CN102175659B - 基于重组大肠杆菌sos效应的水质遗传毒性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组大肠杆菌SOS效应的水质遗传毒性检测方法，包括：将重组大肠杆菌贮藏物复苏活化、培养，得大肠杆菌检测液；将待测水样与检测液接触，同时设立对照；将接触后的检测液进行离心、超声破碎等后处理，检测待测水样的荧光强度比值；采用相同的方法测得不同浓度的Cr6+溶液与检测液接触后的荧光强度比值；绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线，将水样的荧光强度比值代入，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。本发明无致病风险、培养及操作简便易行、检测灵敏度较高、成本低廉、最终结果以Cr6+当量浓度表示，可与其他生物检测方法结果相比较，适用于环境样品的遗传毒性快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及对环境污染物的遗传毒性检测的技术领域，具体为利用携带报告基因的重组大肠杆菌检测环境污染物的遗传毒性的方法。
背景技术
环境污染物的遗传毒性分析方法分为长期测试与短期测试，由于长期测试方法费时、费力，对实验动物长期维护费用昂贵，已逐渐被快速、便宜的短期筛选方法所取代。短期测试是以细胞遗传学指标来筛选化学诱变因子，通常利用植物、水生生物、哺乳动物、微生物等生物细胞监测环境诱变剂，目前发展了细菌回复突变、微核技术、姐妹染色单体交换试验、SOS反应测试、单细胞凝胶电泳等技术(张家强等，水源水中的遗传毒性检测技术研究进展.环境科学与技术[J]，2010（33）：188-192)，其中Ames测试是遗传毒性分析的最常规方法，Ames 检测法即沙门氏菌/微粒体检测法, 是最早应用于饮用水水质检测的致突变性测试方法, 其分析测试结果被认为具有权威性，多年来一直作为“三致效应”污染物检测的主要手段。 但是该方法对菌株要求严格, 测试所用时间长( 大约3d) , 试验操作比较繁杂, 要求严格的无菌操作, 同时环境中的组氨酸会干扰检测, 出现疑似阳性结果。另外, 在用Ames 方法评价饮用水的致突变性时, 往往采用定性描述,即阴性或阳性。
“SOS”修复是DNA 分子受到大范围损伤，复制又受到抑制的情况下，诱导产生的一种有错误倾向的修复功能。SOS测试系统是基于DNA 损伤物诱导SOS修复启动，通过操纵子表达下游的基因，这些基因表达的蛋白可以通过比色或是通过荧光测定。通过比较利用SOS/umu测试进行的484种化合物的毒性检测与利用Ames测试完成的274种化合物的毒性检测，结果表明基于的SOS/umu测试结果与Ames测试有90%的一致性（Reifferscheid& Heil,2005）。SOS测试具有操作简单、不需要严格的灭菌条件、实验周期短、灵敏度高、重现性好、便于定量等特点( Pal
et al., 1992)。目前国际上最常用的SOS/umu测试系统是在鼠伤寒沙门氏菌( Salmonella
typhimurium TA1535) 中导入携带umuC’-LacZ嵌合体的质粒pSK1002,构建的细菌S.typhimurium TA1535/pSK1002。这个系统在实际应用时存在以下问题：1）对氯代有机物不敏感，不利于水体，特别是饮用水中消毒副产物的检测；2）鼠伤寒沙门菌为致病菌，易传播，每年全世界有近亿人感染，部分致死，对构建的鼠伤寒沙门氏菌系统的操作存在微生物风险；3）对该系统的应用步骤相对繁琐，对β-半乳糖苷酶活性的检测还需要加入底物，如β-ONPG（邻硝基苯β-D-半乳糖苷），价格相对较贵。4）涉及知识产权，获取该重组菌系统的途径尚有困难，难以在国内行业广泛推广。
遗传毒性污染物在我国环境中分布较广、种类及数量较大，在环境污染物中有一定代表性，对人体危害较大，建立快速、有效、便利并利于推广的检测方法十分必要。
发明内容
本发明是针对现有技术的不足，提供一种操作便利、检测敏感性较高、无潜在操作风险、利于行业推广的利用大肠杆菌SOS效应检测污染物遗传毒性的方法。
大肠杆菌在受到污染物作用，导致DNA 分子受到大范围损伤、复制受到抑制时，可诱导产生有错误倾向的修复功能，通过敏感操纵子Pumu启动表达下游基因，本发明中设计下游基因表达绿色荧光蛋白，可通过检测产生的荧光获得污染物信息。
利用大肠杆菌的生理生化特征，可以提高大肠杆菌与毒物接触后SOS反应的灵敏度，降低在非测定条件下SOS反应的背景，本发明方法中使用一定浓度的葡萄糖、降低培养温度与转速可抑制大肠杆菌SOS效应背景值，采用对数前中期的菌体提高反应的灵敏度；另外改良的LB培养基可以降低检测荧光背景值；根据大肠杆菌对绿色荧光蛋白的胞内表达特征而破碎细胞可提高荧光检测灵敏度。通过受试物的Cr（Ⅵ）当量浓度换算可实现与其它遗传毒性检测方法的比较，便于各毒性检测方法的联合使用及建立毒性分级。
