CN104055756B - 盐酸萘替芬的衍生物、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了盐酸萘替芬的衍生物、制备方法及用途。本发明的盐酸萘替芬的衍生物，结构如式I所示。本发明发现通过抑制金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN的表达和/或功能，强效抑制金黄色色素的合成，从而能够降低细菌的致病力。金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN，可作为药物作用靶点，能够抑制催化酶CrtN表达和/或功能的化合物可以用于制备抗菌药物。本发明的盐酸萘替芬及其衍生物，可作为催化酶CrtN的抑制剂，强效抑制金黄色色素的合成，从而能够降低金黄色葡萄球菌的致病力，可用于制备抗菌药物，尤其是制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及药理学、药物化学和药物治疗学领域，更具体涉及盐酸萘替芬及其衍生物、制备方法、抗菌新用途，及其发挥抗菌作用的靶点CrtN。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是严重危害人类生命健康的一种重要病原菌。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起人类化脓感染中最常见的病原菌，可直接导致局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
随着生命科学及医学的发展，人们发现病原菌包括金黄色葡萄球菌具有致病性是因为它们通过产生各种各样的毒力因子(Virulence factor)以帮助细菌的定植、粘附、细胞毒性、免疫逃避等从而使得细菌成功地实施了感染。
由于各种耐药细菌的出现和蔓延，抗细菌毒力的药物(Anti-virulence drugs)正在成为新型抗细菌感染药物研究所关注的热点。目前抗细菌毒力的药物主要通过5种途径发挥作用：(1)遏制目标菌的毒素表达；(2)阻断细菌之间的群体感应；(3)抑制毒素分泌和传递；(4)阻断细菌黏附的各个环节；(5)抑制细菌免疫逃避。任何一种具有上述5种效果之一的药物都可以降低细菌的致病性，有效地预防和治疗多种感染疾病。
2005年，美国加州大学圣地亚哥分校(UCSD)Victor Nizet教授发现金黄色葡萄球菌的金黄色色素(Staphyloxanthin)具有帮助金黄色葡萄球菌逃避人体先天免疫系统产生的活性氧的杀害能力，是决定细菌致病能力的一个关键因子。美国伊利诺大学香槟校区EricOldfield教授等成功发现一个已知的胆固醇合成抑制剂BPH-652能抑制金黄色葡萄球菌内金黄色色素的形成，从而消减金黄色葡萄球菌在小鼠体内的致病能力。也有一些研究报道，金黄色色素可以增加细菌对油酸的抵抗能力，在小鼠皮下感染模型实验中，不能产生色素的突变株引发的脓肿区域较野生型菌株明显减少，暗示色素能够通过提高细菌抗氧化的能力从而增加细菌的毒力。这些已有的研究初步证实抑制金黄色葡萄球菌的毒力因子金黄色色素的合成是新的、有效的抗菌药物策略。
中国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，由此造成的细菌耐药性问题尤为突出，临床分离的一些细菌对某些抗生素的耐药性已居世界首位。面对严峻的细菌抗生素耐药性，我们亟需发现新型的抗菌药物作用靶点和新型的抗细菌感染药物。
因此，研究开发抗金黄色色素合成的抗菌药物具有重要的现实意义和科学价值。
发明内容
本发明的目的在于提供盐酸萘替芬及其衍生物的制备方法和新用途。
本发明的另一目的在于提供新型结构的盐酸萘替芬衍生物。
此外，本发明还提供催化酶CtrN抑制剂的用途及降低细菌致病性或毒性的方法。
本发明的第一方面，提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐的应用，用于制备抗菌药物，
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。
在另一优选例中，所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物。
本发明的第二方面，提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐的应用，用于制备催化酶CrtN抑制剂，或用于制备抑制金黄色色素合成的药物，
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。
在另一优选例中，Ar为苯基、萘基、C1-C6烷基取代的苯基。
本发明的第三方面，提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐，
式中，Ar为R1为C2-C6烷基，R2为氢；
或R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。
在另一优选例中，R1为C3-C5烷基，R2为氢；
或R1、R2与相邻的碳原子共同形成苯环。
在另一优选例中，式I化合物药学上可接受的盐为盐酸盐，选自：
本发明的第四方面，提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)式II化合物与式III化合物反应生成式I化合物；以及任选地
(b)由式I化合物生成式I化合物盐酸盐的步骤，
各式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
本发明的第五方面，提供一种抗菌药物组合物，所述组合物包含降低催化酶CrtN活性的化合物；以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述抗菌是指控制细菌致病性。
在另一优选例中，所述降低催化酶CrtN活性的化合物是指可与催化酶CrtN直接结合，从而抑制催化酶CrtN活性的化合物。
在另一优选例中，所述降低催化酶CrtN活性的化合物是指可与细菌自身的某些序列结合，从而引起催化酶CrtN的表达降低的化合物。
在另一优选例中，所述降低催化酶活性的化合物为式I化合物或其药学上可接受的盐，
式中，R1、R2独立地为氢、C1-C6烷基；
或R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。
在另一优选例中，所述抗菌药物组合物为抗金黄色葡萄球菌的药物组合物。
本发明的第六方面，提供一种抑制催化酶CrtN或抑制金黄色色素合成的药物组合物，包含式I化合物或其药学上可接受的盐；以及
药学上可接受的载体，
式中，R1、R2独立地为氢、C1-C6烷基；
或R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。
本发明的第七方面，提供一种催化酶CrtN抑制剂的用途，用于制备降低细菌致病能力的药物组合物或抗菌组合物。
本发明的第八方面，提供一种降低细菌致病性或毒性的方法，包括步骤：
将细菌与催化酶CrtN的抑制剂进行接触，从而降低细菌致病性或毒性。
在另一优选例中，所述的方法是非治疗性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是治疗性的方法。
在另一优选例中，所述的接触导致细菌中催化酶CrtN的表达和/或活性下降。
在另一优选例中，所述的催化酶CrtN抑制剂包括：式I化合物或其药学上可接受的盐，抑制CrtN表达的反义核酸或miRNA、抗CrtN的抗体、或其组合。
本发明的第九方面，提供一种减毒的细菌菌株，所述的细菌菌株中催化酶CrtN的活性下降或丧失导致细菌的毒性降低。
在另一优选例中，CrtN活性的下降或丧失是通过施与CrtN抑制剂实现的。
在另一优选例中，CrtN活性的下降或丧失是通过基因的干扰或敲出实现的。
在另一优选例中，减毒的细菌菌株是减毒的金黄色葡萄球菌菌株。
本发明的第十方面，提供第九方面所述的细菌菌株的用途，用于筛选降低金黄色葡萄球菌的致病性和/或毒性的化合物。
本发明的第十一方面，提供一种筛选降低细菌的致病性和/或毒性的化合物的方法，包括步骤：
(a)提供一待测试化合物，并测定所述待测试化合物是否与催化酶CrtN发生相互作用，并选出催化酶CrtN抑制剂，其中如果所述测试化合物降低催化酶CrtN活性，或导致催化酶CrtN表达下降，则表明所述待测试化合物为催化酶CrtN抑制剂；
(b)在实验组中，将上一步骤中选出的催化酶CrtN抑制剂，与细菌接触，测定细菌的致病性和/或毒性，并与对照组进行比较，从而筛选出降低细菌的致病性和/或毒性的化合物。
在另一优选例中，所述的对照组除了不与所述催化酶CrtN抑制剂接触之外，其它实验条件与实验组实验条件相同。
本发明的第十二方面，提供一种降低细菌的致病性和/或毒性的化合物，所述的化合物是用第十一方面所述方法筛选出的。
本发明的第十三方面，提供一种抑制催化酶CrtN或抑制金黄色色素合成的方法，向所需要的对象或向环境中施用安全有效量的式I化合物。
