CN105838731B - 表达c30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够合成30个碳原子(C30)的类胡萝卜素4，4′‑二脱辅基链孢红素(4，4’‑diaponeurosporene)重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了含有C30类胡萝卜素合成酶基因(crtm和crtn)的枯草芽孢杆菌表达质粒pMK3‑crtmn(能够在枯草芽孢杆菌中表达C30类胡萝卜素合成酶Crtm和Crtn)，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800中。转化后的WB800菌体由原来的白色变为黄色。提取重组WB800中的色素成分经高效液相色谱(HPLC)鉴定为4，4′‑二脱辅基链孢红素。4，4′‑二脱辅基链孢红素能够刺激树突状细胞成熟，产生的细胞因子(IL‑6、IL‑10、IL‑12p70和TNFα)量增加，并且具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。口服能够合成4，4′‑二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌可以显著降低葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎症状。这种能产4，4′‑二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌有望开发成为一种预防结肠炎的益生菌。
Description
一、技术领域
本发明涉及表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体包括：C30类胡萝卜素表达质粒pMK3-crtmn的构建；C30类胡萝卜素的生物合成与鉴定；C30类胡萝卜素能够刺激树突状细胞成熟，产的细胞因子 (IL-6、IL-10、IL-12p70和TNFα)量增加，并且具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力；口服能够表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌可以显著降低葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎症状。
二、背景技术
1.类胡萝卜素合成研究进展
类胡萝卜素是广泛存在于自然界的一类物质，其中有很多是人和动物必需的营养物质。自然界中的类胡萝卜素来自于两种碳骨架：C30和C40。C40骨架合成起始与两个牛儿基焦磷酸(GGPP)的聚合，由CrtB催化；而C30碳骨架的合成开始于两个法尼基焦磷酸(FPP)的聚合，由CrtM催化。形成的C30或C40骨架在脱氢酶的作用下一步一步脱氢，这一过程会形成许多产物。大肠杆菌中有三种异戊二烯合酶：C15PP合酶，辛异戊烯醇二磷酸盐(C20PP)合酶和Z型十一异戊烯二磷酸盐(C55PP)合酶。C30合成途径可以直接从C15PP开始，而由于C40类胡萝卜素合酶CrtB不能以C15为底物，大肠杆菌又没有C20PP合酶存在，所以要想在大肠杆菌中合成C40类胡萝卜素必须先在大肠杆菌中表达C20PP合酶。而CrtM不但可以催化C15形成C30，还可以催化C20形成C40，虽然效率远比催化C15形成C30的低。
大多数类胡萝卜素合成相关的酶是膜结合的，产物多为疏水的，因此在胞质会形成疏水的区域。目前还不清楚相关的合酶是否形成多聚体，但已有证据表明，存在酶多聚体形成一条类胡萝卜素“生产线”。不同来源的类胡萝卜素合酶能够相互协作合成类胡萝卜素说明多聚酶体的形成不是合成类胡萝卜素的关键因素。
八氢番茄红素(C40)合酶在多种生物中广泛存在，而C30类胡萝卜素合酶目前鉴定的只有一个那就是金黄色葡萄球菌的CrtM。
类胡萝卜素碳骨架合成的酶促反应与角鲨烯合成的酶促反应非常相似，角鲨烯合成是胆固醇合成的第一步。角鲨烯合酶(Sqs)产生的C30骨架仅仅比类胡萝卜素合酶产生的碳骨架多一个NADPH。而且这两种酶具有相似的保守结构域。
CrtM的单个氨基酸突变就能大大提高其合成C40类胡萝卜素的能力，而同时其C30合成能力随之降低。如26位上的F突变成L或S使CrtM合成C40的能力与CrtB相当F26和W38双突变后CrtM合成C30的能力几乎可以忽略不计。另外，W38C和E180G也能够提高CrtM合成C40的能力。事实上将F26或W38 换成一个更小的或是结构可塑性更大的氨基酸就能够提高C40合成的能力。这种突变似乎不会改变CrtM对底物的识别而是改变了中间产物，因为突变后的CrtM 还是不能识别C20PP。
与CrtM不同，对CrtB进行随机突变却不能筛选到能够合成C30的突变体。因此对类胡萝卜素合成的改造用CrtM更加合适，CrtB只能将C20合成C40，不能识别C15。点突变改造后的CrtM能够将C15合成C40，而C15是在所有生物中都有的。另外，野生型的CrtM在同时存在C15和C20的条件下能够合成C35
