CN104046677A - 一种微生物厌氧降解染料的高通量无损检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种微生物厌氧降解染料的高通量无损检测方法，属于污染物降解和分子生物学领域。在96孔板的每个孔中加入染料污染物与菌体的混合物，以液体石蜡液密封后，在氮气氛围中加盖高透光率透明胶带密封，形成厌氧反应体系，以全波长酶标仪在特定波长下检测染料的吸光值，进行定时无损监测。这种新型高通量评估体系方法新颖，能够显著提高评估效率，避免取样过程，减小实验误差，缩短评估时间，且准确率高，重复性好，反应条件易于控制，在污染物降解及产电微生物产电能力的评估等领域具有很强的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明提出基于96孔板和酶标仪所建立的用于微生物厌氧降解染料污染物的高通量无损评估体系。属于污染物降解和分子生物学领域。
背景技术
环境污染尤其是水污染所产生的生态修复问题是近年来研究的重要方向之一。我国是一个纺织工业大国。伴随着纺织产品的大量需求和生产，众多的印染工厂排放了大量的纺织废水。据估计，印染废水排放量占纺织工业废水排放量的80%。目前，工业印染废水的不合理排放造成了严重的环境污染，是导致水体污染的一个重要原因。许多染料及其分解产物还具有毒性、致癌性和致突变性。因此，对印染废水的处理长期以来都是我国环境领域的一个研究热点。
目前，对印染废水的处理有物理和化学方法，例如吸附、沉淀、化学氧化、光降解和膜过滤等。但是这些处理技术由于操作过程复杂、处理费用昂贵、能耗大、反应条件要求苛刻、形成的副产物有毒等问题，在实际印染废水处理中的应用严重受限。与之相比，生物处理，特别是微生物处理技术由于具有安全、经济、实用、系统等诸多优点而成为处理印染废水的主要技术手段。但是目前所发现的微生物对于染料的生态修复大多是由降解酶进行的特定降解，而实际的染料废水却经常含有多种不同的染料。因而这种特异性生态修复方式严重限制了染料废水的生物降解能力，因而亟需发展一种非特异性的新型生物广谱降解方式。近年来的研究发现，包括Shewanella、Klebsiella、Geobacter、Pseudomonas等众多环境微生物种群都具有在厌氧条件下非特异性广谱降解染料的能力。
分离筛选具有染料降解能力的环境微生物，评估其降解效能，解析降解机理，优化降解工艺（酸碱度、碳源、氮源等），以及在此基础上通过诱变筛选或者遗传改良等方法获得高降解性能突变菌株等研究，都需要高通量的染料厌氧降解评估体系。但是目前这些降解研究多是通过血清瓶厌氧培养，定时取样并利用分光光度仪检测。操作繁琐、效能低、取样过程容易渗入氧气导致平行性差，难以大规模操作和实时无损检测。因而，急需发展出一种高通量无损检测的新型生物厌氧降解评估体系。
发明内容
本发明的目的在于通过96孔板与酶标仪联用，开发一种简单高效的污染物生物厌氧降解的高通量评估方法。本方法具有一次检测样品量多，周期短，易重复，经济快捷，反应条件易于控制，无损实时检测等诸多优点。
本发明所述方法，是利用96孔板作为厌氧培养体系，将待评测微生物菌株接种于含染料污染物的矿物盐脱色培养基中，然后在厌氧条件下密封培养，并利用酶标仪实时无损检测。
本发明中微生物厌氧降解的高通量无损检测方法，按照下述步骤进行：
（1）挑取待测微生物单克隆，接入50 ml酵母膏蛋白胨液体培养基（LB培养基，含酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl l0 g/l），在好氧条件下于30 oC，180 rpm震荡培养至对数后期；
（2）采用6000 ×g，5 min离心收集菌体，之后用无菌蒸馏水重悬洗涤两次；
（3）将步骤（2）离心重悬好的菌体密度调节到4~5×108 CFU/ml备用；
（4）将干净的96孔板置于超净台中，紫外灭菌两小时，备用；
（5）配制含有染料污染物的脱色培养基，并通入高纯氮气除氧；
（6）在无氧氛围中，将步骤（5）所配含有染料污染物的培养基添加到步骤（4）处理好的96孔板，每孔加入80 μl培养基；
（7）再添加步骤（3）所调好菌浓的菌悬液60 μl于培养基中，在酶标仪上震荡混匀；
（8）再向步骤（7）体系中加入60 μl液体石蜡，以防止液体蒸腾并在一定程度上隔绝空气；
（9）加样完成后在无氧氛围中用高透光率透明胶带密封，确保反应体系能隔绝空气，形成高通量厌氧反应体系；
（10）将步骤（9）构建完成的96孔板降解体系于30 oC培养，用全波长酶标仪在特定波长下检测待测染料的吸光值，进行定时无损监测。
本发明针对目前染料污染物微生物厌氧评测缺乏高效、简易方法的困境，利用96孔板和酶标仪相结合，构建了一种新型的高通量实时无损评估的新方法，从而显著缩短筛选时间，简化操作流程，提高评测效率。
附图说明
图1是96孔板高通量厌氧评估体系对甲基橙的降解，A为120 mg/L，B为60 mg/L，C为30 mg/L，D为15 mg/L。
图2-5分别为 96孔板高通量厌氧评估体系对不同浓度（120 mg/l、60 mg/l、30 mg/l、15 mg/l）甲基橙的降解曲线。
具体实施方式
评估模式微生物Shewanella oneidensis MR-1野生型及MTR突变型菌株（△mtrA，△mtrB，△omcA/mtrC，△cymA）对偶氮染料甲基橙的降解效能。所用菌株均由美国加利福尼亚大学尼尔森教授赠送。S. oneidensis MR-1野生型菌株保存于美国模式典型物收集中心（ATCC）， 菌株编号是ATCC 700550™。此菌种可直接从该中心购买。本实验所用的指示性污染物为偶氮染料甲基橙。具体实施方式如下：
（1）将保存在甘油中的S. oneidensis MR-1及其MTR突变体划线于LB平板上，30oC过夜培养；
（2）用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50 ml LB液体培养基中，30oC、180 rpm培养至对数后期；
（3）将（2）中各菌液于50 ml无菌离心管中6000 ×g，离心5 min收集菌体，之后用无菌蒸馏水重悬菌体，6000 ×g，离心5 min，去上清。重复离心-重悬操作两次，最终将收集的菌体在矿物盐培养基（Bretschger, O., A.