在另一优选例中，所述需要的对象包括人或非人哺乳动物，较佳地，为人、小鼠或大鼠。
本发明的第十四方面，提供一种抗金黄色葡萄球菌的方法，向所需要的对象施用安全有效量的式I化合物或向环境中施用抑菌有效量的式I化合物。
在另一优选例中，所述需要的对象包括体外培养的细胞、人或非人哺乳动物，较佳地，为人、小鼠或大鼠。
本发明的第十五方面，一种抗菌方法，向所需要的对象施用安全有效量的式I化合物。
在另一优选例中，所述需要的对象包括体外培养的细胞、人或非人哺乳动物，较佳地，为人、小鼠或大鼠。
本发明的第十六方面，提供一种用于治疗细菌感染的方法，包括以下步骤：向被细菌感染的对象施与安全有效量的药物或药物组合物，其中，
所述药物为可降低催化酶CrtN活性的化合物；
所述药物组合物包括可降低催化酶CrtN活性的化合物，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中所述药物或药物组合物与细菌接触并作用一段时间，从而降低细菌的致病性和/或毒性。
在另一优选例中，所述需要的对象包括人或非人哺乳动物，较佳地，为人、小鼠或大鼠。在另一优选例中，向所述对象施与的方式没有特别的限制，包括但不限于口服，注射，吸入，局部使用。
本发明中，“安全有效量”指的是：活性成分(式I化合物)的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。
本发明中，所述的催化酶CrtN是指来自金黄色葡萄球菌中金黄色色素合成途径的脱氢鲨烯去饱和酶(dehydrosqualene desaturase)、与催化酶CrtN具有同源性的蛋白。在另一优选例中，与催化酶CrtN具有同源性的蛋白是指与金黄色葡萄球菌催化酶CrtN在氨基酸序列上具有一定相似性(同源性大于30％)的蛋白质。在另一优选例中，一般认为序列同源性大于30％的蛋白质由同一祖先进化而来。在另一优选例中，催化酶CrtN也可指与金黄色葡萄球菌CrtN蛋白具有相同或相似功能的蛋白质。
本发明中，金黄色葡萄球菌金黄色色素合成途径中的脱氢鲨烯去饱和酶(dehydrosqualene desaturase)，能够连续催化三步脱氢反应，以在脱氢鲨烯(4,4'-diapo phytoene)中引入三个双键，相应地依次形成4,4'-二脱辅基六氢番茄红素(4,4'-diapophytofluene)，4,4'-二脱辅基-ζ-胡萝卜素(4,4'-diapo-zeta-carotene)以及4,4'-二脱辅基链孢红素(4,4'-diaponeurosporene)的氧化还原酶。其中，4,4'-二脱辅基链孢红素(4,4'-diaponeurosporene)是葡萄球菌中主要的C30类胡萝卜素，呈现金黄色，可经进一步修饰形成葡萄球菌中主要的金黄色色素(staphyloxanthin)。该酶需要FAD作为辅因子参与反应，其催化的特性如下：15-顺式-4,4'-二脱辅基八氢番茄红素(15-cis-4,4'-diapophytoene)+4FAD＝全反式-4,4'-二脱辅基番茄红素(all-trans-4,4'-diapolycopene)+4FADH2。
本发明中，所述细菌包括革兰氏阳性菌，在另一优选例中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌。所述细菌还包括通过催化酶CrtN及其同源蛋白产生类胡萝卜素的其他细菌。
本发明首次发现通过抑制金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN的表达和/或功能，强效抑制金黄色色素的合成，从而能够降低细菌的致病力。金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN，可作为药物作用靶点，能够抑制催化酶CrtN表达和/或功能的化合物可以用于制备抗菌药物。
本发明首次发现盐酸萘替芬及其衍生物能够通过抑制金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN，强效抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素的合成。在小鼠皮下和系统感染模型中，发现crtN基因的突变体的致病能力显著下降500～5000倍左右，证实CrtN是一个新的抗金黄色葡萄球菌毒力的药物作用靶点。在动物感染实验中，发现盐酸萘替芬及其衍生物可显著地降低金黄色葡萄球菌(Newman)在小鼠肾脏、心脏、以及肝脏中的定植，降低耐药性金黄色葡萄球菌Mu50(甲氧西林耐药、万古霉素中度耐药)在小鼠心脏、以及肝脏中的定植，针对致死剂量的金黄色葡萄球菌(Newman)的感染，盐酸萘替芬可显著延长小鼠的存活时间，疗效与万古霉素类似。
体内外研究均证实，盐酸萘替芬及其衍生物具有明确的抗甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Newman)和抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(Mu50)的药效，为今后进一步设计开发新型抗细菌感染药物奠定了结构和理论基础。本发明的盐酸萘替芬及其衍生物，可作为催化酶CrtN的抑制剂，强效抑制金黄色色素的合成，从而能够降低金黄色葡萄球菌的致病力，可用于制备抗菌药物，尤其是制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明化合物1抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物1的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0μM。
图2为本发明化合物2抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物2的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM。
图3为本发明化合物3抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物3的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM。
图4为本发明化合物4抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物4的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM。
图5为化合物1抑制金黄色色素合成的量效关系曲线图。
图6为化合物2抑制金黄色色素合成的量效关系曲线图。
图7为化合物3抑制金黄色色素合成的量效关系曲线图。
图8为化合物4抑制金黄色色素合成的量效关系曲线图。
图9为金黄色色素合成途径中间代谢产物的HPLC分析图。
图10为大肠杆菌、大肠杆菌中过表达crtM、大肠杆菌中过表达crtMN的代谢产物HPLC分析图。
图11为抑制金黄色色素合成图，其中(A)从左至右为：crtN过表达菌株、野生型菌株、ispA过表达菌株；(B)从左至右为：crtN过表达菌株+化合物1(终浓度依次为10μM、1μM、0μM)、以及野生型菌株；(C)从左至右为：ispA过表达菌株+化合物1(终浓度依次为10μM、1μM、0μM)、以及野生型菌株。
图12为CrtN蛋白(大小:56.7Kd)被嗜热菌蛋白酶(thermolysin)酶切后的考马斯亮蓝染色结果图。M:标记蛋白(Marker)；a：CrtN对照(不加化合物1和嗜热菌蛋白酶)；b：化合物1:CrtN＝672:1(m/m)；c：化合物1:CrtN＝336:1(m/m)；d：化合物1:CrtN＝168:1(m/m)；e：化合物1:CrtN＝84:1(m/m)；f：化合物1:CrtN＝42:1(m/m)；g：CrtN对照(不加化合物1，加嗜热菌蛋白酶)。
图13为crtN基因的失活导致金黄色葡萄球菌皮下致病力显著下降图。
图14为系统感染小鼠实验中化合物1抗金黄色葡萄球菌Newman药效图。
图15为crtN基因的失活导致金黄色葡萄球菌系统致病力显著下降图
图16为系统感染小鼠实验中化合物1抗耐药金黄色葡萄球菌Mu50药效图。
图17为系统感染小鼠实验中化合物1延长小鼠存活时间图。
具体实施方式
本申发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现盐酸萘替芬及其衍生物能够通过抑制关键催化酶CrtN抑制金黄色色素的合成，从而降低金黄色葡萄球菌的致病力，可以用于制备抗菌药物，特别是用于制备抗金黄色葡萄球菌的药物。在此基础上，完成了本发明。
术语
C1-C6烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基，如氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基等。
C6-C10芳基是指具有6-10个碳原子的芳环基，如苯基、萘基等。
盐酸萘替芬