本发明采用重组大肠杆菌代替常用的鼠伤寒沙门氏菌，重组大肠杆菌是将大肠杆菌umuDC启动基因序列与绿色荧光蛋白基因序列连接，与质粒载体连接后导入大肠杆菌，形成携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌，即为本发明中所用的重组大肠杆菌。将绿色荧光蛋白的基因导入大肠杆菌体内后，遇到致DNA损伤物，则启动该基因表达，细胞内产生绿色荧光蛋白，可通过检测产生的荧光获得污染物信息。携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌在国际上有的实验室已有报道(Ryoichi
et al.,2001；Kostrzynska et al.,2002；Norman et al.,2006)，下列文献中也提到了制备携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌的方法，本领域技术人员可根据相关文献得到，此处非本发明的创新点，不再赘述。文献为：1.
Ryoichi Arai, Yukimasa Makita, Yoshimitsu Oda, Teruyuki Nagamune. Construction
of Green Fluorescent Protein Reporter Genes for Genotoxicity Test (SOShmu-Test)
and Improvement of Mutagen-Sensitivity. Journal of Bioscience and Bioengineering.
2001, 92( 3):301-304.
2. Magdalena Kostrzynska，Kam T. Leung,
Hung Lee, Jack T. Trevors. Green fluorescent protein-based biosensor for
detectingSOS-inducing activity of genotoxic compounds. Journal of
Microbiological Methods, 2002, 48 (1): 43–51.
3．Anders Norman, Lars Hestbjerg Hansen,
Søren J Sørensen. A flow cytometry-optimized assay using an SOS–green fluorescent protein (SOS–GFP) whole-cell biosensor for the detection of genotoxins
in complex environments.Mutation Research. 2006, 603 (1): 164–172.
本发明经过筛选，选用铬离子作为标准毒性物质，六价铬离子是世界卫生组织致癌物名单中的一种，在生活饮用水卫生标准中属于毒理指标，限值为0.05mg/L，在地表水环境质量标准中也有不同等级的限值，因此用铬离子浓度表示水质毒性结果易于统一，用其表征水质毒性也比较典型。
本发明通过重组大肠杆菌SOS效应判断水质毒性的方案具体如下：
1、一种基于重组大肠杆菌SOS效应的水质遗传毒性检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1）
制备大肠杆菌检测液
a. 将重组大肠杆菌贮藏物用改良的LB液体培养基进行培养，使其复苏活化；
b. 将步骤a得到的复苏活化液加入到LB液体培养基中进行振荡培养，培养至菌液OD值为0.3-0.5，得大肠杆菌检测液；
（2）
将富集的待测水样与大肠杆菌检测液混合接触，同时设立添加相同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作为对照；
（3）
将与待测水样接触过的大肠杆菌检测液和对照组的大肠杆菌检测液分别进行离心分离，收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤后利用超声法破碎菌体，得菌体破碎物；
（4）
将菌体破碎物离心,收集上清液，利用荧光光谱仪检测菌体的发射荧光强度，得待测水样的荧光强度比值，待测水样的荧光强度比值=与待测水样接触的菌体的发射荧光强度/对照组菌体的发射荧光强度；
（5）
用不同浓度的Cr6+溶液分别与大肠杆菌检测液接触，采用上述（2）、（3）、（4）相同的方法测得不同Cr6+溶液的荧光强度比值；
（6）
以Cr6+浓度作横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线；
（7）
将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。
本发明所用的重组大肠杆菌为携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌。所用的改良的LB液体培养基的组成为：胰化蛋白胨
