上获得样品的色谱图。色谱条件是：固定相为C18柱，参数为：250×4.6mm i.d.,5μm。流动相A为水-乙腈-乙酸，体积比为74.95:25:0.05。流动相B为乙腈。采取线性梯度洗脱方法：流动相B在20分钟内从0升至13.3％(V/V)，20-35分钟内B维持13.3％(V/V)，流速为0.8毫升/分，进样体积20微升，柱温为室温。检测波长为440nm。对各组分积分得到峰面积。

3)鉴定含有藏花酸结构的各组分。应用HPLC-MS-MS，鉴定色谱图上含有藏花酸结构的各组分。色谱条件：同步骤2)。质谱条件：喷雾电压：-4Kv，鞘气30arb，辅助气10arb，吹扫气0arb；毛细管温度350℃；负离子检测模式；数据依赖性扫描；CID碰撞能量35％；碎片质量检测范围m/z为150至2000。

4)记录各组分的分子离子峰m/z值。在一级质谱图上，鉴定各含藏花酸结构组分的分子离子峰，并记录各含藏花酸结构组分的分子离子峰m/z值。

5)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例。按式(1)计算各藏花酸衍生物组分峰面积的相对比例：

$F_i^{\′}\[\%\]=\frac{F_i}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i}\×100\%---\left(1\right)$

其中，F'_i是含藏花酸结构组分i峰面积的相对比例，F_i是组分i的峰面积，n是含藏花酸结构组分的数量。

6)计算各藏花酸衍生物组分的浓度吸光系数。根据已公布的藏花酸浓度吸光系数(甲醇)，按式(2)计算各含藏花酸结构组分的浓度吸光系数：

$A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}=A_{1{\mathrm{cm}}_c}^{1\%}\×\frac{{\mathrm{MW}}_c}{{\mathrm{MW}}_i}---\left(2\right)$

其中，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为1％(W/W)的样品溶液在1cm光程的比色杯中在440nm波长下的吸光值；是已公布的藏花酸在440nm下的浓度吸光系数，在此采用的值为(甲醇)；i是含藏花酸结构组分的编号；MW_c是藏花酸分子量[Da]；MW_i是含藏花酸结构组分i的分子量[Da]，在此，采用该组分分子离子峰的m/z值。

7)计算栀子黄产品中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数。根据式(1)和式(2)的计算结果，按式(3)以加权求和法计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数：

$A_{1{\mathrm{cm}}_{Total}}^{1\%}={\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i^{\′}{A}_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}---\left(3\right)$

其中，是总藏花酸衍生物的浓度吸光系数，F'_i是含藏花酸结构组分i的峰面积的相对比例，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为1％(W/W)的样品溶液在1cm光程的比色槽中在440nm下的吸光值，i是含藏花酸结构组分的编号，n是含藏花酸结构组分的数量。

8)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量。按式(4)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量：

$M_{Total}^{\′}=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i}{{\mathrm{\Σ}}_{j=1}^m{F}_j}---\left(4\right)$

其中，M'_Total是总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量，F_i是含藏花酸结构组分i的峰面积，n是含藏花酸结构组分的峰的数量，F_j是在440nm下有吸收组分j的峰面积，m是在440nm下有吸收组分的数量。

9)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量。根据式(1)、式(3)和式(4)所得结果，按式(5)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量：

$M_{Total}\[g\]=\frac{{\mathrm{AM}}_{Total}^{\′}V\[mL\]N}{A_{1{\mathrm{cm}}_{Total}}^{1\%}\×100}---\left(5\right)$

其中，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量；A是样品溶液的吸光值；是总藏花酸衍生物的浓度吸光系数；V是样品定容体积；N是溶液的稀释倍数。

10)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量。按式(6)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量：

$M_{Total}^{\′\′}\[\%\]=\frac{M_{Total}}{M}\×100\%---\left(6\right)$

其中，M”_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物相对含量，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量，M是栀子黄样品的质量。

11)计算各藏花酸衍生物的相对质量。按式(7)，根据HPLC色谱图上各组分峰面积计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的相对质量。

$M_i^{\′}\[\%\]=\frac{\frac{F_i}{A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}}}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n\frac{F_i}{A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}}}\×100\%---\left(7\right)$

其中，M'_i[％]是含藏花酸结构组分i的相对质量，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，F_i是含藏花酸结构组分i的峰的面积，n是含藏花酸结构组分的数量。

12)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量。按式(8)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量。

M_i[g]＝M′_iM_Total (8)

其中，M_i是含藏花酸结构组分i的质量，M'_i是含藏花酸结构组分i的相对质量，i是含藏花酸结构组分的编号，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量。

本发明的优点和有益效果为：

1)提供了一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，能够精确计算栀子黄产品中藏花酸衍生物总含量和各组分含量，实现对栀子黄产品着色能力的量化评估，并为产品的安全性评估创造了条件。

2)本发明提供的测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法能够在部分藏花酸衍生物分子结构尚不清楚的情况下应用，因而具有很好的实用价值。

3)本方法具有简单、可行、重复性良好等优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明所述一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法流程图。