八氢番茄红素是合成过程中第一个C40类胡萝卜素，碳链的正中央有3个相邻的双键，颜色的产生需要引入更多的连续双键(即更多的生色基团)，因此去饱和酶催化双键形成后颜色产生，并且随着双键的不断增加颜色加深。经过6 步脱氢反应C40碳骨架可以积累15个双键，而C30碳骨架最多进行4步脱氢反应积累11个双键。
通常C40和C30去饱和酶能够共用，不具有特异性。去饱和酶识别的是碳链的一部分而不是整个碳骨架所以不具有特异性，而在下游的修饰酶可能就具有底物特异性了，因为每一步脱氢都会形成一个产物的分支点，如果下游的修饰酶不具有特异性那也就识别不了对应的产物。类胡萝卜素去饱和的程度即所谓进行了多少步去饱和反应可以通过细菌的颜色反映出来。通过多CrtI的突变筛选到不同去饱和能力的CrtI，四步脱氢的CrtI能够增加番茄红素的产量。CrtN是一个三步脱氢去饱和酶。去饱和酶在不同的宿主中的去饱和能力不同，如CrtN在自然宿主金葡菌中几乎全部进行四步脱氢反应，而在大肠杆菌中有部分会进行三步脱氢反应。
在真菌和哺乳动物中异戊二烯来源于甲羟戊酸途径，而在植物和细菌中多来源于磷酸木酮糖途径(DXP)。异戊二烯前体是有毒的而异戊二烯类化合物又是机体正常生长所需要的，说明异戊二烯的代谢受到严格的控制。dxs基因编码的酶是DXP途径中的第一个酶，能够以甘油醛-3-磷酸和丙酮酸盐为底物合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。其后还有六种酶参与代谢途径的反应。经过这七种酶的作用能够合成DMAPP或IPP。许多研究表明在植物中DMAPP能够在异戊二烯合酶(IspS)的作用下合成异戊二烯。但这种酶在细菌中还没有被鉴定。法尼基二磷酸合酶(IspA)能够聚合DMAPP和IPP形成牻牛儿基二磷酸盐(GPP)，法尼基二磷酸盐或更大的类异戊二烯。庚戊烯二磷酸合成酶(HepS)和十一异戊烯焦磷酸合成酶(UppS)都是IspA的下游酶，能够合成更大的类异戊二烯。
异戊二烯合成酶的mRNA表达水平在不同的培养条件下受到严格的控制。在大肠杆菌中DMAPP和IPP的堆积是有害的，而在枯草中这种毒性作用低。因此枯草芽孢杆菌更具有合成类胡萝卜素的优势。
2.枯草芽孢杆菌对黏膜免疫的影响
枯草芽孢杆菌作为一种安全的无致病性活细菌载体，是广泛存在于土壤和植物中的优势生物种群，隶属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，其细胞呈直杆状，大小 (0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，无荚膜，能运动。枯草杆菌作为抗原的载体具有很多优点：①是人类和动物安全纪录的益生菌和食品添加剂，②成本低廉、耐热、抗干燥、便于运输和使用，③其遗传性状和细菌学水平都很容易操纵。因此，枯草芽孢杆菌非常适宜作为安全的口服递送载体。同时枯草芽孢杆菌作为递送载体可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的空间。
3.类胡萝卜素的免疫作用
早期的研究发现，β胡萝卜素能够抑制缺乏维生素A的大鼠的耳，肾，肠，膀胱等组织的感染。因为β胡萝卜素能够转化成维生素A，所以这些研究提示类胡萝卜素的这种作用是因为能够转成维生素A。但越来越多的研究表明，非维生素 A前体的类胡萝卜素也具有不同的免疫的作用，类胡萝卜素本身的免疫调节作用越来越受到重视。
抗氧化作用是类胡萝卜素的重要生物学功能之一，几乎所有的类胡卜素都具有抗氧化功能。大量体外试验、动物模型和人体试验证明类胡萝卜素可以猝灭单线态氧、消除自由基、防止低密度脂蛋白的氧化。番茄红素会减弱树突状细胞表型和功能上的成熟，下调CD80、CD86和MHCII分子的表达，降低T淋巴细胞 IL-2水平，抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶P38，ERK1/2和转录因子NF-κB。
胡萝卜素的水平在抵抗感染时显著高于其刺激生长时的水平，并且可显著刺激小鼠、猪、牛等动物胸腺生长，增加胸腺小淋巴细胞数量。饲料中添加β-胡萝卜素后，可提高奶牛干奶期吞噬细胞和多形核白细胞的杀菌活性，相比之下维生素A及其酸则减少了吞噬细胞数量，而且对杀菌活性没有任何影响。
类胡萝卜素对炎症反应的影响汇总表
三、发明内容
技术问题
本发明成功构建了类胡萝卜素合成酶表达质粒pMK3-crtmn，并转化进入枯草芽孢杆菌WB800。重组枯草芽孢杆菌能够合成C30类胡萝卜素，C30类胡萝卜素具有激活树突状细胞能力。小鼠口服表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌能够显著降低结肠炎症状。重组枯草芽孢杆菌WB800有望开发成预防结肠炎的益生菌。
技术方案