化学名为(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-苯基-丙-2-烯-1-胺盐酸盐，结构如下所示：
盐酸萘替芬于1985年在德国、奥地利、马来西亚和新加坡等国上市，其商品名为Exoderil。作为烯丙胺类麦角固醇合成抑制剂的代表，萘替芬是一个高效、低毒的外用抗真菌药。目前还未见盐酸萘替芬抗细菌用途的报道。
式I化合物或其药学上可接受的盐
本发明中式I化合物，是指具有以下结构的化合物：
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。
在另一优选例中，Ar为苯基、萘基、C1-C6烷基取代的苯基。在另一优选例中，Ar为萘基、C2-C6烷基取代的苯基。
在另一优选例中，Ar为其中，R1、R2独立地为C1-C6烷基或氢；或者R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。在另一优选例中，R1为C2-C6烷基，R2为氢；或R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。在另一优选例中，R1为C3-C5烷基，R2为氢；或R1、R2与相邻的碳原子共同形成苯环。
在另一优选例中，R1为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，R2为氢。
在另一优选例中，式I化合物的盐酸盐选自：
制备方法
本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：
(a)式II化合物与式III化合物反应生成式I化合物；以及任选地
(b)由式I化合物生成式I化合物盐酸盐的步骤，
各式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
在另一优选例中，Ar为苯基、萘基、C1-C6烷基取代的苯基。
在另一优选例中，Ar为其中，R1、R2独立地为C1-C6烷基或氢；或者R1、R2与相邻的碳原子共同形成C6-C10芳基。
在另一优选例中，R1为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，R2为氢。
在另一优选例中，采用以下步骤合成式II化合物：
1-(氯甲基)萘与甲胺反应得到式II化合物：N-甲基-萘-1-甲胺。
在另一优选例中，采用以下步骤合成式III化合物：
(i)式V化合物经还原反应得到式IV化合物；
(ii)式IV化合物经卤代反应得到式III化合物。
在另一优选例中，盐酸萘替芬(1)和其衍生物(2)、(3)、(4)这四种化合物的制备方法包括以下步骤：
式中，Ar为苯基(1)，4-甲苯基(2)，4-叔丁苯基(3)和萘-2基(4)。
1)将甲胺的水溶液溶于四氢呋喃中，然后向反应体系中缓慢滴加1-(氯甲基)萘的四氢呋喃溶液，20～30℃反应10～20小时。反应结束后，浓缩，柱层析分离得到中间体N-甲基-萘-1-甲胺(中间体II)。
2)将(E)-3-Ar-丙烯醛(V)溶于甲醇中，冰浴下分批加入硼氢化钠，20～30℃反应10～30分钟。浓缩，残余物中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得中间体(E)-3-Ar-丙烯醇(中间体IV)。
3)将中间体IV溶于无水乙醚中，氮气保护冰浴下，加入三溴化磷，20～30℃反应10～20小时。反应结束后，将反应体系倒入冰的饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，30℃浓缩得中间体(E)-1-Ar-3-溴-丙烯(中间体III)。
4)将中间体II，中间体III，碳酸钾加入到N,N-二甲基甲酰胺中，20～30℃反应10～20小时。反应结束后，向反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经柱层析分离，得到化合物(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-Ar-丙-2-烯-1-胺(I)。
5)将(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-Ar-丙-2-烯-1-胺I加入到乙酸乙酯中，通入自制的氯化氢气体1～5分钟，减压蒸除溶剂，向残余物加入1/100的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，析出固体，抽滤，洗涤，得到化合物(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-Ar-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(1-4)。
应用
本发明的式I化合物，可以用于制备抗菌药物；用于制备催化酶CrtN抑制剂；或用于制备抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素合成的药物。
所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物，本发明的式I化合物，能够降低金黄色葡萄球菌的致病力。
所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌感染的药物。
所述抗金黄色葡萄球菌为抗甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Newman)或抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(Mu50)。
在另一优选例中，通过抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素的合成抗金黄色葡萄球菌。
药物组合物
本发明提供抗菌药物组合物、抑制催化酶CrtN的药物组合物或抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素合成的药物组合物。
本发明的药物组合物，包含式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分；以及
药学上可接受的载体。
通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
在另一优选例中，本发明式I化合物可与大分子化合物或高分子通过非键合作用形成复合物。在另一优选例中，本发明式I化合物作为小分子还可通过化学键与大分子化合物或高分子相连接。所述大分子化合物可以是生物大分子如高聚糖、蛋白、核酸、多肽等。
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明提供了具有新型结构的盐酸萘替芬衍生物。
(2)本发明提供了盐酸萘替芬和其衍生物的制备方法，工艺简单高效。
(3)本发明首次发现了盐酸萘替芬和其衍生物的新用途，可以用于制备抗菌药物，特别是用于制备抗金黄色葡萄球菌的药物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1N-甲基-萘-1-甲胺(中间体II)
将10毫升20％甲胺的水溶液溶于20毫升四氢呋喃中，然后向反应体系中缓慢滴加3克1-(氯甲基)萘的10毫升四氢呋喃溶液，室温反应过夜。反应结束后，浓缩，柱层析得到标题化合物(中间体II)，2.2克黄色油状物，收率75％。
1H-NMR(400MHz,丙酮)δ8.23(d,J＝7.9Hz,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,1H),7.48(ddd,J＝22.4,14.0,7.1Hz,4H),4.17(s,2H),2.46(s,3H).
实施例2(E)-3-(4-甲苯基)-丙-2-烯-1-醇(中间体IV-1)的制备。
将100毫克(E)-3-(4-甲苯基)-丙烯醛溶于10毫升甲醇中，冰浴下分批加入26毫克硼氢化钠，室温反应15分钟。浓缩，残余物中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得99毫克油状标题化合物，收率98％。直接投下一步反应。
实施例3(E)-1-(4-甲苯基)-3-溴-丙烯(中间体III-1)的制备
将370毫克中间体IV-1溶于20毫升无水乙醚中，氮气保护冰浴下，加入85微升三溴化磷，室温反应过夜。反应结束后，将反应体系倒入冰的饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，30℃浓缩得标题化合物，395毫克白色固体，收率85％。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(t,J＝7.4Hz,2H),7.13(d,J＝7.4Hz,2H),6.61(d,J＝15.6Hz,1H),6.34(dt,J＝15.6,7.8Hz,1H),4.16(d,J＝7.7Hz,2H),2.34(s,3H).
