CN113755392A - 一种异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法，涉及有机污染物降解技术领域。异化金属还原菌有氧条件下进行芬顿试剂Fe(II)的胞外循环再生，以及同时通过有氧呼吸产生芬顿试剂H2O2。Fe(Ⅱ)在胞外H2O2产生高反应活性的羟基自由基，从而对有机污染物实现高效氧化降解。这种异化金属还原菌驱动的同步生物芬顿降解方法，对有机污染物具有普遍降解能力，反应条件易控制，无需额外添加芬顿试剂，物料成本低廉，在环境有机污染物降解及异化金属还原菌的环境修复应用领域有很强的重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及有机污染物降解技术领域，具体是涉及一种异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法。
背景技术
生态环境是关系民生的重大社会问题。随着我国社会经济的快速发展，环境有机污染物逐渐增加。环境中大量存在的有机污染物若不加以有效处理，将直接或间接危害人类健康。随着我国对生态保护和环境治理的日益重视，环境有机污染物的有效控制已成为当前环境领域关注的热点问题。
相比于传统的化学-物理等处理技术，生物处理方法因其成本低廉、易于操作、环境友好等优点而日益受到重视，成为环境有机污染治理的重要手段，具有良好的应用前景。但是，对于一些复杂难降解的有机污染物，其可生化性较差，单纯的生物处理方法难以直接有效降解。因此，对于含难降解有机污染物废水的处理，通常使用芬顿氧化法作为废水生化处理前的预处理工艺，或者作为废水生化处理后的深度处理工艺。
芬顿(Fenton)氧化法是指在酸性条件下，通过Fe2+和H2O2反应产生具有强氧化性质的羟基自由基(·OH)，实现有机污染物的高效氧化降解。芬顿法具有无选择特异性、氧化性强、环境友好等优点，在难降解有机废物的处理等环保领域中具有重要的应用价值。但是，芬顿氧化工艺需要不断添加双氧水和硫酸亚铁，以及需要额外添加酸、碱调节体系pH值。这使得目前常规芬顿氧化工艺的成本较高，且污泥产生量多。
生物芬顿是近年来出现的新型芬顿技术之一。它利用微生物细胞能够产生芬顿试剂H2O2(通过微生物利用O2胞内有氧呼吸)和Fe(II)(通过微生物对Fe(III)的胞外还原)，从而驱动Fenton反应持续产生·OH自由基，进行有机污染物的降解。通过现有部分文献报道可知，异化金属还原细菌是一类能够利用金属离子作为电子受体进行厌氧呼吸的微生物，但是当前基于异化金属还原细菌的生物修复方法，是需要缺氧/有氧重复操作来实现芬顿试剂Fe(II)再生和H2O2产生。这使得两种芬顿试剂的生物产生是相互间隔的，不能满足芬顿反应的持续发生。同时，该修复体系操作繁琐、耗时冗长，严重限制生物芬顿在有机污染物修复中的实际应用。因此，亟需发展一种新型的基于异化金属还原细菌驱动的自主连续式生物芬顿反应系统及降解方法。
发明内容
针对当前异化金属还原细菌驱动的缺氧/有氧重复芬顿降解技术，存在操作繁琐，耗时冗长的技术缺陷，本发明的目的在于提出一种简单、绿色、低成本的异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法，异化金属还原菌在有氧条件下进行芬顿试剂Fe(II)的胞外循环再生，同时通过有氧呼吸产生芬顿试剂H2O2，从而驱动Fenton反应持续产生高反应活性的羟基自由基·OH自由基，对有机污染物实现高效氧化降解。
进一步地，具体是将兼性好氧的异化金属还原菌和铁源加入到有机污染物中，在静置条件下培养；利用异化金属还原菌的有氧呼吸自身产生H2O2，同时通过异化金属还原途径实现细胞外Fe(Ⅲ)还原生成Fe(Ⅱ)，继而活化体系中的H2O2产生高反应活性的羟基自由基·OH，从而氧化降解体系中的有机污染物。
进一步地，所述异化金属还原菌选自Shewanella oneidensis MR-1野生型，购自美国模式典型物收集中心(ATCC)，菌株编号是ATCC 700550TM。Shewanella菌是被研究的最为广泛的异化金属还原细菌，其在维持水生态系统稳定中具有重要作用。Shewanella菌能够通过异化金属还原途径还原柠檬酸铁、硫酸亚铁、磁铁矿、水铁矿和针铁矿等多种不同形态的Fe(III)生成Fe(Ⅱ)。与此同时，Shewanella菌也能在有氧条件下利用氧气进行呼吸并伴随着H2O2的产生。因此，Shewanella能够持续形成芬顿试剂Fe(II)和H2O2，从而驱动有机污染物的氧化降解。
本发明利用异化金属还原菌实现芬顿试剂Fe(II)的胞外循环再生和芬顿试剂H2O2有氧合成的同时产生，从而在细胞外连续进行芬顿氧化反应，从而开发出一种新型的针对有机污染物的氧化修复技术。与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
1)、降解方法利用好氧条件下的同步生物芬顿方法对有机污染物的氧化降解，而不是通常异化金属还原菌所介导的厌氧还原降解。同时，降解体系是在有氧静置的条件下进行，从而避免了通常异化金属还原菌需要通氮气除氧的繁琐操作，从而实现芬顿反应的持续发生。
2)、本发明降解方法避免了普通芬顿降解工艺需要持续添加芬顿试剂Fe(II)和H2O2的弊端，有效降低了物料成本。同时避免了缺氧/有氧循环的繁琐操作，通过静置反应，实现芬顿试剂的同步产生和芬顿反应的连续运行。具有反应条件易于控制，物料成本低廉，符合绿色、可持续的发展理念。
3)、芬顿反应所添加的少量铁源，即可以是可溶性的柠檬酸铁、Fe2SO4，也可以是不溶性的针铁矿、水铁矿、磁铁矿等。芬顿反应使用透气膜对血清瓶进行封口，保证一定量氧气渗入；降解体系静置在30℃培养箱中培养，控制氧气渗入率，最终形成有氧静置反应体系。本发明可以降解的污染物可以为偶氮染料、三苯甲烷染料、多环芳烃、持久性有机污染物等有机污染物，但也可用于修复其它不同类型的污染物。
附图说明
图1是实施例1中含甲基橙废水处理浓度变化曲线。