10g/L, 酵母提取物 2.5g/L, NaCl 5g/L。对照组中所用的纯溶剂为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜，当与检测液接触的受试物（具体指本发明中的待测水样或Cr6+溶液）中均为水溶性的物质时，纯溶剂可以为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜，当受试物中含有水不溶性物质时，纯溶剂只能为二甲基亚砜。
上述方法中，优选的，复苏活化时，改良的LB液体培养基中添加0.3
(W/V)%的葡萄糖。
上述方法中，复苏活化时，在30-35℃，150-200rpm的转速下振荡培养16-18小时。
上述方法中，复苏活化液按照1/100的体积比加入到改良的LB液体培养基中，在35-37℃，180-250rpm的转速下振荡培养。
上述方法中，待测水样或Cr6+溶液与大肠杆菌检测液接触时，加入量为大肠杆菌检测液体积的0.1-20%。
上述方法中，待测水样与大肠杆菌检测液在35-37℃、180-250rpm的转速下充分接触1-2小时。
上述方法中，步骤（3）中，以8000-10000rpm的转速将大肠杆菌接触液离心分离2-5min；超声法破碎菌体采用破碎4~8秒、间隔4~8秒、破碎15~25次的程序进行。
上述方法中，步骤（4）中，以12000-14000rpm的转速将菌体破碎物高速离心8-10min。
本发明的有益效果如下：
1．操作对象为大肠杆菌，无致病风险，培养及操作简便易行；
2. 检测灵敏度较高，尤其是对氯代有机物敏感；
3. 检测过程不添加底物，检测成本低廉；
4. 最终结果换算成与其他生物检测方法可进行比较的受试物的Cr6+当量浓度，有利于建立联合检测方法，实现毒性分级。
5. 以Cr6+为标准毒性物质，能更加直观、准确的检测水质的遗传毒性，结果易于统一，重现性好，实现对水质毒性的定量化评价。此外，本方法能够对水质污染状况做出判断，为突发性水质污染和水厂的水处理技术提供支持，降低由于饮用水暴露导致的人类致癌风险。
附图说明
图1为实施例1中所得的荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线，其中横坐标为Cr6+浓度，纵坐标为荧光强度比值。
具体实施方式
为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例。这些实施例仅仅出于解释和说明的目的，不应该被理解为对本发明范围的限制。
水样进行浓缩富集的方法为：取待测水样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50℃下氮吹去乙酸乙酯，以一定体积的溶剂重新溶解样品至所需体积。所用溶剂为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜，当水样中均为水溶性的物质时，溶剂可以为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜，当水样中含有水不溶性物质时，溶剂只能为二甲基亚砜。
本发明的重组大肠杆菌的实现方法为现有技术，本领域技术人员可根据现有文献获得携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌，在此不再赘述，下面对本发明的关键创新点进行详细阐述。
实施例
1
基于重组大肠杆菌SOS效应的遗传毒性生物检测方法在某水厂进厂水浓缩样品（4L水浓缩为1mL）检测中的应用，步骤如下：
（1）重组大肠杆菌贮藏物复苏活化
将重组大肠杆菌贮藏物200μL接入5mL改良的LB液体培养基（胰化蛋白胨 10g/L, 酵母提取物
2.5g/L, NaCl 10g/L）。另外，加入葡萄糖占0.3%（W/V），加入氨苄霉素至终浓度50μg/mL,30℃，150rpm的转速下振荡培养16~18小时。
（2）大肠杆菌检测液前制备
将复苏活化液按照1/100的体积比接入新鲜的改良的LB液体培养基，在35-37℃，180rpm的转速下振荡培养，培养至菌液OD（520nm）为0.4，大约2小时。
（3）与受试样品接触
将受试样品100μL加入制备的1mL大肠杆菌检测液中(受试样品的体积不超过检测液的20%)，在35-37℃，180rpm的转速下振荡接触1小时，设置3个平行组。同时设置添加相同体积的纯溶剂（100μL）的大肠杆菌检测液对照组。本实施例中受试样品溶剂为二甲基亚砜。
（4）检测液后处理
将与受试物接触后的菌液及对照组的菌液通过离心（8000rpm，3min）收集菌体，以PBS缓冲液洗涤1次，利用超声波破碎仪破碎菌体，采用破碎5秒、间隔5秒、破碎25次的程序进行。
（5）荧光检测
将菌体破碎物高速离心（12000rpm，10min）,收集上清液，利用荧光光谱仪检测发射荧光强度。采用激发波长395nm，检测波长为507nm。
本实施例中检测结果如下表：
（6）荧光强度比值-Cr6+浓度标准曲线的绘制
取0.1000g重铬酸钾溶于100ml蒸馏水中配制1g/L Cr6+溶液，稀释成0.1mg/L，0.05mg/L，0.01mg/L，0.001mg/L浓度系列溶液，作为受试物，分别采用大肠杆菌检测其遗传毒性，检测步骤依次同前述步骤（1）（2）（3）（4）（5），测得荧光强度如下表：