具体实施方式

实施例1

选标注色价(E)为500的栀子黄产品为测试样品。参见图1，实施步骤如下：

1)测定栀子黄样品的吸光值。准确称取样品0.0502克(精确到0.0001克)，在水中完全溶解后定容至50mL，将溶液稀释100倍。在紫外可见光分光光度计上，440nm波长下，测定稀释液吸光值A为0.5064。

2)获得样品的色谱图。在HPLC-PDA(反相高效液相色谱法)上获得样品的色谱图。色谱条件是：固定相为C18柱，参数为250×4.6mm i.d.,5μm；流动相A为水-乙腈-乙酸，体积比为74.95:25:0.05；流动相B为乙腈；采取线性梯度洗脱方法：流动相B在20分钟内从0升至13.3％(V/V)，20-35分钟内B维持13.3％(V/V)，流速为0.8毫升/分，进样体积20微升，柱温为室温；检测波长为440nm。对各组分积分得到峰面积，如表1所示。

3)鉴定含有藏花酸结构的各组分。应用HPLC-MS-MS，鉴定色谱图上含有藏花酸结构的各组分。色谱条件：同步骤2)。质谱条件：喷雾电压：-4Kv，鞘气30arb，辅助气10arb，吹扫气0arb；毛细管温度350℃；负离子检测模式；数据依赖性扫描；CID碰撞能量35％；碎片质量检测范围m/z为150至2000。

4)计算各组分的分子离子峰m/z值。在一级质谱图上，鉴定各含藏花酸结构组分的分子离子峰，并记录各含藏花酸结构组分的分子离子峰m/z值。如表1所示。

5)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例。按式(1)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例，如表1所示。

6)计算各组分的浓度吸光系数。根据已公布的藏花酸浓度吸光系数(甲醇)，按式(2)计算各含藏花酸结构组分的浓度吸光系数，如表1所示。

7)计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数。根据式(1)和式(2)的计算结果，按式(3)以加权求和法计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数为1125。

8)计算藏花酸衍生物在总色素中的相对含量。按式(4)计算藏花酸衍生物在总色素中的相对含量为97.20％。

9)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的含量。根据式(1)、式(3)和式(4)所得结果，按式(5)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量为0.0225g。

10)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量。按式(6)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量为44.82％。

11)计算各藏花酸衍生物的相对质量。按式(7)，根据HPLC色谱图计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的相对质量，如表1所示。

12)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量。按式(8)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量，如表1所示。

表1标注色价(E)为500的栀子黄样品各组分色谱行为、光谱特征和含量

实施例2

选标注色价(E)为450的栀子黄产品为测试样品。参见图1，实施步骤如下：

1)测定栀子黄样品的吸光值。准确称取样品0.0531克(精确到0.0001克)，在水中完全溶解后定容至50mL，将溶液稀释100倍。在紫外可见光分光光度计上，440nm波长下，测定稀释液吸光值A为0.4971。

2)获得样品的色谱图。在HPLC-PDA(反相高效液相色谱法)上获得样品的色谱图。色谱条件是：固定相为C18柱，参数为250×4.6mm i.d.,5μm；流动相A为水-乙腈-乙酸，体积比为74.95:25:0.05；流动相B为乙腈；采取线性梯度洗脱方法：流动相B在20分钟内从0升至13.3％(V/V)，20-35分钟内B维持13.3％(V/V)，流速为0.8毫升/分，进样体积20微升，柱温为室温；检测波长为440nm。对各组分积分得到峰面积，如表2所示。

3)鉴定含有藏花酸结构的各组分。应用HPLC-MS-MS，鉴定色谱图上含有藏花酸结构的各组分。色谱条件：同步骤2)。质谱条件：喷雾电压：-4Kv，鞘气30arb，辅助气10arb，吹扫气0arb；毛细管温度350℃；负离子检测模式；数据依赖性扫描；CID碰撞能量35％；碎片质量检测范围m/z为150至2000。

4)计算各组分的分子离子峰m/z值。在一级质谱图上，鉴定各含藏花酸结构组分的分子离子峰，并记录各含藏花酸结构组分的分子离子峰m/z值。如表2所示。

5)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例。按式(1)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例，如表2所示。

6)计算各组分的浓度吸光系数。根据已公布的藏花酸浓度吸光系数(甲醇)，按式(2)计算各含藏花酸结构组分的浓度吸光系数，如表2所示。

7)计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数。根据式(1)和式(2)的计算结果，按式(3)以加权求和法计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数为1127。

8)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量。按式(4)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量为99.09％。

9)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量。根据式(1)、式(3)和式(4)所得结果，按式(5)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量为0.0221g。

10)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量。按式(6)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生的相对含量为41.62％。

11)计算各藏花酸衍生物的相对质量。按式(7)，根据HPLC色谱图计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的相对质量，如表2所示。

12)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量。按式(8)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量，如表2所示。

表2标注色价(E)为450的栀子黄样品各组分色谱行为、光谱特征和含量

最后应说明的是：显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的专业人员，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (1)