图2是实施例2中含罗丹明B废水处理浓度变化曲线。
图3是实施例3中含1,4-二氧六环废水处理浓度变化曲线。
具体实施方式
实施例1
针对含偶氮染料——甲基橙废水的异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解方法，步骤如下：
(1)配置含有20mM乳酸和含有50mg/L甲基橙废水的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用。
矿物盐培养基可参照文献配制(Li,F.H.,Q.Tang,Y.Y.Fan,et al.(2020)."Developing a population-state decision system for intelligently reprogrammingextracellular electron transfer in Shewanella oneidensis."Proc Natl Acad Sci U S A117(37):23001-23010.)。
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养。Shewanella oneidensis MR-1野生型菌株保存于美国模式典型物收集中心(ATCC)，菌株编号是ATCC 700550TM，此菌种购自该中心。
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期。
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液重悬洗涤两次，制成菌悬液备用。
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解。
(6)30℃培养箱培养，定时取样，甲基橙的浓度直接根据其在464nm的吸光值来计算。
(7)直至污染物甲基橙降解完全。
通过图1即可发现，本实施例中，即使没有添加铁源，甲基橙也是可以通过Shewanella oneidensis MR-1这个菌直接降解，在有氧条件下，Shewanella oneidensisMR-1能够直接将电子传递至胞外。降解73小时后，剩余甲基橙浓度为由50mg/L降低至8mg/L，降解效果明显。
实施例2
针对含三苯甲烷染料——罗丹明B废水的异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解方法，步骤如下：
(1)配置含有10mM乳酸和含有5mg/L罗丹明B废水的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用。再将针铁矿以终浓度0.5g/L添加到矿物盐培养基中。
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养。
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期。
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液(由氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、十二水合磷酸氢二钠3.58g/L、磷酸二氢钾0.27g/L组成组成，下同)重悬洗涤两次，制成菌悬液备用。
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解。
(6)30℃培养箱培养，定时取样，罗丹明B的浓度直接根据其在554nm的吸光值来计算。
(7)直至污染物罗丹明B降解完全。
本实施例中，因为针铁矿是固态铁，不溶且无法高温灭菌，因此采用培养基灭菌后加入。而罗丹明B是可以高温灭菌的，因此加入罗丹明B后再对培养基进行灭菌。通过图2即可发现，降解110小时后，剩余罗丹明B浓度为由5mg/L降低至1.5mg/L，降解效果明显。
实施例3
针对含难降解有机污染物——1,4-二氧六环废水的异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解方法，步骤如下：
(1)配置含有10mM乳酸和5mM柠檬酸铁的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用。
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养。
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期。
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液重悬洗涤两次，制成菌悬液备用。
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升，含终浓度5mM的1,4-二氧六环废水添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解。
(6)30℃培养箱培养，定时取样，1,4-二氧六环的浓度是由高效液相色谱法测定，其分离柱为Hypersil GOLDTM-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为95％水和5％乙腈，流速1mL/min，使用紫外可见检测器，检测波长为190nm。
(7)直至污染物1,4-二氧六环降解完全。
本实施例中，因为柠檬酸铁为水溶性铁，可以高温灭菌，因此加入柠檬酸铁后再对培养基进行灭菌。但是，1，4-二氧六环在高温下易燃，不能进行高温灭菌，因此在步骤(5)中添加。通过图3即可发现，降解100小时后，剩余1,4-二氧六环浓度为由5mM降低至2mM，降解效果明显。