本发明涉及表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌 WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。检测C30类胡萝卜素对树突状细胞的作用和口服重组枯草芽孢杆菌对小鼠结肠炎的影响。
1类胡萝卜素合酶表达质粒构建方法包括：
1.1 C30类胡萝卜素合成酶基因的克隆
参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列(GenBank登陆号： NC_007795.1)，设计一对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列(下划线为同源臂)，引物序列如下：
P1：5’-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3’
P2：5’-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGG
GTATACG-3’
以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的 P1、P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为 50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃3min， 30个循环，72℃ 10min，4℃ 10min。回收扩增产物。
1.2pMK3-crtmn质粒的构建
用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII 和BamHI各2ul，10×buffer 4ul，pMK3质粒1ug(4ul)，超纯水28ul，37℃ 2 小时。将酶切产物回收得到线性化的pMK3质粒。将线性化的pMK3质粒与P1， P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(ClonExpressTM II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3-crtmn质粒，并测序。
2电转化枯草芽孢杆菌WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
取60μL枯草芽孢杆菌WB800电转化感受态细胞与1μL(50ng/μL)表达载体pMK3-crtmn质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22 KV/cm，25μF，200Ω，电击一次。加入1mL电击恢复液，37℃ 100rpm孵育 3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-18h可见阳性菌落。收集阳性菌落进行扩大培养可见菌体呈现黄色。通过丙酮-正己烷抽提，可将色素成分提取出来，并通过高效液相色谱鉴定。
3检测C30类胡萝卜素对小鼠树突状细胞的作用
3.1小鼠骨髓源树突状细胞的分离培养
(1)颈椎脱臼处死4-6周龄的C57BL/6小鼠，无菌分离股骨和胫骨。
(2)用1ml注射器吸取含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基(4℃预冷，无血清)，将骨髓冲洗至一无菌培养皿中，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，1500rpm， 10min。
(3)弃去上清，加入2ml预热的红细胞裂解液，轻轻混匀后室温静置适当时间，加入5ml含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基(4℃预冷，无血清)终止裂解， 1500rpm，10min。
(4)弃去上清，用5ml含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基(4℃预冷，无血清)重悬细胞，1500rpm，10min。
(5)弃去上清，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基(1％青链霉素 +10ng/ml rmGM-CSF+10ng/ml rmIL-4)重悬细胞，细胞以4×105个/ml密度接种于24孔细胞培养板中。
(6)37℃，5％CO2培养箱中培养48～72h后，全量换液，再加入新鲜的 RPMI-1640完全培养基继续培养至第6天。
(7)收集悬浮以及半贴壁的细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞。
3.2 C30类胡萝卜素作用树突状细胞及相关指标的检测