实施例4
(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-(4-甲苯基)-丙-2-烯-1-胺(化合物I-1)和(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-(4-甲苯基)-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(2)的制备
将100毫克中间体II，105毫克中间体III-1，83毫克碳酸钾加入到10毫升N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应过夜。反应结束后，向反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经柱层析分离，得到标题化合物I-1，109毫克无色油状物，收率73％。
为了将其纯化，将化合物I-1进溶于1毫升乙酸乙酯中，通入1分钟氯化氢气体，将其做成盐酸盐，蒸干溶剂，加入1比100的石油醚乙酸乙酯混合溶剂，析出白色盐酸盐固体，抽滤，洗涤，得化合物2。1H-NMR为其盐酸盐形式数据。
1H-NMR(400MHz,MeOD)δ8.20(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝6.3Hz,1H),7.73–7.59(m,3H),7.43(d,J＝8.1Hz,2H),7.23(d,J＝8.0Hz,2H),6.95(d,J＝15.8Hz,1H),6.37(dt,J＝15.5,7.5Hz,1H),5.08(d,J＝13.6Hz,1H),4.74(d,J＝13.6Hz,1H),4.10(ddd,J＝36.9,13.3,7.8Hz,2H),2.87(s,3H),2.37(s,3H).；MS(ESI)m/z302.0[M+H]+。
实施例5
(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-(4-叔丁苯基)-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(3)的制备
除了将(E)-3-(4-甲苯基)-丙烯醛换成(E)-3-(4-叔丁苯基)-丙烯醛之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得到113毫克白色固体盐酸盐(化合物3)，收率是79％。
1H-NMR(400MHz,MeOD)δ8.20(d,J＝8.5Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.79(d,J＝6.2Hz,1H),7.74–7.59(m,3H),7.52–7.42(m,4H),6.96(d,J＝15.8Hz,1H),6.39(dt,J＝15.4,7.5Hz,1H),5.08(d,J＝13.6Hz,1H),4.74(d,J＝13.5Hz,1H),4.11(ddd,J＝36.6,13.3,7.8Hz,2H),2.88(s,3H),1.35(s,9H).；MS(ESI)m/z344.1[M+H]+。
实施例6
(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-(萘-2-基)-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(4)的制备
除了将(E)-3-(4-甲苯基)-丙烯醛换成(E)-3-(萘-2-基)-丙烯醛外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得到109毫克白色固体盐酸盐标题化合物4，收率是76％。
1H-NMR(400MHz,MeOD)δ8.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),7.96–7.85(m,4H),7.82(d,J＝6.9Hz,1H),7.76(dd,J＝8.6,1.3Hz,1H),7.71(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),7.64(t,J＝7.6Hz,2H),7.58–7.44(m,2H),7.15(d,J＝15.8Hz,1H),6.67–6.40(m,1H),5.12(d,J＝13.6Hz,1H),4.80(d,J＝13.6Hz,1H),4.19(ddd,J＝35.3,13.2,7.6Hz,2H),2.92(s,3H).；MS(ESI)m/z338.0[M+H]+。
实施例7(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-苯基-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(1)的制备
除了将(E)-3-(4-甲苯基)-丙烯醛换成(E)-3-苯基-丙烯醛外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得到122毫克白色固体盐酸盐标题化合物，收率是80％。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(d,J＝8.3Hz,1H),7.81(t,J＝8.5Hz,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.57–7.34(m,6H),7.29(t,J＝7.5Hz,2H),7.19(dd,J＝13.1,6.0Hz,1H),6.56(d,J＝15.9Hz,1H),6.45–6.28(m,1H),3.92(s,2H),3.26(d,J＝6.6Hz,2H),2.26(s,3H).；MS(ESI)m/z288.0[M+H]+。
实施例8化合物1-化合物4抑制金黄色色素合成活性初步筛选实验
实验用菌株：新鲜活化的金黄色葡萄球菌Newman野生株(Staphylococcus aureus subsp.aureus str.Newman，参见“Duthie,E.S.,and L.L.Lorenz.1952.Staphylococcal coagulase:mode of action and antigenicity.J.Gen.Microbiol.6:95-107”)及其同源的crtN插入突变株(无金黄色色素合成)(参见Lan,L.F.,Cheng,A.,Dunman,P.M.,Missiakas,D.,He,C..GoldenPigment Production and Virulence Gene Expression Are Affected by Metabolisms inStaphylococcus aureus.J.Bacteriol.2010,192(12):3068.)。
实验用培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone Soy broth，TSB),英国Oxid公司产品，加单蒸水配制，121℃，15分钟灭菌后，备用。
初筛实验方法：
(1)化合物的配制：将本发明化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配置成浓度为10mM的母液。取100μL母液加400μL的DMSO稀释至浓度为2mM，混匀后取250μL(2mM)溶液继续加等量DMSO进行2倍稀释，直至溶液浓度为0.0625mM，待用。
(2)菌株的培养：从TSA平板上挑取Newman菌株单克隆至装用4mL无菌TSB培养基的试管中，37℃，250rpm培养12小时后，备用。
(3)化合物1-化合物4抑制金黄色葡萄球菌中金黄色色素合成能力的初筛：取无菌试管，向每支试管中加入新鲜灭菌的TSB培养基3980μL。随后，向试管中分别加入20μL已配制好的浓度为10mM，2mM，1mM，0.5mM，0.25mM，0.125mM，0.0625mM的化合物溶液，使本发明化合物终浓度分别为50μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM。同时，向另一支试管中，加入20μL的DMSO溶液(终浓度为0.5％)，作为无化合物的阴性对照。向每支试管中，分别加入40μL培养12小时的菌液(接种量：培养基＝1：100)，并于37℃，250rpm培养24小时后，取出菌液1.5mL，14000g离心2分钟后，去上清，观察菌株在加入特定浓度的本发明化合物后，合成的金黄色色素与阴性对照相比是否有明显减少。