Obraztsova, et al. (2007). "Current production and metal oxide reduction
by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants." Applied and
Environmental Microbiology 73(21): 7003-7012. ）中重悬，用矿物盐培养基稀释调菌浓至4~5×108 CFU/ml，通入高纯氮气除氧；
（4）提前将2块干净的96孔板（购于美国康宁公司，型号：3599）置于超净台中，紫外灭菌两小时；
（5）用矿物盐培养基配制含不同浓度（96孔板反应体系中甲基橙初始浓度分别为120 mg/l、60 mg/l、30 mg/l、15 mg/l,如图1）甲基橙染料的脱色培养基，通入高纯氮气除氧备用；
（6）在无氧氛围中配制厌氧反应体系，将步骤（5）所配含有染料污染物的培养基（染料降解体系）或不含染料的矿物盐培养基（空白抠底对照）添加到步骤（4）处理好的96孔板，每孔加入80 μl培养基；
（7）再添加步骤（3）所调好菌浓的菌悬液60 μl于培养基中，在酶标仪中震荡混匀；
（8）再向步骤（7）体系中加入60 μl液体石蜡，以防止液体蒸腾并在一定程度上隔绝空气，每个菌种对各浓度的甲基橙降解，空白抠底对照及热杀死降解处理均设三个重复；
（9）加样完成后在无氧氛围中用高透光率透明胶带密封，确保反应体系能隔绝空气，形成高通量厌氧反应体系；
（10）将步骤（9）构建的体系直接用全波长酶标仪在465 nm波长下检测甲基橙的吸光值，进行定时无损监测。
从图2-图5的实验所得数据可知， 在96孔板高通量厌氧评估体系中，S. oneidensis MR-1及其突变体菌株对甲基橙的降解趋势与之前厌氧瓶研究甲基橙降解趋势（Cai, P. J., X. Xiao, et
al. (2012). "Anaerobic biodecolorization mechanism of methyl orange by Shewanella
oneidensis MR-1." Appl Microbiol Biotechnol 93(4): 1769-1776.）相符。因此，采用本发明方法能够显著提高评估方法的效率，简化操作流程，改善实验的重现性，具有对微生物厌氧降解脱色的高通量评估体系中对染料污染物的生物厌氧降解进行高通量评估是可行的。
Claims (2)
1.微生物厌氧降解的高通量无损检测方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）挑取待测微生物单克隆，接入50 ml酵母膏蛋白胨液体培养基，在好氧条件下于30 oC，180 rpm震荡培养至对数后期；
（2）采用6000 ×g，5 min离心收集菌体，之后用无菌蒸馏水重悬洗涤两次；
（3）将步骤（2）离心重悬好的菌体密度调节到4~5×108 CFU/ml备用；
（4）将干净的96孔板置于超净台中，紫外灭菌两小时，备用；
（5）配制含有染料污染物的脱色培养基，并通入高纯氮气除氧；
（6）在无氧氛围中，将步骤（5）所配含有染料污染物的培养基添加到步骤（4）处理好的96孔板，每孔加入80 μl培养基；
（7）再添加步骤（3）所调好菌浓的菌悬液60 μl于培养基中，在酶标仪上震荡混匀；
（8）再向步骤（7）体系中加入60 μL液体石蜡，以防止液体蒸腾并在一定程度上隔绝空气；
（9）加样完成后在无氧氛围中用高透光率透明胶带密封，确保反应体系能隔绝空气，形成高通量厌氧反应体系；
（10）将步骤（9）构建完成的96孔板降解体系于30
oC培养，用全波长酶标仪在特定波长下检测待测染料的吸光值，进行定时无损监测。
2.根据权利要求1所述的微生物厌氧降解的高通量无损检测方法，其特征在于LB培养基中含酵母提取物5
g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl l0 g/l。
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