将培养好的树突状细胞铺到12孔板中，2×105/孔。C30处理组：每孔加入1uM C30类胡萝卜素(Dia组)；LPS组：每孔加入10ng/ml LPS(LPS组)；从不表达 C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌中提取的提取物对照组：加入与Dia组等体积的溶剂(CE组)；阴性对照组：加入等体积溶剂(Control组)。将以上不同处理作用树突状细胞24小时，用流式检测树突状细胞的表型变化，普通光学显微镜检测树突状细胞的形态指数变化，用ELISA检测培养上清中的细胞因子含量，通过混合淋巴细胞反应检测树突状细胞对T细胞的刺激情况。具体方法如下：
3.2.1普通显微镜检测细胞形态指数变化
收集细胞，将细胞铺于爬片上，直接镜下观察细胞形态。
3.2.2流式检测树突状细胞表型
收集树突状细胞，2000rpm，10min，弃上清，PBS清洗两次后，重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，取100μl细胞悬液，加入FITC-CD40、FITC-CD80、 FITC-CD86或者FITC-MHCII，4℃孵育30min，2000rpm，10min，弃上清， PBS清洗两次后，200μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测表达共刺激分子以及 MHCII的平均荧光强度。
3.2.3ELISA检测IL-6、IL-10、IL-12p70和TNFα
收集细胞培养液，应用ELISA试剂盒检测培养液中IL-6、IL-10、IL-12p70 和TNFα，具体步骤如下：
(1)在酶标条中加入样品和标准品，100μl/孔，37℃反应90min。轻轻倒掉，不洗。
(2)加入生物素标记的抗小鼠IL-6、IL-10、IL-12p70或TNFα抗体，100μl/ 孔，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤5次，5min/次。
(3)加入提前预热的ABC工作液，37℃反应30min，0.01M PBS洗涤5次， 5min/次。
(4)加入提前预热的TMB显色液，90μl/孔，37℃避光反应20-30min。
(5)加入TMB终止液，100μl/孔。
(6)用酶标仪在450nm测定OD值，根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线。
(7)根据样品的吸光值在绘制的标准曲线上找出对应的浓度。
3.2.4混合淋巴细胞反应检测淋巴细胞增殖
将小鼠肠系膜淋巴结轻轻剪碎并且转移到200目的细胞钢筛上，轻轻研磨得到单个淋巴细胞悬液，1500rpm，10min，PBS清洗两次，40μl buffer重悬1×107个细胞，加入10μlBiotin-Antibody Cocktail混匀，4℃反应5min；加入20μl Anti-Biotin Microbeads混匀，4℃反应10min，每5min轻轻混匀1次；补加至 500μl buffer；磁力柱中加入3ml润柱液后，再缓缓加入前面已经重悬好的细胞，收集从磁力柱中流出的细胞，即为CD4+T细胞，流式检测CD4+T细胞的百分数，发现分选得到的CD4+T细胞纯度为99％。
应用CFSE活细胞染料试剂盒标记CD4+T细胞，将收集的树突状细胞与 CFSE标记的CD4+T细胞按照1∶5混合，37℃，5％CO2培养箱中培养5天后，收集细胞，2000rpm，10min，弃上清，PBS清洗两次后，流式检测T细胞的增殖情况。
4检测口服表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌后对小鼠结肠炎的影响
对小鼠每天灌胃1×109CFU能够表达C30的枯草芽孢杆菌(WB800-C30)或对照枯草芽孢杆菌(WB800)，连续饲喂30天后在饮水中添加5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎。7天后颈椎脱臼处死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价组织病理变化。
有益效果
1本发明测序的crtm和crtn基因来源于金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株，其基因序列是国内外首次报道。
2本发明构建的pMK3-crtnm质粒是国内外第一个以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMK3为骨架构建的，能够在枯草芽孢杆菌中表达类胡萝卜素合酶合成 C30类胡萝卜素的质粒。
3本发明首次证明了C30类胡萝卜素(4，4′-二脱辅基链孢红素)能够激活树突状细胞。
4本发明成功构建了能够合成C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌。口服小鼠可以减轻小鼠结肠炎症状。重组枯草芽孢杆菌WB800有望开发成预防结肠炎的益生菌。
四、附图说明：
图1用引物P1和P2扩增得到大小约3kb的目的基因片段。