化合物1-化合物4抑制金黄色色素合成活性初步筛选实验结果如图1-4所示。其中，图1为本发明化合物1抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物1的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0μM；图2为本发明化合物2抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物2的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM；图3为本发明化合物3抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物3的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM；图4为本发明化合物4抑制金黄色色素合成图、从左至右化合物4的浓度依次为50μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM。
结果表明：在培养基中添加本发明化合物1，使其终浓度为50μM、10μM及5μM条件下，可完全抑制金黄色色素的合成，在浓度为2.5μM及以下，金黄色色素的合成随化合物1浓度的减少而增加，表明化合物1对金黄色色素的合成具有显著的浓度依赖性。化合物2，化合物3和化合物4在化合物1的基础上经过修饰和改造后，抑制金黄色色素合成的能力显著增加。其中，化合物2和化合物4在本实验最低浓度下(0.3125μM)仍可完全抑制色素的产生；化合物3在本实验最低浓度下(0.3125μM)，合成的金黄色色素较同等浓度的化合物1有明显的减少，表明化合物2，化合物3和化合物4的活性较化合物1有显著提高。
实施例9化合物1-化合物4抑制金黄色色素合成活性的IC50测定实验
化合物浓度的选择：根据初筛结果，确定各个化合物抑制金黄色色素合成的能力。对于有较强活性的化合物，如其在初筛最低浓度时仍可强烈抑制色素的产生，则可按初筛类似方法继续实验，直至化合物基本不能抑制金黄色色素的产生。根据实验结果，针对每个化合物设计11个不同的浓度梯度，使其抑制色素合成的能力基本包含0％～100％。
菌株的培养：从TSA平板上挑取Newman菌株及crtN突变株单克隆至装用4mL无菌TSB培养基的试管中，37℃，250rpm培养12小时后，备用。
IC50的测定：取无菌试管，向每支试管中加入新鲜灭菌的TSB培养基3980μL。随后，向试管中分别加入20μL已配制好的11个浓度梯度的本发明化合物。同时，向另两支试管中，分别加入20μL的DMSO溶液(终浓度0.5％)，作为无化合物的对照。向加入20μL DMSO溶液的两支试管中分别加入40μL培养12小时的Newman(阴性对照，无化合物加入)和crtN突变株(阳性对照，无色素产生)。其余加入化合物的试管中分别加入40μL培养12小时的Newman菌株。所有试管于37℃，250rpm培养12小时后换至30℃，250rpm继续培养36小时以增加色素的积累。完成培养后，取3mL菌液于2mL EP管中，14000g离心2分钟后，去上清，用PBS缓冲液洗涤两次(每次1mL)后，加入300μL甲醇溶液，蜗旋混匀后于55℃水浴锅中加热3分钟提取色素。随后14000g离心2分钟，吸取甲醇提取液于1.5mL EP管，再加入等量甲醇溶液，重复提取两次，合并三次提取的色素。以crtN突变体中的甲醇提取液为空白对照，测定450nm波长下各样品的吸光度值，并测定无化合物阴性对照的吸光度值。
本发明化合物在各浓度下，色素合成的相对水平＝A450nm(样品)/A450nm(阴性对照)*100％。
以化合物的摩尔浓度为横座标，以色素合成的相对水平为纵座标(即A450(样品)/A450(阴性对照)*100％)，在Graphpad prism5.0软件中进行抑制剂浓度-合成色素水平(log(inhibitor)vs response)的曲线拟合，并由软件根据拟合结果计算化合物抑制色素合成的IC50。
表1化合物(1-4)对金黄色色素合成的抑制活性数据(IC50，nM)
化合物1-化合物4抑制金黄色色素合成的量效关系曲线如图5-图8所示。根据测量结果拟合出的抑制剂浓度-色素合成水平曲线，其相关系数(R2)分别为0.9939、0.9854、0.9844和0.9889，表明抑制剂的浓度与色素合成水平具有较高的相关性。从实验结果来看，四种化合物对抑制金黄色色素合成有较强活性，以95％这一数值作为置信区间，得出的IC50范围分别为：化合物1：558.6nM-958.2nM；化合物2：30.33nM-65.73nM；化合物3：110.7nM-272.4nM；化合物4：35.16nM-74.23nM。
活性数据如表1所示，根据实验结果，软件给出的参考半数有效抑制浓度IC50分别为731.6nM、44.7nM、173.7nM和51.1nM。化合物1的IC50分别是化合物2，化合物3和化合物4的16.4倍、4.2倍及14.2倍。
实施例10验证本发明化合物1抑制金黄色色素合成是通过抑制crtN基因功能
色素及其中间代谢产物的提取：过夜培养的野生型菌株(Newman)、crtM基因突变菌株(crtM，参见Lan,L.F.,Cheng,A.,Dunman,P.M.,Missiakas,D.,He,C..Golden PigmentProduction and Virulence Gene Expression Are Affected by Metabolisms in Staphylococcusaureus.J.Bacteriol.2010,192(12):3068.)、crtN基因突变菌株(crtN-，参见Lan,L.F.,Cheng,A.,Dunman,P.M.,Missiakas,D.,He,C..Golden Pigment Production and Virulence GeneExpression Are Affected by Metabolisms in Staphylococcus aureus.J.Bacteriol.2010,192(12):3068.)、crtN基因突变体的互补菌株(crtN-/crtN)按1：100(菌液：培养基)的比例分别转接至50ml新鲜无菌的TSB或含化合物1(10μM)的TSB培养基中，37℃,250rpm条件下培养24小时后，8000g,4min离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤两次。向菌体中加入20ml丙酮液，涡旋混匀以提取色素及其中间产物，而后向提取液中加入10ml正己烷及10mlNaCl(10％，质量/体积)溶液，并剧烈振荡以除去提取液中的油脂成分，而后收集含色素及其中间产物的己烷层，并再加入10ml正己烷，重复该提取过程一次。合并两次的己烷提取液，并加入无水MgSO4进行干燥，样品在旋转蒸发仪上浓缩后加入500μl色谱纯的乙腈-异丙醇(85：15)的溶剂溶解样品，并用0.45μm的膜进行过滤以除去杂质。采用HPLC进行检测。
所用的crtN基因突变体的互补菌体(crtN-/crtN)的构建方法如下：首先是互补质粒pYJ335::crtN的构建(详细构建过程请参看实施例12)。所不同的是，质料经过测序验证，确定无碱基缺失和突变后，需电转至crtN基因突变体中，最终获得crtN基因突变体的互补菌株(crtN-/pYJ335::crtN)。
HPLC实验条件：色谱柱：Spherisorb ODS2色谱柱(250*4.6mm；5μm粒径；Waters)；流动相：乙腈-异丙醇(85：15，体积/体积)；流速：1ml/min；进样量：50μl；液相色谱仪：安捷伦1260infinity(含二极管阵列检测器)，检测波长：286nm。
利用HPLC的方法分析了5个样品中金黄色色素合成途径的代谢产物(培养24小时分析结果)。5个样品分别是：野生型菌株(Newman)、crtM基因突变菌株(crtM-)、crtN基因突变菌株(crtN-)、crtN基因突变体的互补菌株(crtN-/crtN)及含化合物1(10μM)培养条件下生长的野生型菌株(Newman+1)的色素中间代谢产物。
结果显示(图9)含化合物1(10μM)培养条件下生长的野生型菌株中金黄色色素合成途径代谢产物的HPLC谱与crtN基因突变体(crtN-)的HPLC谱极为相似。crtN基因的突变和化合物1的加入都分别导致保留时间为10.8分钟和11.4分钟代谢产物(检测波长为286nm)的出现。功能互补(crtN-/crtN)实验进一步证实这两个代谢产物与crtN的功能有关。由此推测这两个代谢产物可能是CrtM的催化产物，因CrtN的功能受到抑制从而大量积累。
实施例11
验证本发明化合物1抑制金黄色色素合成是通过抑制crtN基因功能