1.一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)测定栀子黄样品的吸光值：称取M克栀子黄样品，溶解并定容于V毫升水中，将溶液稀释N倍，在紫外-可见光(UV-VIS)分光光度计上测定稀释液在440nm波长下的吸光值A；

2)获得样品的色谱图；在高效液相色谱上获得样品的色谱图；色谱条件是：固定相为C18柱，参数为：250×4.6mm i.d.,5μm；流动相A为水-乙腈-乙酸，体积比为74.95:25:0.05；流动相B为乙腈；采取线性梯度洗脱方法：流动相B在20分钟内从0升至13.3％(V/V)，20-35分钟内B维持13.3％(V/V)，流速为0.8毫升/分，进样体积20微升，柱温为室温；检测波长为440nm；对各组分积分得到峰面积；

3)鉴定含有藏花酸结构的各组分；应用HPLC-MS-MS，鉴定色谱图上含有藏花酸结构的各组分；色谱条件：同步骤2)；质谱条件：喷雾电压：-4Kv，鞘气30arb，辅助气10arb，吹扫气0arb；毛细管温度350℃；负离子检测模式；数据依赖性扫描；CID碰撞能量35％；碎片质量检测范围m/z为150至2000；

4)记录各组分的分子离子峰m/z值；在一级质谱图上，鉴定各含藏花酸结构组分的分子离子峰，并记录各含藏花酸结构组分的分子离子峰m/z值；

5)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例；按式(1)计算各藏花酸衍生物组分峰面积的相对比例：

$F_i^{\′}\[\%\]=\frac{F_i}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i}\×100\%---\left(1\right)$

其中，F'_i是含藏花酸结构组分i峰面积的相对比例，F_i是组分i的峰面积，n是含藏花酸结构组分的数量；

6)计算各藏花酸衍生物组分的浓度吸光系数；根据已公布的藏花酸浓度吸光系数按式(2)计算各含藏花酸结构组分的浓度吸光系数：

$A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}=A_{1{\mathrm{cm}}_c}^{1\%}\×\frac{{\mathrm{MW}}_c}{{\mathrm{MW}}_i}---\left(2\right)$

其中，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为1％(W/W)的样品溶液在1cm光程的比色杯中在440nm波长下的吸光值；是已公布的藏花酸在440nm下的浓度吸光系数，在此采用的值为i是含藏花酸结构组分的编号；MW_c是藏花酸分子量[Da]；MW_i是含藏花酸结构组分i的分子量[Da]，在此，采用该组分分子离子峰的m/z值；

7)计算栀子黄产品中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数；根据式(1)和式(2)的计算结果，按式(3)以加权求和法计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数：

$A_{1{\mathrm{cm}}_{Total}}^{1\%}={\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i^{\′}{A}_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}---\left(3\right)$

其中，是总藏花酸衍生物的浓度吸光系数，F'_i是含藏花酸结构组分i的峰面积的相对比例，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为1％(W/W)的样品溶液在1cm光程的比色槽中在440nm下的吸光值，i是含藏花酸结构组分的编号，n是含藏花酸结构组分的数量；

8)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量；按式(4)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量：

$M_{Total}^{\′}=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{F}_i}{{\mathrm{\Σ}}_{j=1}^m{F}_j}---\left(4\right)$

其中，M'_Total是总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量，F_i是含藏花酸结构组分i的峰面积，n是含藏花酸结构组分的峰的数量，F_j是在440nm下有吸收组分j的峰面积，m是在440nm下有吸收组分的数量；

9)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量；根据式(1)、式(3)和式(4)所得结果，按式(5)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量：

$M_{Total}\[g\]=\frac{{\mathrm{AM}}_{Total}^{\′}V\[mL\]N}{A_{1{\mathrm{cm}}_{Total}}^{1\%}\×100}---\left(5\right)$

其中，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量；A是样品溶液的吸光值；是总藏花酸衍生物的浓度吸光系数；V是样品定容体积；N是溶液的稀释倍数；

10)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量；按式(6)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物的相对含量：

$M_{Total}^{\′\′}\[\%\]=\frac{M_{Total}}{M}\×100\%---\left(6\right)$

其中，M”_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物相对含量，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量，M是栀子黄样品的质量；

11)计算各藏花酸衍生物的相对质量；按式(7)，根据HPLC色谱图上各组分峰面积计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的相对质量；

$M_i^{\′}\[\%\]=\frac{\frac{F_i}{A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}}}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n\frac{F_i}{A_{1{\mathrm{cm}}_i}^{1\%}}}\×100\%---\left(7\right)$

其中，M'_i[％]是含藏花酸结构组分i的相对质量，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，F_i是含藏花酸结构组分i的峰的面积，n是含藏花酸结构组分的数量；

12)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量；按式(8)计算栀子黄样品中各藏花酸衍生物的质量；

M_i[g]＝M_i′M_Total (8)

其中，M_i是含藏花酸结构组分i的质量，M'_i是含藏花酸结构组分i的相对质量，i是含藏花酸结构组分的编号，M_Total是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量。