图2pMK3-crtmn质粒酶切验证结果。经PvuI和NheI酶切得到大小分别为3758bp 和6433bp的片段。
图3含有pMK3-crtmn的重组枯草芽孢杆菌呈现黄色(右)，而含有pMK3空质粒的枯草芽孢杆菌为白色(左)。
图4重组枯草芽孢杆菌中的色素成分能够用丙酮-正己烷抽提。
图5经高效液相色谱分析证明从重组枯草芽孢杆菌中提取的色素成分为C30类胡萝卜素，4，4′-二脱辅基链孢红素。
图6 C30类胡萝卜素能够刺激树突状细胞形态成熟。Control：阴性对照；LPS：阳性对照；CE：含有pMK3的枯草芽孢杆菌的提取物；Dia：C30类胡萝卜素。
图7 C30类胡萝卜素能够刺激树突状细胞表型成熟。Control：阴性对照；CE：含有pMK3的枯草芽孢杆菌的提取物；Dia：C30类胡萝卜素。
图8 C30类胡萝卜素刺激树突状细胞产生更多的细胞因子。Control：阴性对照；CE：含有pMK3的枯草芽孢杆菌的提取物；Dia：C30类胡萝卜素。
图9 C30类胡萝卜素增强树突状细胞刺激T细胞增殖的能力。Control：阴性对照；LPS：阳性对照；CE：含有pMK3的枯草芽孢杆菌的提取物；Dia：C30类胡萝卜素。
图10小鼠口服表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌后结肠炎症状减轻。表现为结肠长度增加，出血减轻。1：正常小鼠结肠；2：饲喂PBS的小鼠用DSS诱导结肠炎；3：饲喂不表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌的小鼠用DSS诱导结肠炎；4：饲喂表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌的小鼠用DSS诱导结肠炎
图11小鼠口服表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌后结肠炎的组织病理症状减轻。A：饲喂PBS的小鼠用DSS诱导结肠炎，表现出明显的组织病理变化。上皮细胞脱落(箭头)，黏膜下和肠腔中出血(五角星)黏膜下和固有层炎性细胞浸润(三角形)，肠壁增生变厚。B：饲喂表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌后肠炎组织病理变化明显减轻。无可见出血点和炎性细胞浸润，上皮细胞较为完整，肠壁无增生。
五、具体实施方式
1类胡萝卜素合酶质粒pMK3-crtmn的构建
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：
枯草芽孢杆菌WB800菌株由南京农业大学植物保护学院高学文惠赠，文献见：Wu，H.，Wang，S.，Qiao，J.，Liu，J.，Zhan，J.，Gao，X.，2009.Expression of HpaGXooc proteinin Bacillus subtilis and its biological functions.Journal of microbiology andbiotechnology 19，194-203；
E.coli JM109、质粒pMK3、pCDNA3.1(购自Life Technologies)；
试剂：Q5高保真酶购自NEB公司；pMD19-T载体，Agarose Gel DNA PurificationKit，限制性内切酶，T4连接酶等均购自Takara公司；硫酸卡那霉素，氨苄青霉素，细菌基因组提取试剂盒购自OMEGA公司；One Step Cloning Kit 定点克隆试剂盒购自Vazyme公司；DSS购自上海前尘生物；ELISA试剂盒购自武汉博士德。FITC-CD40、FITC-CD80、FITC-CD86和FITC-MHCII抗体购自联科生物。小鼠CD4+T细胞分选试剂盒购自优宁维。
1.1 C30类胡萝卜素合成酶基因的克隆
参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列(GenBank登陆号： NC_007795.1)，设计一对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列(下划线为同源臂)，引物序列如下：
P1：5’-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3’
P2：5’-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATAC G-3’
以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、 P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，如图1所示，扩增的目的片段约3000bp。
1.2pMK3-crtmn质粒的构建