在大肠杆菌(E.coli)里分别过表达crtM和crtMN，利用HPLC的方法分析代谢物变化情况，其中，蛋白表达载体pet28a和大肠杆菌E.coli(DE3)购自invitrogen公司。
pet28a::crtM/E.coli(DE3)、pet28a::crtMN/E.coli(DE3)构建过程如下：
质粒的构建：
根据NCBI中野生型菌株Newman的基因组序列，设计引物分别将crtM基因和crtMN基因克隆至pet28a载体上，构建pet28a::crtM和pet28a::crtMN。
引物(由上海捷锐生物工程有限公司合成)序列如下：
pet28a-crtM-F(Bam HI):CGCGGATCCATGACAATGATGGATATGAATTTTAA(5’-3’)；
pet28a-crtM-R(Xho I):CCGCTCGAGCTATATTCTATGATATTTACTATTT(5’-3’)；
pet28a-crtMN-F(Bam HI):CGCGGATCCATGACAATGATGGATATGAATTTTAA(5’-3’)；
pet28a-crtMN-R(Xho I):CCGCTCGAGTTATACGCCCCGCTCAATATCTTTA(5’-3’)。
下划线部分分别为Bam HI和Xho I的酶切位点。
质粒的构建及验证：以Newman基因组DNA为模板，以pet28a-crtM-F/R和pet28a-crtMN-F/R为引物，采用PCR的方法分别扩增crtM和crtMN基因片断。PCR反应按PrimeSTARHS DNA Polymerase说明书(宝生物工程(大连)有限公司)进行。特异性扩增的基因片断经1％琼脂糖凝胶电泳确认后，用PCR产物纯化试剂盒(Omega)对PCR产物进行回收。分别取2μg回收后的PCR产物(crtM和crtMN)和2μg pet28a载体，各自在50μl体系中进行Bam HI和Xho I的双酶切反应，反应条件按New England biolabs公司推荐条件进行。酶切反应后，选择pet28a载体进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，同时以未经酶切的pet28a载体作为对照，确认酶切的顺利完成。将酶切后的PCR产物及pet28a载体用试剂盒(Omega)进行纯化，取纯化后的PCR产物及pet28a载体按摩尔比(8:1～10:1)加入总体积为10μl的连接体系中(含T4DNA连接酶)，16℃过夜连接。采用42℃下热击法将连接产物连同pet28a空载体分别转化进入E.coli(DE3)感受态细胞中，经复苏后，涂于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体平板上，并于37℃培养箱中过夜培养，以获得pet28a/E.coli(DE3)、pet28a::crtM/E.coli(DE3)、pet28a::crtMN/E.coli(DE3)的单克隆。挑取卡那霉素(50μg/ml)LB固体平板上生出的单克隆进行划线培养以扩增菌体量，而后挑取少量菌体进行PCR菌落验证，所用引物为质粒构建时所用引物。将PCR验证结果为阳性的克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序确证。
色素及其中间代谢产物的提取：过夜培养的pet28a/E.coli(DE3)、pet28a::crtM/E.coli(DE3)、pet28a::crtMN/E.coli(DE3)按1：100(菌液：培养基)的比例分别转接至50ml新鲜无菌的LB+卡那霉素kanamycin(终浓度：50μg/ml)培养基中，37℃,250rpm条件下培养24小时后，8000g,4min离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤两次。向菌体中加入20ml丙酮液，涡旋混匀以提取色素及其中间产物，而后向提取液中加入10ml正己烷及10ml NaCl(10％，质量/体积)溶液，并剧烈振荡以除去提取液中的油脂成分，而后收集含色素及其中间产物的己烷层，并再加入10ml正己烷，重复该提取过程一次。合并两次的己烷提取液，并加入无水MgSO4进行干燥，样品在旋转蒸发仪上浓缩后加入500μl色谱纯的乙腈-异丙醇(85：15)的溶剂溶解样品，并用0.45μm的膜进行过滤以除去杂质。采用HPLC进行检测。HPLC实验条件：色谱柱：Spherisorb ODS2色谱柱(250*4.6mm；5μm粒径；Waters)；流动相：乙腈-异丙醇(85：15，体积/体积)；流速：1ml/min；进样量：50μl；液相色谱仪：安捷伦1260infinity(含二极管阵列检测器)，检测波长：286nm,440nm。
结果(图10)显示，在过表达crtM的大肠杆菌的代谢物里明显出现了保留时间为10.7分钟和11.3分钟的代谢产物，与实施例10推测的这两个代谢物可能是CrtM的合成产物相吻合。在过表达crtMN的大肠杆菌的代谢物里，这两个保留时间为10.7分钟和11.3分钟的代谢产物与过表达crtM的大肠杆菌相比，明显减少。然而，急剧出现了保留时间为6.2分钟(检测波长为440nm)的代谢产物。这些结果暗示了在过表达crtMN的大肠杆菌中，CrtM的产物(保留时间为10.7分钟和11.3分钟，检测波长286nm)被CrtN进一步合成为保留时间为6.2分钟(检测波长为440nm)的代谢产物。
实施例12
验证本发明化合物1抑制金黄色色素合成是通过抑制crtN基因功能
在金黄色葡萄球菌中分析过表达crtN是否可消减化合物1对金黄色色素产生的抑制作用。
(1)crtN基因过表达菌株和ispA基因过表达菌株的构建：
根据NCBI中野生型菌株Newman的基因组序列，设计引物分别将crtN基因和ispA基因克隆至大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体pYJ335(参见Ji,Y.,A.Marra,M.Rosenberg,and G.Woodnutt.1999.Regulated antisense RNA eliminates alpha-toxin virulence inStaphylococcus aureus infection.J.Bacteriol.181:6585–6590.)上，构建pYJ335::crtN和pYJ335::ispA。
引物(由上海捷锐生物工程有限公司合成)序列如下：
pYJ335-ispA-F：AAAGAAGAAGCTGAGGATGTAAAAA(5’-3’)；
pYJ335-ispA-R：TTGCTTTTAGTGATCCCTGCTA(5’-3’)；
pYJ335-crtN-F：TAAATATCATAGAATATAGGTGGTTG(5’-3’)；
pYJ335-crtN-R：CCCTTATACTTTTCTCACATCT(5’-3’)。
质粒的构建及验证：以Newman基因组DNA为模板，以pYJ335-ispA-F/R和pYJ335-crtN-F/R为引物，采用PCR的方法分别扩增ispA和crtN基因片断。PCR反应按PrimeSTARHSDNA Polymerase说明书(宝生物工程(大连)有限公司)进行。特异性扩增的基因片断经1％琼脂糖凝胶电泳确认后，用PCR产物纯化试剂盒(Omega)对PCR产物进行回收。取2μg pYJ335载体，在50μl体系中进行EcoR V的单酶切反应，反应条件按New England biolabs公司推荐条件进行。酶切反应后，选择pYJ335载体进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，同时以未经酶切的pYJ335载体作为对照，确认酶切的顺利完成。将PCR产物及酶切后的pYJ335载体用试剂盒(Omega)进行纯化，取纯化后的PCR产物及pYJ335载体按摩尔比(8:1～10:1)加入总体积为10μl的连接体系中(含T4DNA连接酶)，16℃过夜连接。采用42℃下热击法将连接产物连同pYJ335空载体分别转化进入E.coli(DH5α)感受态细胞中，经复苏后，涂于含有羧苄青霉素(100μg/ml)的LB固体平板上，并于37℃培养箱中过夜培养，以获得pYJ335/E.coli(DH5α)、pYJ335::ispA/E.coli(DH5α)、pYJ335::crtN/E.coli(DH5α)的单克隆。挑取含羧苄青霉素(100μg/ml)的LB固体平板上生出的单克隆进行划线培养以扩增菌体量，而后挑取少量菌体进行PCR菌落验证，所用引物为pYJ335载体通用引物：pYJ335-universal-F:CAATACAATGTAGGCTGCTCTACAC(5’-3’)与质粒构建时所用的反向引物(pYJ335-ispA-R或pYJ335-crtN-R)，以确保基因连接的方向正确。将PCR验证结果为阳性的克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序确证。