将测得的发射荧光强度除以对照组发射荧光强度，得到荧光强度比值，以Cr6+浓度作横坐标，以对应的荧光强度比值为纵坐标，绘制荧光强度比值对 Cr6+浓度标准曲线，见图1。
（7）受试物的Cr6+当量浓度的换算
将受试样品的荧光强度比值的平均值1.97，通过大肠杆菌Cr6+的荧光强度比值- Cr6+浓度曲线（见图1），换算得到受试样品的Cr6+当量浓度，得出结论，该受试样品的遗传毒性大小相当于0.0256mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
2
采用同样的方法对实施例1中的水厂进厂水浓缩样品（4L水浓缩为1mL）进行检测，绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：复苏活化时，培养温度为33℃，转速为180rpm；制备检测液时，转速为250rpm，培养至菌液OD（520nm）为0.3；待测水样或铬离子溶液与检测液接触时,加入量为检测液体积的20%，转速为250rpm。经检测，待测水样的荧光强度比值为1.90，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0171mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
3
采用同样的方法对实施例1中的水厂进厂水浓缩样品（4L水浓缩为1mL）进行检测，绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：将与水样或铬离子溶液接触后的检测液以10000rpm的速度将大肠杆菌接触液离心分离2min，然后用超声法破碎菌体，采用破碎4秒、间隔4秒、破碎15次的程序进行，然后将菌体破碎物以14000rpm的速度高速离心8min。经检测，待测水样的荧光强度比值为2.08，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0391mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
4
取日常城市水厂的生产性试验工艺出水作为待测水样，取4L水浓缩为1mL的浓缩样品按照实施例1的方法绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：待测水样或铬离子溶液与大肠杆菌检测液在35-37℃、200rpm的转速下充分接触1-2小时，待测水样或铬离子溶液的加入量为检测液体积的5%。经检测，待测水样的荧光强度比值为1.78，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0024mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
5
取城市水厂的源水作为待测水样，取4L水浓缩为1mL的浓缩样品按照实施例1的方法绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：待测水样或铬离子溶液与大肠杆菌检测液在35-37℃、200rpm的转速下充分接触1-2小时，待测水样或铬离子溶液的加入量为检测液体积的1%。经检测，待测水样的荧光强度比值为2.33，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0697mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
6
取城市水厂的源水作为待测水样，取4L水浓缩为1mL的浓缩样品按照实施例5的方法绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：复苏活化时，培养温度为35℃，转速为220rpm；制备检测液时，转速为200rpm，培养至菌液OD（520nm）为0.5；待测水样或铬离子溶液与大肠杆菌检测液在36℃、180rpm的转速下充分接触1-2小时，待测水样或铬离子溶液的加入量为检测液体积的0.1%。经检测，待测水样的荧光强度比值为2.02，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0318mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
7
取城市水厂的源水作为待测水样，取4L水浓缩为1mL的浓缩样品按照实施例1的方法绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：复苏活化和制备检测液时所用的改良LB培养液中不加3（W/V）%的葡萄糖，待测水样或铬离子溶液与大肠杆菌检测液在36℃、180rpm的转速下充分接触1-2小时，待测水样或铬离子溶液的加入量为检测液体积的0.5%。经检测，待测水样的荧光强度比值为2.21，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.055mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