用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII 和BamHI各2ul，10×buffer 4ul，pMK3质粒1ug(4ul)，超纯水28ul，37℃ 2 小时。将酶切产物回收得到线性化的pMK3质粒。将线性化的pMK3质粒与P1， P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(ClonExpressTM II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3-crtmn质粒，经PvuI和NheI酶切验证正确，如2所示。送英俊测序。
2表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌的验证
将pMK3-crtmn电击转化枯草芽孢杆菌WB800。取60μL枯草芽孢杆菌 WB800电转化感受态细胞与1μL(50ng/μL)表达载体pMK3-crtmn质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，25μF，200Ω，电击一次。加入1mL电击恢复液，37℃ 100rpm孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-18h可见阳性菌落。收集阳性菌落进行扩大培养可见菌体呈现黄色(图3)。通过丙酮-正己烷抽提，可将色素成分提取出来(图4)，通过高效液相色谱鉴定为C30类胡萝卜素(4，4’-diaponeurosporene)(图5)。
3检测C30类胡萝卜素对小鼠树突状细胞的作用
将培养好的树突状细胞铺到12孔板中，2×105/孔。C30处理组：每孔加入1uM C30类胡萝卜素(图中Dia组)；LPS组：每孔加入10ng/ml LPS(图中LPS组)；从不表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌中提取的提取物对照组：加入与Dia组等体积的溶剂(图中CE组)；阴性对照组：加入等体积溶剂(图中Control组)。将以上不同处理作用树突状细胞24小时，用流式检测树突状细胞的表型变化，普通光学显微镜检测树突状细胞的形态指数变化，用ELISA检测培养上清中的细胞因子含量，通过混合淋巴细胞反应检测树突状细胞对T细胞的刺激情况。
具体方法如下：
3.1普通显微镜检测细胞形态指数变化
收集细胞，将细胞铺于爬片上，直接镜下观察细胞形态。如图6所示，C30类胡萝卜素处理的树突状细胞形态指数增加，有形态成熟的特征。
3.2流式检测树突状细胞表型
收集树突状细胞，2000rpm，10min，弃上清，PBS清洗两次后，重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，取100μl细胞悬液，加入FITC-CD40、FITC-CD80、 FITC-CD86或者FITC-MHCII，4℃孵育30min，2000rpm，10min，弃上清， PBS清洗两次后，200μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测表达共刺激分子以及 MHCII的平均荧光强度。如图7所示，C30类胡萝卜素能够显著刺激树突状细胞表型成熟。
3.3ELISA检测IL-6、IL-10、IL-12p70和TNFα
收集细胞培养液，应用ELISA试剂盒检测培养液中IL-6、IL-10、IL-12p70 和TNFα，具体步骤如下：
(1)在酶标条中加入样品和标准品，100μl/孔，37℃反应90min。轻轻倒掉，不洗。
(2)加入生物素标记的抗小鼠IL-6、IL-10、IL-12p70或TNFα抗体，100μl/ 孔，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤5次，5min/次。
(3)加入提前预热的ABC工作液，37℃反应30min，0.01M PBS洗涤5次， 5min/次。
(4)加入提前预热的TMB显色液，90μl/孔，37℃避光反应20-30min。
(5)加入TMB终止液，100μl/孔。
(6)用酶标仪在450nm测定OD值，根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线。
(7)根据样品的吸光值在绘制的标准曲线上找出对应的浓度。
如图8所示，C30类胡萝卜素能够提高树突状细胞细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p70和TNFα的产生量。
3.4混合淋巴细胞反应检测淋巴细胞增殖
将小鼠肠系膜淋巴结轻轻剪碎并且转移到200目的细胞钢筛上，轻轻研磨得到单个淋巴细胞悬液，1500rpm，10min，PBS清洗两次，40μl buffer重悬1×107个细胞，加入10μlBiotin-Antibody Cocktail混匀，4℃反应5min；加入20μl Anti-Biotin Microbeads混匀，4℃反应10min，每5min轻轻混匀1次；补加至 500μl buffer；磁力柱中加入3ml润柱液后，再缓缓加入前面已经重悬好的细胞，收集从磁力柱中流出的细胞，即为CD4+T细胞，流式检测CD4+T细胞的百分数，发现分选得到的CD4+T细胞纯度为99％。