所构建的克隆经热击转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取羧苄青霉素抗性平板上(100μg/ml)的单克隆进行过夜培养并提取其中的质粒，质料经过测序验证，确定无碱基缺失和突变后，电转至金黄色葡萄球菌Newman中，最终获得crtN基因过表达菌株(Newman/pYJ335::crtN)和ispA基因过表达菌株(Newman/pYJ335::ispA)，同时将pYJ335空载体电转至Newman菌株(Newman/pYJ335)中，作为阴性对照。
(2)菌株的培养及色素的观察：从TSA平板上挑取Newman菌株(含pYJ335空载体)，crtN基因过表达菌株及ispA基因过表达菌株单克隆至装用4mL无菌TSB培养基(含终浓度均为10μg/ml的红霉素和氯霉素)的试管中，37℃，250rpm培养12小时后，备用。
(3)取无菌试管7支，向每支试管中加入新鲜灭菌的TSB培养基(含终浓度均为10μg/ml的红霉素和氯霉素)3980μL。随后，向试管中分别加入20μL已配制好的浓度为2mM及0.2mM的化合物溶液，使本发明化合物终浓度分别为10μM和1μM(各两管)。同时，向另三支试管中，加入20μL的DMSO溶液(终浓度为0.5％)，使化合物的浓度为0μM。向不同浓度化合物的试管中，分别加入40μL培养12小时的crtN基因过表达菌液及ispA基因过表达菌液(接种量：培养基＝1：100)(各三支)，并于剩余一支试管中加入含pYJ335空载体的Newman菌液。所有试管于37℃，250rpm培养24小时后，取出菌液1.5mL，14000g离心2分钟后，去上清，观察菌株在加入特定浓度的本发明化合物后，合成的金黄色色素的能力与对照相比是否有明显变化。
如图11所示，化合物1(10μM)不能有效地抑制crtN过表达菌株中金黄色色素的产生。但在相同浓度的条件下，化合物1(10μM)能有效地抑制ispA(编码位于CrtN上游的另一负责金黄色色素合成的酶-牻牛儿基转移酶)过表达菌株中金黄色色素的产生。进一步证明化合物1通过抑制CrtN蛋白的活性来抑制金黄色色素的产生。
实施例13
验证本发明化合物1抑制金黄色色素合成是通过抑制crtN基因功能
通过镍柱亲和层析和脱盐纯化，可从pet28a::crtN/E.coli(DE3)中获得CrtN纯蛋白。
(1)pet28a::crtN/E.coli(DE3)的构建及培养：
根据NCBI中野生型菌株Newman的基因组序列，设计引物将crtN基因克隆至蛋白表达载体pet28a上，构建pet28a::crtN，参考实施例11中pet28a::crtM/E.coli(DE3)和pet28a::crtMN/E.coli(DE3)的构建实验步骤与条件及验证进行pet28a::crtN的构建。
引物(由上海捷锐生物工程有限公司合成)序列如下：
pet28a-crtN-F(Bam HI):CGCGGATCCATGAAGATTGCAGTAATTGGTGCAG；
pet28a-crtN-R(Xho I):CCGCTCGAGTTATACGCCCCGCTCAATATCTTTA，
下划线部分分别为Bam HI和Xho I的酶切位点。
所构建的克隆经热击转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取卡那霉素抗性平板上(50μg/ml)的单克隆进行过夜培养并提取其中的质粒，质料经过测序验证，确定无碱基缺失和突变后，再转化至蛋白表达菌株E.coli(DE3)中，得到pet28a::crtN/E.coli(DE3)。挑取pet28a::crtN/E.coli(DE3)单克隆至10ml LB培养基中(含终浓度为50μg/ml的卡那霉素)，37℃，250rpm过夜培养后，转接至1L LB培养基中(含同等浓度的卡那霉素)，37℃培养约3小时至OD为0.5左右，将温度降为16℃，加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，终浓度为1mM)诱导蛋白表达16h后，离心收集含蛋白的菌体。
(2)CrtN蛋白的纯化：
所用缓冲液buffer:
Buffer A:50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM DTT,50mM咪唑,pH8.0
Buffer B:50mM Tris-HCl,200mM NaCl,500mM咪唑,2mM DTT,pH8.0
裂解buffer:buffer A+5％甘油
以下操作均在4℃或冰上进行。收集的1L菌体加30ml裂解buffer，于超声破碎仪上破碎30分钟后，25000g，离心25分钟，取上清。并用蠕动泵将含有CrtN蛋白的上清泵至预装好的镍亲和层析柱中(5*5ml,HistrapTMHP,GE公司)。将完成上样的镍柱接至AKTA蛋白纯化系统中，进行纯化。纯化条件：bufferA平衡5-6个柱体积后，线性梯度洗脱(100％buffer A,0％buffer B至0％buffer A,100％buffer B)，流速3ml/min，总洗脱时间约为45分钟，检测波长280nm。收集洗脱出的CrtN蛋白2ml，直接进行脱盐纯化(desalting)，脱盐层析柱(100*5ml,Histrap desalting,GE公司)，脱盐buffer为不含咪唑的buffer A。纯化条件：脱盐buffer平衡5-6个柱体积后，进行脱盐纯化，流速1.5ml/min，检测波长280nm。收集脱盐纯化后的蛋白备酶切反应使用。
酶切反应条件如下：反应缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠(50mM)，氯化钠(150mM)，二硫苏糖醇(2.0mM)，pH5.5。蛋白CrtN浓度为0.337mg/ml，约5.95μM。嗜热蛋白酶(Thermolysin):CrtN＝1:600(m/m)，室温，酶切30分钟。
图12为CrtN蛋白(大小:56.7Kd)被嗜热菌蛋白酶酶切后的考马斯亮蓝染色结果图。其中，M：蛋白Marker；a：CrtN对照(不加化合物1和thermolysin)；b：化合物1:CrtN＝672:1(m/m)；c：化合物1:CrtN＝336:1(m/m)；d：化合物1:CrtN＝168:1(m/m)；e：化合物1:CrtN＝84:1(m/m)；f：化合物1:CrtN＝42:1(m/m)；g：CrtN对照(不加化合物1，加thermolysin)。b～g中化合物1的终浓度依次为：4mM，2mM，1mM，0.5mM，0.25mM，0mM。由对CrtN纯蛋白进行嗜热蛋白酶(Thermolysin)的酶切分析结果表明：化合物1可保护CrtN蛋白被嗜热蛋白酶thermolysin酶切降解，表明化合物1与CrtN结合后，保护了CrtN中的酶切位点，从而直接证明了化合物1与CrtN蛋白的相互作用。
采用实施例10-13的方法对化合物2、化合物3、化合物4进行验证，结果表明，化合物2、化合物3、化合物4也通过抑制crtN基因的功能抑制金黄色色素合成。
实施例14crtN基因的突变导致金黄色葡萄球菌致病能力的显著下降
实验用SPF级小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司购买，无菌条件下饲养。在小鼠皮下感染实验中，10-14周龄的雌性CD-1小鼠被随机分成两组，每组10只。所有小鼠在感染前两天用电推剪剪去后背两侧的毛发。
过夜培养的金黄色葡萄球菌(Newman)菌株及其crtN突变株被转移至新鲜无菌胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone Soy broth，TSB)中，持续培养3小时至指数生长期。用PBS缓冲液洗涤两次后，悬浮在PBS中备用。
小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉，然后分别于去毛的两侧后背皮下注射约1×108CFU的Newman菌株及其crtN突变株，以感染小鼠。感染5天后，小鼠通过吸入CO2被处死。小鼠皮下脓肿的区域被取出，均匀匀浆在1mL的无菌PBS缓冲液(含0.01％tritonX-100)。匀浆液被连续稀释，取10μL稀释液滴至TSA平板上，测算细菌CFU计数。细菌在皮下的定植数目通过匀浆液中细菌CFU计数来定量。