8
采用实施例3的方法对仅含有水溶性物质的某地水源水浓缩样品（1L水浓缩为1mL，浓缩时所用的溶剂为去离子水）进行检测，绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示水样的水质毒性，不同的是：将与水样或铬离子溶液接触后的检测液以9000rpm的速度将大肠杆菌接触液离心分离5min，然后用超声法破碎菌体，采用破碎8秒、间隔8秒、破碎25次的程序进行，然后将菌体破碎物以12000rpm的速度高速离心8min。经检测，待测水样的荧光强度比值为1.95，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于0.0232mg/L的Cr6+的作用效果。
实施例
9
采用同样的方法对几种有机物的水溶液进行检测，绘制绘制荧光强度比值对Cr6+浓度标准曲线，用铬离子浓度表示这些样品的毒性，不同的是：复苏活化时，培养温度为30℃，转速为180rpm；制备检测液时，转速为200rpm；待测水样或铬离子溶液与检测液接触时，转速为250rpm。检测结果见下表，带入所得的标准曲线，得出待测水样的遗传毒性大小相当于Cr6+的作用效果。
从表中结果可见，本方法对于氯代有机物较敏感。
Claims (7)
1.一种基于重组大肠杆菌SOS效应的水质遗传毒性检测方法，其特征是，所述重组大肠杆菌为携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌，包括以下步骤：
（1）制备大肠杆菌检测液
a.将重组大肠杆菌贮藏物用改良的LB液体培养基进行培养，使其复苏活化，所述改良的LB液体培养基的组成为：胰化蛋白胨 10g/L, 酵母提取物 2.5g/L, NaCl 5g/L；
b.将步骤a得到的复苏活化液加入到改良的LB液体培养基中进行振荡培养，培养至菌液OD值为0.3-0.5，得大肠杆菌检测液；
（2）将富集的待测水样与大肠杆菌检测液混合接触，同时设立添加相同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作为对照；
（3）将与待测水样接触过的大肠杆菌检测液和对照组的大肠杆菌检测液分别进行离心分离，收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤后利用超声法破碎菌体，得菌体破碎物；
（4）将菌体破碎物离心,收集上清液，利用荧光光谱仪检测菌体的发射荧光强度，得待测水样的荧光强度比值，待测水样的荧光强度比值=与待测水样接触的菌体的发射荧光强度/对照组菌体的发射荧光强度；
（5）用不同浓度的Cr6+溶液分别与大肠杆菌检测液接触，采用上述（2）、（3）、（4）相同的方法测得不同Cr6+溶液的荧光强度比值；
（6）以Cr6+浓度作横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线；
（7）将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；
其中，待测水样或Cr6+溶液与大肠杆菌检测液接触时，加入量为大肠杆菌检测液体积的0.1-20%。
2.根据权利要求1所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：复苏活化时，改良的LB液体培养基中添加0.3 (W/V)%的葡萄糖。
3.根据权利要求1或2所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：复苏活化时，在30-35℃，150-200rpm的转速下振荡培养16-18小时。
4.根据权利要求1或2所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：复苏活化液按照1/100的体积比加入到改良的LB液体培养基中，在35-37℃，180-250rpm的转速下振荡培养。
5.根据权利要求1或2所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：待测水样与大肠杆菌检测液在35-37℃、180-250rpm的转速下充分接触1-2小时。
6.根据权利要求1或2所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：步骤（3）中，以8000-10000rpm的转速将大肠杆菌接触液离心分离2-5min；超声法破碎菌体采用破碎4~8秒、间隔4~8秒、破碎15~25次的程序进行。
7.根据权利要求1或2所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是：步骤（4）中，以12000-14000rpm的转速将菌体破碎物高速离心8-10min。
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