应用CFSE活细胞染料试剂盒标记CD4+T细胞，将收集的树突状细胞与 CFSE标记的CD4+T细胞按照1∶5混合，37℃，5％CO2培养箱中培养5天后，收集细胞，2000rpm，10min，弃上清，PBS清洗两次后，流式检测T细胞的增殖情况。结果如图9所示，C30类胡萝卜素能够显著的提高树突状细胞刺激T细胞增殖的能力。
4检测饲喂表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌对小鼠结肠炎的影响
对小鼠每天灌胃1×109CFU能够表达C30的枯草芽孢杆菌(WB800-C30)或对照枯草芽孢杆菌(WB800)，连续饲喂30天后在饮水中添加5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎。7天后颈椎脱臼处死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价组织病理变化。结果表明，WB800-C30组小鼠结肠较WB800 组显著增长(图10)。组织病理变化明显缓解，表现为出血减少，淋巴细胞浸润减少，肠上皮细胞脱落减少，肠壁增生减弱(图11)。说明表达C30类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌能够预防结肠炎的发生。
Claims (3)
1.一种构建C30类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3-crtmn的方法，包括以下步骤：
1.1C30类胡萝卜素合成酶基因的克隆
参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列，GenBank登陆号:NC_007795.1，设计一对扩增crtm和crtn的引物；此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列，下划线为同源臂，引物序列如下：
P1:5’-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3’
P2:5’-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG-3’
以金黄色葡萄球菌提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环，72℃10min，4℃10min；回收扩增产物；
1.2pMK3-crtmn质粒的构建
用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化，反应条件为HindIII和BamHI各2ul，10×buffer 4ul，pMK3质粒1ug 4ul，超纯水28ul，37℃2小时；将酶切产物回收得到线性化的pMK3质粒；将线性化的pMK3质粒与P1，P2引物的扩增产物进行连接，得到pMK3-crtmn质粒，酶切鉴定并测序。
2.一种制备能够表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，通过权利要求1的方法构建得到C30类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3-crtmn，能够表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌包含权利要求1所述构建方法制备的C30类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3-crtmn，该重组枯草芽孢杆菌WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是并由以下方法转化而成：
取60μL枯草芽孢杆菌WB800电转化感受态细胞与1μL 50ng/μL表达载体pMK3-crtmn质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，25μF，200Ω，电击一次；加入1mL电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-18h可见阳性菌落；收集阳性菌落进行扩大培养可见菌体呈现黄色；通过丙酮-正己烷抽提，可将色素成分提取出来，并通过高效液相色谱鉴定为4,4'-二脱辅基链孢红素。
3.一种如权利要求2所述方法制备的能够表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗DSS诱导的肠炎症的药物和制剂上的应用。
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