本发明异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法，异化金属还原菌有氧条件下进行芬顿试剂Fe(II)的胞外循环再生，以及同时通过有氧呼吸产生芬顿试剂H2O2。Fe(Ⅱ)在胞外H2O2产生高反应活性的羟基自由基，从而对有机污染物实现高效氧化降解。这种异化金属还原菌驱动的同步生物芬顿降解方法，对有机污染物具有普遍降解能力，反应条件易控制，无需额外添加芬顿试剂，物料成本低廉，在环境有机污染物降解及异化金属还原菌的环境修复应用领域有很强的重要价值。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种异化金属还原菌自驱动同步生物芬顿降解有机污染物的方法，其特征在于，异化金属还原菌在有氧条件下进行芬顿试剂Fe(II)的胞外循环再生，同时通过有氧呼吸产生芬顿试剂H2O2，从而驱动Fenton反应持续产生高反应活性的羟基自由基·OH自由基，对有机污染物实现高效氧化降解。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将兼性好氧的异化金属还原菌和铁源加入到有机污染物中，在静置条件下培养；利用异化金属还原菌的有氧呼吸自身产生H2O2，同时通过异化金属还原途径实现细胞外Fe(Ⅲ)还原生成Fe(Ⅱ)，继而活化体系中的H2O2产生高反应活性的羟基自由基·OH，从而氧化降解体系中的有机污染物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述异化金属还原菌选自Shewanellaoneidensis MR-1野生型，购自美国模式典型物收集中心(ATCC)，菌株编号是ATCC700550TM。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机污染物选自偶氮染料、三苯甲烷染料或者多环芳烃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述铁源选自柠檬酸铁、Fe2SO4、针铁矿、水铁矿或者磁铁矿。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配置含有20mM乳酸和含有50mg/L甲基橙废水的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用；
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养；
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期；
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液重悬洗涤两次，制成菌悬液备用；
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解；
(6)30℃培养箱培养，定时取样，甲基橙的浓度直接根据其在464nm的吸光值来计算；
(7)直至污染物甲基橙降解完全。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配置含有10mM乳酸和含有5mg/L罗丹明B废水的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用；再将针铁矿以终浓度0.5g/L添加到矿物盐培养基中；
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养；
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期；
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液重悬洗涤两次，制成菌悬液备用；
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解；
(6)30℃培养箱培养，定时取样，罗丹明B的浓度直接根据其在554nm的吸光值来计算；
(7)直至污染物罗丹明B降解完全。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配置含有10mM乳酸和5mM柠檬酸铁的矿物盐培养基，使用50mL血清瓶分装30mL降解体系，用透气膜封口，灭菌备用；
(2)将保存在甘油中的Shewanella oneidensis MR-1划线于LB平板上，30℃过夜培养；
(3)用无菌牙签挑取活化好的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，于30℃和200rpm转速条件下震荡培养至对数后期；
(4)在4℃下，以5000rpm的转速离心5分钟收集菌体细胞，之后用磷酸盐缓冲溶液重悬洗涤两次，制成菌悬液备用；
(5)在超净台中，将步骤(4)所得到的菌悬液以终浓度1×107细胞/毫升，含终浓度5mM的1,4-二氧六环废水添加到装有等量培养基的血清瓶中进行污染物降解；
(6)30℃培养箱培养，定时取样，1,4-二氧六环的浓度是由高效液相色谱法测定，其分离柱为Hypersil GOLDTM-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为95％水和5％乙腈，流速1mL/min，使用紫外可见检测器，检测波长为190nm；
(7)直至污染物1,4-二氧六环降解完全。
9.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中磷酸盐缓冲溶液由氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、十二水合磷酸氢二钠3.58g/L、磷酸二氢钾0.27g/L组成。
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