在小鼠皮下感染模型中，crtN基因突变的金黄色葡萄球菌菌株的致病能力显著下降(图13)。野生型的金黄色葡萄球菌(Newman)可引起皮下脓肿，而crtN基因的突变体丧失了引起皮下脓肿的能力(图13A)。细菌计数的实验结果表明，由于crtN基因的突变，细菌在小鼠体内的存活能力下降1000倍左右(图13B)。这些结果说明金黄色葡萄球菌金黄色色素合成途径中关键催化酶CrtN可作为抗菌药物作用靶点。
实施例15化合物1(盐酸萘替芬)抗金黄色葡萄球菌
实验用SPF级小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司购买，无菌条件下饲养。过夜培养的金黄色葡萄球菌(Newman)菌株被转移至新鲜无菌胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone Soybroth，TSB)中，持续培养3小时至指数生长期。用PBS缓冲液洗涤两次后，悬浮在PBS中备用。在系统性小鼠感染实验中，6-8周龄的雌性BALB/c小鼠被随机分成两组，每组15只。所有小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉，然后眶后注射约1.5×106CFU的Newman菌株感染小鼠。对于化合物1(盐酸萘替芬)治疗组，小鼠每次腹腔注射16mg/kg的化合物1，第一次在细菌感染前12小时，感染后的4天内共注射8次(每天2次，共9次)。实验结束后，小鼠通过吸入CO2被处死。小鼠的心脏、肾脏和肝脏被取出，均匀破碎在1mL的无菌PBS缓冲液(含0.01％tritonX-100)。破碎液被连续稀释，取10μL稀释液滴至TSA平板上，测算细菌CFU计数。细菌在不同器官的定植程度通过不同器官的破碎液中细菌CFU计数来定量。实验结果(图14)表明，化合物1(盐酸萘替芬)可显著地降低金黄色葡萄球菌(Newman)在小鼠肾脏、心脏、以及肝脏中的定植，显示出强效的抗金黄色葡萄球菌药效。
实施例16crtN基因的突变导致金黄色葡萄球菌致病能力的显著下降
所有的实验方法和材料同实施例15，除了将1.5×106CFU的Newman菌株分别替换成3×106CFU的Newman菌株和3×106CFU的crtN突变株，另外每组小鼠由15只减少至12只，同时两组小鼠均不给予化合物治疗。
在动物感染系统实验中，crtN基因突变的金黄色葡萄球菌菌株对小鼠的致病能力明显下降。与野生型菌株(Newman)相比，在感染相同剂量的金黄色葡萄球菌条件下，从crtN突变菌株感染的小鼠肾脏和心脏中分离出的细菌数量明显少于野生型菌株(图15A)。肉眼观察小鼠肾脏上的细菌定植程度，可以明显看出，大量的野生型菌株(Newman)在小鼠肾脏上定植(图15B)，然而crtN突变菌株观察不到明显的肾脏上定植(图15C)。这些结果说明金黄色葡萄球菌金黄色色素合成途径中关键催化酶CrtN是影响细菌致病性的关键毒力因子，可作为抗菌药物作用靶点。
实施例17化合物1(盐酸萘替芬)抗金黄色葡萄球菌
所有的实验方法和材料同实施例15，除了将1.5×106CFU的Newman菌株替换成1.5×107CFU的Mu50菌株(甲氧西林耐药、万古霉素中度耐药，购自美国耐药性金黄色葡萄球菌库(Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus,NARSA)，另外每组小鼠由15只减少至13只。
实验结果(图16A)表明，化合物1(盐酸萘替芬)可显著地降低耐药性金黄色葡萄球菌Mu50在小鼠心脏、以及肝脏中的定植。肉眼观察小鼠肝脏上的细菌定植程度，可以明显看出，大量的耐药性金黄色葡萄球菌Mu50在不加化合物1的小鼠肝脏上定植(图16B)，然而加化合物1的小鼠肝脏上观察不到明显的细菌定植(图16C)。表明化合物1具有强效的抗耐药金黄色葡萄球菌药效。
实施例18化合物1(盐酸萘替芬)抗金黄色葡萄球菌
所有的实验方法和材料类似于实施例15，除了将1.5×106CFU的Newman菌株替换成1.5×107CFU的Newman菌株。对于化合物1(盐酸萘替芬)治疗组，小鼠每次腹腔注射16mg/kg的化合物1，第一次在细菌感染前12小时，感染后的6天内共注射12次(每天2次，共13次)。对于盐酸万古霉素(阳性对照)治疗组，小鼠每次腹腔注射25mg/kg的盐酸万古霉素，第一次在细菌感染前12小时，感染后的6天内共注射12次(每天2次，共13次)。对于阴性对照组(无化合物治疗组)，小鼠每次腹腔注射100μl无菌生理盐水，第一次在细菌感染前12小时，感染后的6天内共注射12次(每天2次，共13次)。每天记录感染后小鼠的死亡数，第12天结束记录，绘制12天内的存活曲线图。
实验结果(图17)表明，1.5×107CFU的Newman菌株为致死剂量，在不加药的小鼠组，所有小鼠在感染1天内死亡。针对致死剂量的金黄色葡萄球菌(Newman)的感染，尽管药效略差于阳性对照盐酸万古霉素(12天内保护率＝100％)，化合物1(盐酸萘替芬)可显著延长小鼠的存活时间(12天内保护率>70％)。表明化合物1具有强效的抗金黄色葡萄球菌药效。
采用实施例15、实施例17和实施例18的方法对对化合物2、化合物3、化合物4进行检验，结果表明，化合物2、化合物3、化合物4也显示出强效的抗金黄色葡萄球菌药效。
由实施例8-18可以看出，本发明的四个化合物盐酸萘替芬(1)及其衍生物(2)、(3)、(4)在体外能够强效抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素的合成，其抑制金黄色色素合成的机制在于抑制金黄色色素合成通路中的关键催化酶CrtN。在小鼠皮下和系统感染模型中，发现crtN基因的突变体的致病能力显著下降500～5000倍左右，证实CrtN是一个新的抗金黄色葡萄球菌毒力的药物作用靶点。在动物感染实验中，发现盐酸萘替芬(化合物1)可显著地降低金黄色葡萄球菌(Newman)在小鼠肾脏、心脏、以及肝脏中的定植，降低耐药性金黄色葡萄球菌Mu50(甲氧西林耐药、万古霉素中度耐药)在小鼠心脏、以及肝脏中的定植。针对致死剂量的金黄色葡萄球菌(Newman)的感染，盐酸萘替芬(化合物1)可显著延长小鼠的存活时间，疗效与万古霉素类似。以上结果说明本发明的四个化合物可以发展为新用途的抗菌药物。
本发明的(E)-N-甲基-N-(萘-1-基)-3-Ar-丙-2-烯-1-胺盐酸盐(1-4)化合物分子结构较为简单，制备工艺简洁，生产成本低，体内外抗菌机制明确、药效显著，因此，不但有望开发成新型的单一用药方式的抗菌药物，而且还可以开发成与现有抗生素组合给药方式的抗菌药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐的应用，其特征在于，用于制备抗细菌药物，
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗细菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物。
3.一种式I化合物或其药学上可接受的盐的应用，其特征在于，用于制备催化酶CrtN抑制剂；或用于制备抑制金黄色色素合成的药物，
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，Ar为苯基、萘基、C1-C6烷基取代的苯基。
5.一种式I化合物或其药学上可接受的盐，
式中，Ar为R1为异丁基，R2为氢；
或者Ar为萘基、或C1-C6烷基取代的萘基。
6.如权利要求5所述的式I化合物，其特征在于，Ar为萘基。
7.如权利要求5所述的式I化合物，其特征在于，式I化合物药学上可接受的盐选自：
8.一种权利要求5所述的式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在 于，所述方法包括以下步骤：
(a)式II化合物与式III化合物反应生成式I化合物；以及任选地
(b)由式I化合物生成式I化合物盐酸盐的步骤，
各式中，Ar为R1为异丁基，R2为氢；或者Ar为萘基或C1-C6烷基取代的萘基。
9.一种抗细菌的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含降低催化酶CrtN活性的化合物；以及药学上可接受的载体；
其中，所述的降低催化酶CrtN活性的化合物为权利要求5所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的式I化合物药学上可接受的盐选自：
11.一种催化酶CrtN抑制剂的用途，其特征在于，用于制备降低细菌致病能力的药物组合物或抗菌组合物，并且所述催化酶CrtN抑制剂为式I化合物或其药学上可接受的盐
式中，Ar为C6-C10芳基、C1-C6烷基取代的C6-C10芳基。
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